人重組內(nèi)皮抑素聯(lián)合化療對(duì)人肝癌HepG2裸小鼠移植瘤作用觀察

董海鷹 王知非?

人重組內(nèi)皮抑素聯(lián)合化療對(duì)人肝癌HepG2裸小鼠移植瘤作用觀察

董海鷹 王知非?

目的 研究人重組內(nèi)皮抑素（內(nèi)皮抑素）對(duì)人肝癌單獨(dú)及聯(lián)合化療的作用。方法 應(yīng)用內(nèi)皮抑素或者聯(lián)合氟尿嘧啶（5-Fu）作用于Hepg-2肝癌裸小鼠移植瘤，在體外用cck-8檢測(cè)及流式細(xì)胞技術(shù)研究?jī)?nèi)皮抑素對(duì)HepG-2作用，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)組移植瘤小鼠隨機(jī)分成A、B、C、D四組，每組5只。A組為陰性對(duì)照組，B組為單獨(dú)內(nèi)皮抑素治療組，C組為內(nèi)皮抑素聯(lián)合5-Fu化療組，D組為單獨(dú)5-Fu化療組。測(cè)量腫瘤體積1次/3d，給藥7d后比較各組抑瘤率，腫瘤病理HE染色，免疫組化檢測(cè)微血管計(jì)數(shù)（MVD）及VEGF（血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子）表達(dá)情況。結(jié)果 cck-8檢驗(yàn)結(jié)果顯示藥物作用24h，單獨(dú)內(nèi)皮抑素僅在100μg/ml的劑量時(shí)對(duì)HepG-2細(xì)胞在體外有輕度殺傷作用，細(xì)胞死亡率20.7%，其余濃度無(wú)明顯殺傷作用；作用48h，內(nèi)皮抑素在50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml對(duì)HepG-2有一定殺傷作用，細(xì)胞死亡率分別為20.8%，46.3%，15.8%；在各時(shí)間段和濃度的內(nèi)皮抑素對(duì)HepG-2殺傷作用顯著小于相應(yīng)內(nèi)皮抑素+5-Fu組（P＜0.05）；流式細(xì)胞技術(shù)檢驗(yàn)100μg/ml濃度內(nèi)皮抑素誘導(dǎo)HepG-2凋亡的作用，結(jié)果顯示內(nèi)皮抑素100μg/ml作用于HepG-2細(xì)胞24h及48h，細(xì)胞凋亡率分別為26.4%、21.1%（對(duì)照組為5.1%）；內(nèi)皮抑素100μg/ml在48h對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞有誘導(dǎo)凋亡作用，凋亡率為19.5%（對(duì)照組為11.7%）。聯(lián)合內(nèi)皮抑素和5-Fu化療，對(duì)于人肝癌HepG-2細(xì)胞裸鼠移植瘤抑瘤率高于單獨(dú)內(nèi)皮抑素和單獨(dú)5-Fu化療（P＜0.05）。結(jié)論 內(nèi)皮抑素對(duì)人肝癌HepG-2細(xì)胞有一定的殺傷作用，但并非在所有濃度和作用時(shí)段，對(duì)人肝癌HepG-2細(xì)胞及臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞有凋亡誘導(dǎo)作用，聯(lián)合內(nèi)皮抑素和5-Fu化療對(duì)于人肝癌HepG-2細(xì)胞裸鼠移植瘤抑瘤率顯著高于單獨(dú)內(nèi)皮抑素和單獨(dú)5-Fu化療，兩種藥物有協(xié)同作用。單獨(dú)內(nèi)皮抑素治療對(duì)于人肝癌HepG-2細(xì)胞裸鼠移植瘤有一定抑瘤作用，內(nèi)皮抑素可以減少HepG-2人肝癌裸鼠皮下移植瘤腫瘤微血管密度及VEGF表達(dá)。

