氣相色譜法測(cè)定養(yǎng)殖水體及水產(chǎn)品組織中的擬除蟲菊酯

陳湘藝，李小玲，黃華偉* ，黃向榮，劉伶俐，曾春芳

(1．湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所，湖南長(zhǎng)沙 410153;2．農(nóng)業(yè)部漁業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(長(zhǎng)沙)，湖南長(zhǎng)沙 410153)

擬除蟲菊酯是繼有機(jī)氯、有機(jī)磷和氨基甲酸酯之后的一類廣譜、高效、低毒、可生物降解的新型合成殺蟲劑，其殺蟲毒力較上述殺蟲劑提高了10～100倍。由于該殺蟲劑生物活性高且環(huán)境兼容性好，其銷量已占世界農(nóng)藥市場(chǎng)的25%［1］。然而由于缺乏科學(xué)使用方法，使得其隨農(nóng)田排水、降雨淋洗而流入河流和池塘，不僅污染水體，對(duì)飲用水源造成潛在危險(xiǎn)，而且還通過環(huán)境作用和食物鏈的富集，給生態(tài)環(huán)境、食品安全及人類健康都帶來了危害。研究表明，擬除蟲菊酯對(duì)哺乳動(dòng)物的生殖、免疫和心腦血管等均有明顯的毒副作用［2］，其對(duì)魚類的毒性比哺乳動(dòng)物和鳥類高1 000倍［3－4］，而且蝦蟹類等甲殼類動(dòng)物對(duì)擬除蟲菊酯尤為敏感［5］。過量使用擬除蟲菊酯易導(dǎo)致其在水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)不斷蓄積，引起中毒、畸變、繁殖衰退及死亡，其殘留問題已引起歐盟、日本等多個(gè)國(guó)家和地區(qū)的高度重視，我國(guó)農(nóng)業(yè)部第235號(hào)公告也規(guī)定了魚肌肉中溴氰菊酯最高殘留限量為30 μg/kg［6］。

近年來，多個(gè)地縣市突發(fā)性大規(guī)模死魚事件時(shí)有發(fā)生，給養(yǎng)殖戶造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，其多為擬除蟲菊酯農(nóng)藥中毒引起，且甲氰菊酯的檢出率高達(dá)80%。筆者就其中一起典型案例，運(yùn)用氣相色譜法對(duì)污染養(yǎng)殖池塘水體及水產(chǎn)動(dòng)物組織中的擬除蟲菊酯殘留量進(jìn)行了測(cè)定，旨在為水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中類似事故的原因調(diào)查、樣品采集和檢測(cè)以及應(yīng)急處置提供參考。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 供試樣品。樣品來自某養(yǎng)殖場(chǎng)池塘。

1．1．2 藥劑與試劑。聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯6種菊酯類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)購(gòu)自中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院，濃度均為100 μg/ml，規(guī)格為1 ml/支。正己烷(色譜純)、環(huán)己烷(色譜純)、乙酸乙酯(色譜純)、乙腈(色譜純)、丙酮(色譜純)、石油醚(分析純，30～60℃沸程)、氯化鈉(分析純)、無水Na2SO4(分析純)。

1．1．3 儀器。7890A氣相色譜儀(安捷倫科技有限公司)，配有63Ni電子捕獲檢測(cè)器(ECD);Rotavapor R-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士布奇公司);CR22GⅢ立式高速冷凍離心機(jī)(日本日立公司);XH-J旋渦混合器;BL-620S電子天平(日本島津公司);N-EVAPTM111氮吹儀;固相萃取裝置(安捷倫科技有限公司);1 g Supelco LC-Florisil凈化小柱。

1．2 方法

1．2．1 樣品診斷。選取中毒特征較明顯的草魚現(xiàn)場(chǎng)解剖，死亡的草魚體色失去原有光澤，機(jī)體較僵硬，出現(xiàn)不同程度的腫脹，其眼睛突起紅腫，鰓蓋骨及鰭條均有不同程度充血(圖1);解剖后觀察，其鰓絲鮮紅，并附有少量黏稠液體，細(xì)聞略有刺激性氣味，魚體腹腔充滿積液，呈現(xiàn)一定程度腹水，內(nèi)容物外翻，肝臟等內(nèi)臟組織表面出現(xiàn)糜爛，伴有異味(圖2)。經(jīng)綜合現(xiàn)場(chǎng)診斷及調(diào)研初步診斷為擬除蟲菊酯農(nóng)藥中毒引起。

