構(gòu)樹葉中黃酮提取分離工藝的優(yōu)化

楚芳冰，吳小燕，丁來欣

(1．北京林業(yè)大學材料學院，北京 100083;2．北京林業(yè)大學理學院，北京 100083)

構(gòu)樹［Broussonetia papyrifera(L．)Vetn．］原名楮，為灌木類桑科植物，其葉、莖、根、皮、果實均可入藥，在中國歷版藥典中均有收藏［1］。構(gòu)樹耐瘠薄、干冷、濕熱，根系發(fā)達生長迅速，適應(yīng)于各種類型的土壤，病蟲害少，在我國分布廣、資源豐富。構(gòu)樹除了有藥用價值外，其果實營養(yǎng)豐富可以做果醋［2］，種子含有大量不飽和脂肪酸，可開發(fā)利用［3］;構(gòu)樹葉亦稱為楮桃葉，蛋白質(zhì)含量高，經(jīng)提取純化后能廣泛用于食品加工，但目前只有少量用于豬飼料［4－5］。

構(gòu)樹葉性甘、涼，治療吐血、外傷出血、水腫、痢疾、癬瘡等［1］，近代藥理研究證明構(gòu)樹葉具有抗菌抑菌、降血脂、降血壓、抗氧化、抑制腫瘤的作用，可保護肝臟，防治心血管疾病、治療皮膚病等［6－9］。目前，對構(gòu)樹的化學成分研究發(fā)現(xiàn)其中含有大量黃酮類物質(zhì)，是主要活性成分［10－13］，其中構(gòu)樹葉中黃酮類物質(zhì)含量較高，主要有牡荊素、大波斯菊、槲皮素、芹菜素、木犀草素、甘草素等［10－11，14］，極具開發(fā)價值。但目前對構(gòu)樹葉中黃酮物質(zhì)的提取工藝研究較少［15－16］，對提取物進行純化的工藝研究極少，對構(gòu)樹葉中黃酮的含量測定結(jié)果各不相同［7，17－18］，因此研究有效提取并分離純化構(gòu)樹葉中的黃酮物質(zhì)，充分利用這一廉價易得的天然資源，對于開發(fā)構(gòu)樹葉在醫(yī)藥和保健品方面的應(yīng)用有重要意義。該研究采用超聲波輔助溶劑法提取構(gòu)樹葉中的黃酮，用單因素試驗和正交試驗法優(yōu)化提取工藝，采用萃取法分離純化提取物，以期為有效地開發(fā)利用構(gòu)樹葉中黃酮提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料 構(gòu)樹［Broussonetia papyrifera(L．)Vetn．］葉，于2013年9月底采于北京市海淀區(qū)，在室內(nèi)自然干燥至恒重后，于冰箱冷凍層保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2 試劑 蘆丁對照品(國藥集團化學試劑有限公司);95%乙醇、石油醚、鹽酸、乙酸乙酯、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉，上述試劑均為國產(chǎn)分析純。

1．3 儀器與設(shè)備 SPECORD 210PLU8紫外可見分光光度計(德國耶拿);RE-200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海凱美特功能陶瓷公司);KQ-500B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);FA2004B電子天平(上海越平科學儀器有限公司);FW100高速萬能粉碎機(天津泰斯特儀器有限公司)。

1．4 方法

1．4．1 對照品溶液的制備和標準曲線制作。準確稱取蘆丁對照品0．020 8 g，用60%乙醇完全溶解后轉(zhuǎn)入100 ml容量瓶中，用60%乙醇定容，配成0．208 mg/ml的蘆丁標準溶液。分別吸取蘆丁標準液 0、1．0、2．0、3．0、4．0、5．0 ml于 10 ml容量瓶中，分別加入5%NaNO2溶液0．5 ml，放置 6 min后，加入 10%Al(NO3)3溶液 0．5 ml，搖勻后放置 6 min，再加入4%NaOH溶液4 ml，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻后放置12 min，配制不同濃度的絡(luò)合物［18］。以不加蘆丁的溶液做空白，進行紫外可見光譜掃描，確定蘆丁最大吸收波長。在最大吸收波長處分別測定不同濃度蘆丁的吸光度，以吸光度為縱坐標(y)、蘆丁濃度為橫坐標(x)作回歸方程繪制標準曲線。

1．4．2 樣品溶液的制備和黃酮含量的測定。取干燥的構(gòu)樹葉樣品，用粉碎機粉碎成粉末狀，每次取3 g粉碎的干構(gòu)樹葉放入錐形瓶中，加入一定質(zhì)量比的乙醇溶液，采用不同的工藝條件在超聲波清洗器中超聲提?。?9］，進行工藝條件選擇，抽濾后得到提取液，用紫外分光光度法測定提取液中黃酮含量［16－17］。每個工藝條件平行做2個樣，最后取結(jié)果的平均值。用薄層色譜(TLC)分離鑒定提取液，以蘆丁作為黃酮標準物對照，固定相為硅膠GF254，展開劑為正丁醇∶冰酸酸∶水=4∶1∶1，紫外燈下檢測分離結(jié)果，結(jié)果作為選擇提取工藝條件以及純化條件的依據(jù)之一。