內(nèi)皮抑素 HepG-2 異位移植瘤模型 抗血管生成

腫瘤抗血管生成目前已經(jīng)成為抗腫瘤研究的熱點(diǎn)，包括較多新的理論出現(xiàn)，如腫瘤血管正常化窗口期等。人重組內(nèi)皮抑素（恩度）是抗腫瘤血管生成的新藥，已經(jīng)推薦為 NCCN 肺癌臨床實(shí)踐指南中國(guó)版非小細(xì)胞肺癌一線治療方案，對(duì)于其他腫瘤的治療也正在臨床和臨床前嘗試。但抗腫瘤血管治療藥物，在腫瘤血管正常化理論根據(jù)下，在臨床如何與傳統(tǒng)抗腫瘤藥物聯(lián)合應(yīng)用，尚無(wú)特別的基于該理論的實(shí)踐。肝細(xì)胞癌屬于多血管實(shí)體瘤,其發(fā)生發(fā)展過(guò)程與腫瘤血管生成密切相關(guān)。本試驗(yàn)擬通過(guò)在小鼠肝癌移植瘤模型上聯(lián)合應(yīng)用內(nèi)皮抑素及經(jīng)典化療藥物，觀察抗腫瘤效果，以揭示對(duì)于肝癌，抗血管內(nèi)皮生成治療如何和臨床常規(guī)化療藥物聯(lián)合或者協(xié)同作用。報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞系和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 細(xì)胞株：HEPG2人肝癌細(xì)胞株，本實(shí)驗(yàn)室凍存。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：4周齡的Balb/c- nu/nu裸鼠，雄性26只，體重16～18g，平均17g。購(gòu)于浙江省中醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)于浙江大學(xué)加州國(guó)際納米技術(shù)研究院分子影像平臺(tái)，SPF級(jí)凈化馮氏獨(dú)立送風(fēng)隔離籠具籠盒內(nèi)。所有操作均在飼養(yǎng)室的AIRTEH超凈臺(tái)無(wú)菌條件下完成。

1.2 試劑 （1）DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，含 100IU /ml青霉素，100μg/ml鏈霉素。（2）胰酶消化液：購(gòu)于華美生物工程公司，4℃儲(chǔ)存。（3）G418購(gòu)于Clontech公司。（4）人重組內(nèi)皮抑素注射液（每支150mg/ml）：于-4℃保存，使用時(shí)加入生理鹽水稀釋或加入完全培養(yǎng)基至所需濃度。（5）單克隆抗體CD31：丹麥DAKO公司；VEGF抗體 ，購(gòu)于NeoMarkers公司，免疫組化檢測(cè)試劑盒，購(gòu)于DAKO公司。

1.3 體外實(shí)驗(yàn) （1） 選取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的HepG-2細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液濃度5×107/ml。在接種超凈臺(tái)內(nèi)，裸鼠背部皮膚75%酒精消毒，接種腫瘤細(xì)胞0.2ml/只。接種后第7天，隨機(jī)分組：空白對(duì)照組（A組），生理鹽水0.5ml/d；內(nèi)皮抑素單獨(dú)治療組（B組），內(nèi)皮抑素1.5mg/（kg·d），加生理鹽水稀釋至0.25ml/只；內(nèi)皮抑素和5-Fu聯(lián)合治療組（C組），內(nèi)皮抑素1.5mg/（kg·d），加生理鹽水稀釋至0.25ml/只，同時(shí)給予5-Fu［（20mg/（kg·d）］，加生理鹽水稀釋至0.25ml/只，每次注射前將兩藥抽于同一注射器混勻；單獨(dú)5-Fu治療組（D組）［20mg/（kg·d）］，加生理鹽水稀釋至0.25ml/只。均為腹腔內(nèi)注射，1次/d，連續(xù)7d。每日觀察各組裸鼠的精神、飲食、活動(dòng)、大小便等一般情況。用藥前后稱取體重。每日用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤結(jié)節(jié)的最大長(zhǎng)度（a）、寬度（b） 和高度（c），腫瘤大?。ㄩL(zhǎng)×寬），腫瘤體積計(jì)算公式V=W2×L/2，式中W為寬度，L為長(zhǎng)度。末次給藥后24h將裸鼠最后一次活體成像后脫臼處死，解剖剝離盡量剝離其表面包膜，切除心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟組織，分別稱重（臟器系數(shù)=臟器質(zhì)量/裸小鼠質(zhì)量） ，肉眼觀察及病理組織學(xué)切片觀察臟器及腫瘤病理學(xué)變化，并稱瘤重，根據(jù)以下公式計(jì)算腫瘤抑制率: 腫瘤抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組平均瘤重/對(duì)照組平均瘤重） ×100%。剖開(kāi)胸腔及腹腔在活體熒光成像儀下觀察有無(wú)臟器轉(zhuǎn)移。（2）將移植瘤組織及心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟組織常規(guī)迅速采用10%中性福爾馬林液固定、脫水、石蠟包埋，制備連續(xù)切片，組織病理包括腫瘤組織HE染色，免疫組化檢測(cè)微血管計(jì)數(shù)（MVD）、VEGF等表達(dá)情況。CD31標(biāo)記腫瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞，MVD的測(cè)量采用Weidner法：每張切片在100倍視野下尋找血管高密度區(qū)，再在高倍光鏡下計(jì)數(shù)微血管數(shù)目，每一個(gè)染成棕黃色的可與周圍血管、腫瘤細(xì)胞和其它結(jié)締組織分開(kāi)的內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇作為一個(gè)微血管，血管腔的有無(wú)不作為判斷血管的標(biāo)準(zhǔn)，只要結(jié)構(gòu)不相連，其分支結(jié)構(gòu)亦作為一個(gè)血管計(jì)數(shù)，分別計(jì)數(shù)5個(gè)視野，取均數(shù)表示MVD。VEGF計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：按著色細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分為：細(xì)胞呈陰性染色，無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為-；染色弱，陽(yáng)性細(xì)胞呈淡黃色，陽(yáng)性細(xì)胞＜25%為+；染色中等，陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色，陽(yáng)性細(xì)胞25%～50%為++；染色強(qiáng)，陽(yáng)性細(xì)胞呈棕褐色，陽(yáng)性細(xì)胞＞50%為+++。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 各組裸鼠用藥前體重?zé)o差異，用藥后體重均有增加，治療結(jié)束后各組裸鼠體重變化無(wú)差異（P＞0.05）。給藥期間，B組裸鼠一般情況（包括精神、活動(dòng)、進(jìn)食等）同A組，C組和D組活動(dòng)不如A組及B組，但是精神尚可，無(wú)明顯萎靡，對(duì)外界刺激反應(yīng)活躍，四肢無(wú)消瘦，未見(jiàn)出現(xiàn)腹瀉反應(yīng)，且裸鼠全部存活至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

