β-興奮劑的常用檢測方法研究進展

聶 婉，伍曉紅，陳秋玲，周 柳，王琤韡

（江西科技師范大學生命科學學院，南昌 330013）

β-興奮劑的常用檢測方法研究進展

聶 婉，伍曉紅，陳秋玲，周 柳，王琤韡*

（江西科技師范大學生命科學學院，南昌 330013）

本文在簡要介紹了β-興奮劑檢測中樣品前處理技術的基礎上，總結了近幾年來國內(nèi)外檢測動物性食品中β-興奮劑的常用分析方法，指出現(xiàn)行方法的優(yōu)缺點，并提出了今后的發(fā)展趨勢。

β-興奮劑；常用檢測方法；研究進展

β-興奮劑作為一種促腎上腺受體激動劑，常被用于治療哮喘類呼吸道疾病。隨著美國首次將其投入飼料發(fā)現(xiàn)能提高瘦肉率后，被廣泛地應用在畜牧業(yè)中，常見β-興奮劑的結構式及類型如表1所示。在瘦肉精中毒事件的相繼出現(xiàn)后，β-興奮劑的不安全性逐漸顯現(xiàn)，諸多國家立法嚴厲禁止β-興奮劑在飼料和飲用水中的非法使用。本文簡要概述近幾年國內(nèi)外對β-興奮劑的樣品的前處理技術和常見檢測方法的研究進展。

表1 常見的β-興奮劑

1 樣品的前處理

分析樣品的前處理過程，可細分為4大步驟（取樣 、提取、純化和濃縮），必要情況下還需要衍生化的處理。選取樣品時，可供選擇的樣品一般分為2大類：可食用組織（血液、內(nèi)臟、肌肉等）和不可食用組織（尿液、毛發(fā)、視網(wǎng)膜等）?？墒秤媒M織中獸藥殘留量大，但處理相對繁瑣，不可食用組織中則含量較低，采集相對容易。在樣品前處理的后續(xù)步驟中，經(jīng)典的液液萃取技術，由于易引入雜質(zhì)、成本相對較高等缺點，使用頻率相對較少；分子印跡技術、免疫親和色譜技術和超臨界萃取技術，雖具有高選擇性和強特異性等優(yōu)點，但耗時耗資的缺點需要進一步完善；新興的樣品前處理方法中，由固相萃取發(fā)展來的基體分散固相萃取法，步驟更精簡、用量更少，趨向于標準化、一體化的分析模式。目前，微萃取技術與固相萃取技術憑借低成本、強選擇性和易于實現(xiàn)自動化的優(yōu)點，在β-興奮劑檢測中應用最為廣泛。

2 常見檢測方法研究進展

2．1 免疫分析技術

2.1.1 酶聯(lián)免疫法（ELISA）

酶聯(lián)免疫法基于競爭性酶反應原理，根據(jù)顯示結果的顏色深度來分析待測物的含量，此方法常分為抗體的間接法、抗原的競爭法和抗原的雙抗體夾心法。此方法作為較為成熟的檢測方法，不需要昂貴的儀器設備，靈敏度高、特異性強且樣品前處理相對簡單，但因抗體理化性質(zhì)不穩(wěn)定，故具有較高的假陽性，且制備和純化過程相對復雜，現(xiàn)常被用作現(xiàn)場的大批量初篩。胡霏等（2013）對借助方陣滴定ELISA法的抗體制備過程進行了優(yōu)化，最后制成的酶標板反應時間僅需15分鐘，極大提高了檢測效率。王俊平等（2011）借助混合酸酐法建立的沙丁胺醇直接酶聯(lián)免疫法，實際檢測過程中沙丁胺醇與結構類似物幾乎沒有交叉反應，檢測限也遠低于國家殘留。出于對交叉反應的考慮，在執(zhí)法過程中如使用鹽酸克倫特羅檢測卡后顯示為陽性，但在最后的氣相色譜-質(zhì)譜法確證又為陰性時，必須檢測沙丁胺醇的存在。

2.1.2 膠體金免疫層析法（GICA）

膠體金免疫層析法是將膠體金作為示蹤標志物的新型免疫標記技術，僅需肉眼觀察2條檢測限的顏色變化來判斷檢測結果，快速簡便且特異性強，多用于現(xiàn)場的快速檢測和大通量初篩。膠體金的質(zhì)量對實驗結果有很大影響，當膠體金pH接近且不低于蛋白質(zhì)的等電點時，表面的吸附量最大，抗原抗體更易形成緊密的結合物。王森 等（2012）優(yōu)化金標抗體、羊抗鼠IgG和人工結合抗原制劑，成功研發(fā)出了瘦肉精的三合一多功能膠體金快速檢測板，該板的檢出限低，準確率高，適合瘦肉精的多殘留檢測。吳巧麗等（2012）借助沙丁胺醇-BSA 抗原和兔抗沙丁胺醇多克隆抗體-月炙體金標記物，對GICA法中的檢測試劑的制備進行了優(yōu)化，最低限濃度為2 ng/mL，檢測時長縮短到3 min，且與鹽酸克倫特羅的交叉反應率僅為2．67%。