1．4．3 單因素試驗。

1．4．3．1 乙醇濃度對提取黃酮的影響。根據(jù)文獻［16］，乙醇對黃酮的提取率較高，所以分別以30%、40%、50%、60%、70%乙醇為溶劑，構(gòu)樹葉與乙醇的料液比為1∶15(g∶ml)，溫度40℃，超聲提取15 min，抽濾除去濾渣，量取濾液體積，再將濾液離心分離，取 0．3 ml轉(zhuǎn)入10 ml容量瓶中，按照“1．4．1”的方法加入顯色劑，用 60%乙醇定容，搖勻后在已知最大吸收波長下分別測定黃酮的吸光度。

1．4．3．2 不同提取溫度對提取黃酮的影響。以50%乙醇為溶劑，料液比為 1∶15(g∶ml)，提取溫度分別為 40、50、60、70、80 ℃，提取時間為 15 min，然后按照“1．4．3．1”的方法處理并分別測定吸光度。

1．4．3．3 不同料液比對提取黃酮的影響。以50%乙醇為溶劑，按料液比分別為 1∶8、1∶12、1∶16、1∶20、1∶24、1∶30(g∶ml)，提取溫度為40℃，超聲提取時間為15 min。抽濾除去濾渣，濾液再進行離心分離，用50%乙醇分別稀釋濾液至相同體積，混勻后取 0．3 ml轉(zhuǎn)入 10 ml容量瓶，按照“1．4．3．1”的方法分別測定吸光度。

1．4．3．4 不同提取時間對提取黃酮的影響。以50%乙醇為溶劑，按照料液比為1∶12(g∶ml)，提取溫度為40℃，提取時間分別為 10、25、40、55、70 min，抽濾除去濾渣，后處理及測定步驟同“1．4．3．1”。

1．4．4 正交試驗。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取乙醇濃度、料液比、提取時間、提取溫度4個因素為主要考察因素，以黃酮提取率作為考察指標，采用L9(34)表進行正交試驗并進行結(jié)果分析。

1．4．5 樣品黃酮提取率的計算。根據(jù)標準曲線制備項下方法測定得樣品溶液吸光度值，由標準曲線得到樣品溶液質(zhì)量濃度，按下式計算構(gòu)樹葉樣品黃酮的提取率:黃酮類化合物提取率(%)=C· V·10－3/W，式中，C為樣品溶液質(zhì)量濃度(mg/ml);V為樣品溶液體積(ml);W為樣品質(zhì)量(g)。

1．4．6 樣品的分離純化與工藝流程。根據(jù)正交試驗結(jié)果，采用最佳提取工藝條件提取干構(gòu)樹葉中的黃酮，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑，蒸發(fā)至原體積的一半左右，將濃縮液用等量石油醚萃取，除去葉綠素和脂溶性雜質(zhì)，得到水相，在水相中加入6 mol/L的鹽酸處理，使之pH在2左右，然后用等量乙酸乙酯萃取2次［20－21］，分離去水相，將乙酸乙酯相減壓蒸干，得到黃酮提取產(chǎn)物。準確稱取一定量的產(chǎn)物，用60%乙醇溶解，然后用“1．4．1”的方法測定其黃酮含量。提取分離黃酮的工藝流程為:干構(gòu)樹葉→粉碎→加入乙醇溶劑→超聲提取→抽濾→濾液→回收乙醇→石油醚脫色→水層酸化pH=2→乙酸乙酯萃取2次→回收乙酸乙酯→得到提取產(chǎn)物→測定黃酮含量。

2 結(jié)果與分析

2．1 對照品溶液紫外可見光譜掃描和標準曲線制作 由對照品溶液紫外可見光譜掃描得知，最大吸收波長為506 nm。從蘆丁對照品標準曲線(圖1)可看出，回歸方程為y=9．15x+0．007 2(r2=0．996 5)。

2．2 單因素試驗

2．2．1 乙醇濃度對構(gòu)樹葉黃酮提取率的影響。從圖2可看到，當提取劑乙醇濃度在40% ～50%時提取率較大，隨著乙醇濃度增加，提取率逐步下降。其原因是隨著乙醇濃度增加，脂溶性物質(zhì)溶出較多，黃酮溶出量下降導(dǎo)致提取率下降，因此選擇40%～50%濃度的乙醇為最佳溶劑。