2.2 各組移植瘤移植瘤體積變化 見(jiàn)表1。

表1 各組不同時(shí)間腫瘤體積對(duì)比［cm3，（x±s）］

2.3 各組裸小鼠治療前后小鼠質(zhì)量、腫瘤質(zhì)量及抑瘤率比較 見(jiàn)表2。

表2 各組裸小鼠治療前后小鼠質(zhì)量、腫瘤質(zhì)量及抑瘤率比較［g，（x±s）］

2.4 移植瘤大體觀察 腫瘤多為圓形或橢圓形，呈分葉狀，表面有結(jié)節(jié)突起，腫瘤與周圍肌肉及皮膚有粘連，呈淡紅色，質(zhì)脆，有的中心部分壞死。

2.5 病理切片HE染色光鏡下觀察 腫瘤細(xì)胞體積大，腫瘤細(xì)胞核深染，核大，常見(jiàn)有切跡、凹陷，核形不規(guī)則，核染色質(zhì)比例較大。瘤細(xì)胞或散在分布，或形成癌巢，成團(tuán)分布。腫瘤周邊有較多淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。符合腫瘤組織形態(tài)。

2.6 主要臟器變化 治療后各組裸小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟的臟器系數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。肉眼觀察，各組動(dòng)物各臟器均無(wú)明顯異常。病理組織學(xué)切片觀察結(jié)果表明，各組均未出現(xiàn)明顯病理學(xué)改變。

2.7 免疫組化檢查結(jié)果 （1）MVD：A:（15.2±3.1）［高倍視野顯微鏡（HPF）］; B:（6.7±1.3）（HPF）; C:（6.1±1.5）（HPF）; D:（12±2.3）（HPF）。與A組比較，B、C、D組MVD均顯著減少（P＜0.05）；C組和B組MVD均顯著少于D組（P＜0.05）；C組和B組MVD無(wú)顯著差別（P＞0.05）。（2）VEGF 檢測(cè)按著色細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分結(jié)果：A組:+++；B組: ++；C組:+-++；D組: ++。與A組比較，B、C、D組VEGF表達(dá)顯著減少（P＜0.05）；B、C、D組VEGF表達(dá)結(jié)果無(wú)明顯差異（P＞0.05）。