2．2 色譜及色譜質(zhì)譜聯(lián)用法

2.2.1 高效液相色譜法（HPLC）

高效液相色譜法作為半確證性的定量檢測法，適用于強極性和熱不穩(wěn)定的β-興奮劑及其代謝產(chǎn)物，假陽性率低、專屬性與選擇性強，分離度和檢測精度高，且可獲得有關β－興奮劑分子結構方面的信息。但HPLC法的樣品前處理過程繁瑣，除不進行試樣衍生化外，其他步驟如提取、純化和定容都與氣相色譜質(zhì)譜法相同。在對畜產(chǎn)品的檢測過程中，為了實現(xiàn)達到分析、過程的自動化，提升反應的靈敏度，HPLC法常與柱前提取、純化、柱后熒光衍生化反應和質(zhì)譜（MS）等系統(tǒng)連用。王鶴佳等（2014）依靠超高效液相色譜/四級桿-飛行時間質(zhì)譜（UPLC/Q-TOF MS）技術，分析和判斷出鹽酸克倫特羅在豬尿中的代謝產(chǎn)物，并由此推測鹽酸克倫特羅在豬體內(nèi)的主要代謝途徑。孟文瑛等（2012）為測定鹽酸克倫特羅研發(fā)了快捷精準的固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 ( SPEUPLC-MS/MS) 法，該方法最低檢出限為0．05 μg /kg，并在0．25～50 μg /kg的范圍內(nèi)擁有良好的線性關系。

2.2.2 氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）

氣象色譜-質(zhì)譜法作為被國際上定為β-興奮劑檢測的最終確證方法，在靈敏度方面較HPLC更高，對于假陽性率而言較ELISA更低。在樣品多殘留的檢測情況下，可對某一殘留物進行定性、定量分析，且具有較高檢測極限。但因樣品前處理時間長、需要衍生化處理，操作技術要求高，儀器昂貴等因素，近幾年對此研究的熱點為提高該檢測方法的速度和靈敏度。田苗（2010）在對豬組織中β-興奮劑的檢測時，借助陽離子交換柱的凈化作用，將雙三氟乙酰胺-三甲基氯硅烷作為衍生劑，有效降低檢出限至1 μg /kg，且具有良好的線性相關。Wang等（2006）建立了能夠檢測豬肝臟和豬尿中殘留萊克多巴胺的免疫親和色譜柱萃取IAC-GCMS法，檢測限為0．5 ng/mL。由于需要復雜的衍生化，且處理試劑大多具有較強的毒性，現(xiàn)越來越傾向于使用液相色譜-質(zhì)譜法作為定量分析的檢測方法。

2.2.3 液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS）

液相色譜-質(zhì)譜法與氣相色譜-質(zhì)譜法相似，除了不需要衍生化外，試樣提取和純化等前處理步驟是統(tǒng)一的。實驗室中可先對樣品進行LC-MS測定，再對樣品進行衍生化處理來進行GC-MS測定。該方法適用于大分子量、難揮發(fā)、高沸點、極性與極不穩(wěn)定的化合物，目前主要用于檢測鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺等常見β－興奮劑。在此方法的基礎上，又有人將具有高分離能力的液相色譜和能有效提供分子結構信息的質(zhì)譜聯(lián)合起來，研發(fā)出了液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術（LC-MS/MS），不僅具有靈敏度高、選擇性強等優(yōu)勢，還能在準確檢測殘留濃度之余獲得豐富有效的化合物結構信息。Wu 等（2014）借助LC-MS方法，結合萊克多巴胺在豬體內(nèi)的藥代動力學研究，證實在停止給藥24 d后，豬毛中仍有部分克倫特羅的殘留。汪輝等（2015）根據(jù)β-興奮劑的酸堿性，于酸性條件下對試樣進行酶解和提取，最后通過LC-MS法分析的檢測限為0．004 ng/mL 。

3 小結

隨著現(xiàn)有檢測方法的不斷改進，β-興奮劑的檢測技術日益成熟，常見檢測方法在現(xiàn)場大批量初篩和最后確證方面都發(fā)揮著不容小覷的作用。今后的改進和研發(fā)可朝著更高效、實惠的多殘留同時檢測方向進行。

略。

2015-09-08)

第九屆本科生創(chuàng)業(yè)、科研基金項目（20150901008）；江西省農(nóng)牧漁業(yè)科研項目

聶婉（1995-），女，本科生，專業(yè)：生物科學。E-mail：995237428@qq.com。

*通訊作者，王琤韋華（1982-），男，講師，博士，研究方向：動物營養(yǎng)。E-mail：616051233@qq.com。