1．2．2 樣品采集及保存。選取魚類死亡嚴(yán)重的池塘，用采水器分別采集池塘表層水體(水面以下30 cm處)、底層水體(水底以上30 cm處)，裝入5 L塑料壺中;同時(shí)采集中毒死亡體征明顯的魚樣，分別取其肌肉、鰓及內(nèi)臟組織，用勻漿機(jī)混勻后分別放入自封袋中待檢。所有樣品置于低溫保溫箱中保存，帶回實(shí)驗(yàn)室5 d內(nèi)完成分析檢測(cè)工作。

1．2．3 樣品前處理。

1．2．3．1 水樣。用量筒取200 ml混勻水樣置于500 ml分液漏斗中，加入10 g氯化鈉搖勻，再加入20 ml正己烷振蕩混勻3 min，同時(shí)不斷放氣，待靜置分層后取上層有機(jī)相于100 ml錐形瓶中，重復(fù)加入20 ml正己烷提取2次，合并3次提取液于錐形瓶后過填充有無水Na2SO4的玻璃層析柱，收集濾液于100 ml茄形瓶中，于45℃水浴旋轉(zhuǎn)濃縮至2 ml，然后轉(zhuǎn)入10 ml塑料離心管，再用4 ml正己烷分2次沖洗茄形瓶，合并洗液于離心管后于45℃氮吹儀吹干，最后用1 ml正己烷定容上機(jī)。

1．2．3．2 水產(chǎn)品組織。草魚肌肉、鰓及內(nèi)臟組織樣品的前處理方法參照高鈺一等［7］的檢測(cè)方法進(jìn)行。稱取5 g勻漿樣品置于50 ml離心管中，加入環(huán)己烷－乙酸乙酯(1∶1，V/V)提取液15 ml，在旋渦混合儀上充分混勻1 min，超生提取10 min，6 000 r/min離心10 min，將上層有機(jī)相轉(zhuǎn)移到100 ml茄形瓶中，重復(fù)加15 ml提取液提取1次，合并上層有機(jī)相于45℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸干。殘余物用10 ml乙腈溶解，加入10 ml乙腈飽和的石油醚，充分混合，靜置分層后棄去上層的石油醚，重復(fù)操作2次。下層的乙腈溶液于45℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸干，殘余物用2 ml丙酮－正己烷(1∶9，V/V)溶解，過SPE小柱凈化。依次用5 ml丙酮－正己烷(1∶9，V/V)、5 ml正己烷活化小柱，加入提取樣液于小柱中，同時(shí)收集流出液于10 ml塑料離心管中，控制流速不超過2 ml/min，然后加入4 ml丙酮－正己烷(1∶9，V/V)洗脫。將收集液在45℃水浴中用氮?dú)獯蹈?，? ml正己烷定容，供氣相色譜儀分析。樣品中擬除蟲菊酯含量按公式C=(樣品上機(jī)濃度×定容體積)/取樣量計(jì)算，水體及魚體組織中樣品含量單位分別以μg/L和μg/kg表示。

1．2．4 色譜條件。色譜柱:HP-5(長(zhǎng)度 30．0 m，膜厚 0．25 μm，內(nèi)徑320．00 μm);進(jìn)樣口溫度:270 ℃;檢測(cè)器溫度:300℃;柱溫程序:初溫140℃保留1 min，以15℃/min升溫至270℃后保留15 min;載氣:99．999%高純氮?dú)?總流量:25 ml/min;隔墊吹掃流量:3 ml/min;尾吹流量:30 ml/min;進(jìn)樣方式:分流進(jìn)樣，分流比 10∶1;進(jìn)樣量:1．0 μl。

2 結(jié)果與分析

2．1 標(biāo)準(zhǔn)溶液氣相色譜分析 制備了0．005～0．200 μg/ml線性范圍的6種菊酯類農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以出峰的保留時(shí)間定性，以峰面積總和定量。標(biāo)準(zhǔn)溶液氣相色譜見圖3，按出峰先后順序依次為聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯。

2．2 樣品檢測(cè)結(jié)果 初檢時(shí)由于池塘表、底層水樣中擬除蟲菊酯農(nóng)藥含量較高，超出了線性范圍，復(fù)檢時(shí)對(duì)原水樣均稀釋20倍后進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，污染池塘表層和底層水體均不同程度檢出了甲氰菊酯，其含量分別為12．47和19．08 μg/L，水體底層含量明顯高于水體表層(表1)。污染池塘水樣檢測(cè)的氣相色譜見圖4～圖5。