3 討論

文獻(xiàn)報(bào)道靶向于VEGF的藥物可直接作用于異常表達(dá)VEGFR并部分依賴于VEGF生存的腫瘤細(xì)胞［1］，但內(nèi)皮抑素對(duì)于肝癌裸鼠移植瘤的治療選擇報(bào)道較少，因而參照其他文獻(xiàn)中［2，3］類似治療的劑量選擇1.5mg/（kg·d），另外結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，根據(jù)人和小鼠在用藥劑量上的比例系數(shù)（約0.11）結(jié)合本實(shí)驗(yàn)給藥途徑得出該劑量。本實(shí)驗(yàn)選擇5-Fu作為聯(lián)合治療用藥，因內(nèi)皮抑素聯(lián)合5-Fu具有協(xié)同作用，可以抑制大腸癌的肝轉(zhuǎn)移［4］，本實(shí)驗(yàn)采取腹腔注射給藥方式［5］。但通過(guò)腹腔內(nèi)種植的滲透壓力泵持續(xù)腹腔注入內(nèi)皮抑素可以低于一次性注射5倍的劑量獲得更好的效果，進(jìn)一步用人胰腺癌模型證實(shí)，該方法和腹腔注射1次/d比較，明顯提高腫瘤抑瘤率，可以小于后者8倍的劑量達(dá)到同樣抑瘤率 ，并且在兩個(gè)國(guó)家已經(jīng)開(kāi)始臨床試驗(yàn)［6］。但本實(shí)驗(yàn)較大程度上是對(duì)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷囊粋€(gè)嘗試性應(yīng)用，所以未選用該給藥方法。

本實(shí)驗(yàn)中，C組和B組MVD均顯著少于D組；C組和B組MVD無(wú)顯著差別。說(shuō)明雖然內(nèi)皮抑素聯(lián)合5-Fu能顯著提高抑瘤率，但是對(duì)于減少M(fèi)VD未見(jiàn)明顯協(xié)同作用；內(nèi)皮抑素單獨(dú)應(yīng)用可明顯減少腫瘤MVD，與聯(lián)合5-Fu化療組無(wú)明顯差別，盡管單獨(dú)化療對(duì)減少M(fèi)VD有一定作用。單獨(dú)給予5-Fu亦引起一定的MVD減少，但是C組的MVD與B組比較無(wú)顯著差異，而C組抑瘤率明顯高于B組，提示在相同的微血管密度減少情況下，結(jié)合化療會(huì)提高抑瘤率。另外相對(duì)于D組，C組MVD明顯減少，而且抑瘤率明顯提高，采用兩藥相互作用系數(shù)（CDI）評(píng)價(jià)兩藥相互作用性質(zhì)，聯(lián)合用藥組統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，CDI=0.9261，說(shuō)明內(nèi)皮抑素和5-Fu兩種藥物有協(xié)同作用，這種協(xié)同作用機(jī)制可通過(guò)抗腫瘤血管生成中腫瘤血管正?；碚摻忉專?］，在此期間，腫瘤組織血流量暫時(shí)增大、血流分布更加均勻、合理，可增加化療藥物和細(xì)胞毒性藥物的傳遞效率，增進(jìn)化學(xué)治療的效果；而隨之而來(lái)的血氧含量的增高可明顯提高腫瘤組織細(xì)胞對(duì)放療的敏感性。對(duì)于內(nèi)皮抑素是否亦和Avastin一樣可誘導(dǎo)腫瘤血管正?；?，目前文獻(xiàn)未見(jiàn)報(bào)道，理論上說(shuō)，任何恢復(fù)促血管生成和抗血管生成分子平衡的治療均可誘導(dǎo)血管正?；?］，實(shí)際上，包括減少對(duì)激素依賴的腫瘤的激素水平因可降低VEGF的表達(dá)亦會(huì)導(dǎo)致血管正?；?。但內(nèi)皮抑素和血管靶向藥物是否有此效果目前還未見(jiàn)報(bào)道［9］，因此本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示的協(xié)同作用可能與此有關(guān)。

治療后各組裸小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟的臟器系數(shù)無(wú)顯著性差異（ P＞ 0.05） 。肉眼觀察，各組動(dòng)物各臟器均無(wú)明顯異常;病理組織學(xué)切片觀察結(jié)果表明，各組均未出現(xiàn)明顯病理學(xué)改變。說(shuō)明內(nèi)皮抑素及內(nèi)皮抑素聯(lián)合5-Fu治療對(duì)裸鼠主要臟器無(wú)明顯損害。在免疫組化方面，除檢測(cè)MVD外，還檢測(cè)了VEGF在治療后的表達(dá)，內(nèi)皮抑素可通過(guò)阻斷VEGF受體KDR/FIK一1酪氨酸的自磷酸化和一些蛋白激酶的激活［有絲分裂原激活蛋白激酶（MAPK）、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）］，阻斷VEGF介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑 。內(nèi)皮抑素亦能通過(guò)下調(diào)腫瘤細(xì)胞VEGF mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)而影響內(nèi)皮細(xì)胞上一氧化氮合成酶的活性，減少VEGF誘導(dǎo)的一氧化氮的生成，從而抑制了VEGF介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管的形成 。VEGF在肝癌患者體內(nèi)呈過(guò)高表達(dá)，與肝癌的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及治療密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與A組比較，B、C、D組VEGF表達(dá)顯著減少（P＜0.05）；與內(nèi)皮抑素下調(diào)內(nèi)源性VEGF的表達(dá)有關(guān)。