2．2．2 超聲提取溫度對構(gòu)樹葉黃酮提取率的影響。由圖3可見，隨著溫度的升高，提取率呈上升趨勢。因為溫度升高加快了分子的擴散能力，從而使構(gòu)樹葉黃酮的溶出速度增加，提取率升高，在60℃下提取率最大。但溫度進一步提高，可能引起黃酮的分解，導(dǎo)致黃酮提取率下降。因此提取溫度以60℃左右為宜。

2．2．3 料液比對構(gòu)樹葉黃酮提取率的影響。由圖4可知，隨著提取液比例的增加，構(gòu)樹葉黃酮提取率也隨之增加。一般情況下，提取液用量越多越利于構(gòu)樹葉黃酮的溶解，但在1∶20(g∶ml)以后提取率增加速度減緩。過高的料液比也會浪費溶劑和能源。所以選擇最佳的料液比為1∶20～1∶30。

2．2．4 超聲提取時間對構(gòu)樹葉黃酮提取率的影響。從圖5可看出，隨著超聲時間的增加，構(gòu)樹葉黃酮的提取率也逐漸增加，當超聲時間為40 min時，構(gòu)樹葉黃酮提取率達最大，繼續(xù)延長超聲時間，構(gòu)樹葉黃酮提取率呈下降趨勢?？赡艹晻r間過長，破壞了構(gòu)樹葉黃酮中的有效成分，因此選取最佳超聲提取時間為40 min。

2．3 正交試驗結(jié)果 根據(jù)單因素試驗結(jié)果設(shè)計了各因素水平表(表1)，并建立了L9(34)正交試驗表(表2)。由表2可知，通過極差分析，4個影響超聲波輔助提取構(gòu)樹葉中黃酮的因素大小順序為D(料液比)＞B(提取時間)＞A(乙醇濃度)＞C(提取溫度)，超聲波提取構(gòu)樹葉中黃酮的最佳工藝為A2B1C2D3，即乙醇濃度40%、提取時間30 min、提取溫度60℃、料液比為1∶30(g∶ml)，在此條件下，提取率為4．16%。

2．4 樣品的提取分離純化 根據(jù)正交試驗結(jié)果進行構(gòu)樹葉中黃酮的提取，用萃取法分離純化提取液。經(jīng)過試驗證明采用A3B2C1D3的工藝條件提取的黃酮提取液，在后處理步驟能有效地萃取分離黃酮，是最佳提取條件。稱取每份4．00 g干燥粉碎的構(gòu)樹葉樣品，共6份，按照最佳提取工藝條件，在超聲波清洗機中超聲提取，合并濾液，按照“1．4．6”的方法進行后處理和萃取分離，得到的固體產(chǎn)物質(zhì)量為1．426 g，產(chǎn)物得率為5．94%。稱取0．261 5 g固體產(chǎn)物，按照“1．4．2”的方法測定黃酮含量，測得固體產(chǎn)物中黃酮的含量為35．36%。

表1 超聲波提取黃酮工藝正交試驗因素和水平表

表2 超聲波提取黃酮正交試驗L9(34)設(shè)計及結(jié)果

3 結(jié)論

該試驗以廉價易得的天然產(chǎn)物構(gòu)樹葉為原料，采用超聲波輔助乙醇溶劑法提取其中的有效成分黃酮，在單因素試驗基礎(chǔ)上進行正交試驗，得到最佳提取工藝條件。結(jié)合分離純化的工藝條件，得出了最優(yōu)提取純化構(gòu)樹葉中黃酮的工藝是:以50%乙醇為溶劑，料液比為1∶30(g∶ml)，在50℃下超聲提取40 min，過濾后得到提取液。提取液濃縮至約1/2體積后，用等量石油醚萃取除去葉綠素等脂溶性雜質(zhì)，用鹽酸酸化水相至pH=2，再用等量乙酸乙酯萃取水相2次，黃酮從水相轉(zhuǎn)移到乙酸乙酯相，經(jīng)薄層色譜分離鑒定，乙酸乙酯相中主要成分為黃酮;分離酯層并回收乙酸乙酯，真空干燥得到了黃酮提取物，提取物得率為5．94%，其中黃酮含量達35．36%。

目前尚未見到用超聲波輔助溶劑法從構(gòu)樹葉中提取黃酮的工藝研究，并用乙酸乙酯萃取提純產(chǎn)物的報道。該工藝可得到含量較高的黃酮提取物，操作簡單、溶劑可回收、提取成本低、提取分離效率高，提取產(chǎn)物可以用其他方法進一步提純。該研究為開發(fā)利用構(gòu)樹葉中的黃酮并使其能應(yīng)用于醫(yī)藥及保健品提供了可靠試驗依據(jù)。

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