此外，分別對(duì)草魚肌肉、鰓及內(nèi)臟組織進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，除草魚肌肉組織外，草魚的鰓和內(nèi)臟組織中均檢出了甲氰菊酯，其含量分別為 3．27 和74．29 μg/kg，且草魚內(nèi)臟組織中甲氰菊酯含量較高，其含量為鰓組織的22．7倍，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于草魚鰓組織，水樣和草魚組織中其他幾種農(nóng)藥則均未檢出(表1)。草魚肌肉、鰓及內(nèi)臟組織檢測(cè)的氣相色譜見圖6～圖8。

3 討論

擬除蟲菊酯殺蟲劑作用方式一般為觸殺和胃毒，由于其對(duì)魚類等水生生物具有很高的毒性，故不能在水稻田、河流池塘及其周圍地區(qū)使用該類殺蟲劑。甲氰菊酯(俗稱“滅掃利”)，其原藥為棕黃色液體或固體，較難溶于水，其生產(chǎn)使用劑型多為20%乳油制劑，為淡黃色均相液體，易溶于水且密度比水大，在中性和酸性條件下穩(wěn)定，遇堿易分解失效，其對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的危害多為急性神經(jīng)性中毒。

研究表明，甲氰菊酯對(duì)多種水產(chǎn)動(dòng)物均具有明顯毒性［8－16］，其對(duì)草魚［8］、尼羅羅非魚［9］、黃鱔［10］、泥鰍［11］和鰻鱺［13］的 96 h 半致死濃度(LC50)分別為 2．50、5．90、6．55、38．02和6．55 μg/L，不同水產(chǎn)動(dòng)物對(duì)甲氰菊酯的敏感程度也不相同，這與水產(chǎn)動(dòng)物的呼吸方式和體表結(jié)構(gòu)有關(guān)。譚娟等［9］研究了甲氰菊酯對(duì)尼羅羅非魚急性毒性和外周血細(xì)胞的影響，結(jié)果表明甲氰菊酯濃度越大、用藥時(shí)間越長(zhǎng)，死亡率也越大，甲氰菊酯能造成紅細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化;周立斌等［14］研究表明LC50與試驗(yàn)對(duì)象的種類、性別、大小以及水溫、溶氧、pH等水質(zhì)環(huán)境密切相關(guān)。對(duì)污染池塘水樣的檢測(cè)結(jié)果顯示，池塘表、底層水體中均檢出了甲氰菊酯，其含量分別為12．47和19．08 μg/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了其對(duì)草魚等大多數(shù)水產(chǎn)動(dòng)物的安全濃度，水體底層含量明顯高于水體表層，這可能與其在水體中的擴(kuò)散和比重有關(guān)。

擬除蟲菊酯是一類親脂性很強(qiáng)的化合物，在水中能直接進(jìn)入魚鰓與魚血液中［15］，不僅干擾魚類的鈉離子平衡，抑制魚類鰓組織ATP酶活性，而且還對(duì)魚類鰓組織造成病理?yè)p傷［16］。死亡草魚鰓和內(nèi)臟組織中均不同程度檢出甲氰菊酯，其含量分別為 3．27 和 74．29 μg/kg，內(nèi)臟組織中含量為鰓組織的22．7倍，可見甲氰菊酯中毒是造成養(yǎng)殖魚類大范圍死亡的主要原因之一，草魚肌肉組織未檢出擬除蟲菊酯農(nóng)藥，可能與草魚甲氰菊酯急性中毒死亡以及農(nóng)藥的富集殘留時(shí)間有關(guān)。

因此，遇到類似事故應(yīng)在第一時(shí)間向池塘水體中潑灑生石灰，促進(jìn)藥物的分解，同時(shí)加大池塘換水量，把經(jīng)濟(jì)損失降到最低;同時(shí)，對(duì)于污染的水產(chǎn)品，一定要就地掩埋或焚燒，避免誤食或流入市場(chǎng)，對(duì)人類造成更大的危害。此外，在事故調(diào)查和鑒定方面現(xiàn)場(chǎng)采集水樣時(shí)，最好分別采集不同水層的水樣，尤其是底層水體;對(duì)于養(yǎng)殖魚類，盡量采集所有種類的魚類樣品，分別取其肌肉、鰓以及內(nèi)臟等不同部位的組織進(jìn)行檢測(cè)，所有樣品低溫保存后及時(shí)送交具有資質(zhì)的檢測(cè)機(jī)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè)，為維護(hù)自身合法權(quán)益提供有力依據(jù)。只有相關(guān)部門重視和加強(qiáng)該類藥品的監(jiān)管，形成聯(lián)動(dòng)機(jī)制，同時(shí)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中科學(xué)合理的使用該類農(nóng)藥，加強(qiáng)防范人為投毒以及采取必要的應(yīng)急措施就能有效預(yù)防該類事故的發(fā)生。

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