1 Napoleone F,Robert S． Kerbel Angiogenesis as a therapeutic target．Nature 2005,438(7070):968～974．

2 Horsman MR, Siemann DW．Pathophysiologic Effects of Vascular-Targeting Agents and the Implications for Combination with Conventional Therapies．Cancer Res,2006,66(24):11520～11539．

3 Roy S． Herbst, Anh Tuyet Leel, Hai T． Tranl ,et al． Clinical studies of angiogenesis inhibitors: The university of texas md anderson center trial of human endostatin ． Curr Oncol Rep, 2002,3(2):131～140．

4 周志偉,萬(wàn)德森,王國(guó)強(qiáng),等．血管生成抑制劑YH-16聯(lián)合氟尿嘧啶抑制結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的研究．中華胃腸外科雜志, 2006, 9(2):161～164．

5 Citrin Deborah,Scott Tamalee,Sproull Mary,et al． In vivo tumor imaging using a near-infrared-labeled endostatin molecule． Int J Radiat Oncol Biol Phys,2004,58(2):536～541．

6 Oliver Kisker,Christian M,Becker,et al．Pirie-Shepherd,and Judah Folkman Continuous Administration of Endostatin by Intraperitoneally Implanted Osmotic Pump Improves the Efficacy and Potency of Therapy in a Mouse Xenograft Tumor Model． Cancer Res,2001,61(20):7669-74

7 Rakesh K． Jain． Normalization of tumor vasculature: an emerging concept in antiangiogenic therapy． Scince,2005,307(5706):58．

8 Frank Winkler,Sergey V． Kozin,Ricky T． Tong,et al．Kinetics of vascular normalization by VEGFR2 blockade governs brain tumor response to radiation: Role of oxygenation, angiopoietin-1,and matrix metalloproteinases． Cancer Cell,2004,6(6):553～563．

9 Chen C,Liu Y,Xu J． C086, a novel analog of curcumin, induces growth inhibition and down-regulation of NFκB in colon cancer cells andxenograft tumors．Cancer Biol Ther,2011,12(9):797～807．

Objective To evaluate endostatine 's anti-tumor effects combined with chemothery using HCC HepG-2 tumor xenograft mouse model. Methods HepG-2 cells were transplanted subcutaneously to make a xenograft tumor model ，tumor's growth was observed in vivo. 20 mice of 4 weeks age was made into HepG-2 tumor model and were divided into 4 groups as group A，B，C，D ，A as control with normal sodium ，B with endostatine，C with endostatine combind with 5-Fu，D with 5-Fu，body weight and tumor size were measured every 3 days to observe the change of xenografted tumor. Results Endostatine had a cytoxic effect on HepG-2 cells at 24h（cell death rate 20.7%）with 100μg/ml concentration and 48h at 50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml concentration（cell death rate 20.8%，46.3%，15.8%）; at 100μg/ml ，endostatine induced apoptosis in HepG-2 after 24h and 48h，apoptosis rate was 19.5%（11.7% as control）. Endostatine had the highest tumor inhabit rate （TIF） when combined with 5-Fu chemothery compared with either endostatine alone or 5-Fu alone （P＞0.05），endostatine alone had a certain tumor inhibitoy effects when treating tumor alone . Microvessle density （MVD） and expression of VEGF were reduce after endostatine treatment either alone or combine with 5-Fu. Conclusions Endostatine has cytoxic effects on HepG-2 cells in vitro only at certain dose and time period ，it can induce apoptosis in both HepG-2 cells and human human umbilical vein cells . Combining with 5-Fu chemothery can have a synergistic effect on TIF compared with treating with any agent alone .Endostatine reduces tumor's MVD and expression of VEGF.

Endostatin HepG-2 Xenograft tumor model Antiangiogenesis

310014 浙江省人民醫(yī)院

*通訊作者