應(yīng)用酶聯(lián)免疫法快速檢測(cè)水產(chǎn)品孔雀石綠殘留

曾 蓉，王明力

(1．貴州大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550025;2．貴陽(yáng)市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，貴州貴陽(yáng) 550081)

孔雀石綠(MG)是一種帶有金屬光澤的綠色結(jié)晶體，屬三苯甲烷類染料，作為殺真菌劑和消毒劑被廣泛應(yīng)用在水產(chǎn)養(yǎng)殖上［1］?？兹甘G被魚體吸收后會(huì)代謝為危害更大的隱形孔雀石綠(LMG)和隱形結(jié)晶紫(LCV)，并沉積于脂肪組織，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)孔雀石綠具有高毒、高殘留、致畸、致癌、致突變等副作用，殘留時(shí)間達(dá)到100 d以上，目前許多國(guó)家已禁用孔雀石綠。日本、美國(guó)、歐盟已不允許其作為獸藥用于水產(chǎn)養(yǎng)殖上。我國(guó)在2002年在《動(dòng)物性食品中獸藥殘留最高限量》(農(nóng)業(yè)部公告235號(hào))中將孔雀石綠列為禁用藥［2］，在動(dòng)物性食品中不得檢出。但因其價(jià)格低廉，在水霉病防治方面尚未有很好的替代品，所以在水產(chǎn)養(yǎng)殖、運(yùn)輸過(guò)程中仍有違規(guī)使用，在不同程度上存在禁而不止的現(xiàn)象［3］。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，檢測(cè)水產(chǎn)品中孔雀石綠、結(jié)晶紫類物質(zhì)的手段和方法多種多樣，檢測(cè)儀器越來(lái)越靈敏。常見方法有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、ELISA試劑盒和膠體金試紙3類。2006年我國(guó)頒布了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T20361－2006《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定》［4］，該標(biāo)準(zhǔn)方法的準(zhǔn)確度較高，但檢測(cè)步驟多，樣品前處理繁瑣、費(fèi)時(shí)、檢測(cè)成本高，使用有機(jī)溶液量大，儀器設(shè)備昂貴，不適于對(duì)大量樣品進(jìn)行低成本快速篩選、現(xiàn)場(chǎng)判定的需要。如何采用最快捷、最經(jīng)濟(jì)、最準(zhǔn)確的檢驗(yàn)方法，是食品安全的一項(xiàng)重要研究?jī)?nèi)容，就目前的發(fā)展趨勢(shì)看食品安全檢測(cè)方法首先要體現(xiàn)快速，因?yàn)槭称飞a(chǎn)者、經(jīng)營(yíng)者、監(jiān)督者都需要準(zhǔn)確而又及時(shí)的監(jiān)控結(jié)果。鑒于此，筆者選用一種酶聯(lián)免疫試劑盒分別對(duì)市場(chǎng)抽取43份水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留量進(jìn)行了速測(cè)，旨在為水產(chǎn)品安全檢測(cè)提供參考。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 儀器。電子天平(瑞士梅特勒公司)、離心機(jī)(上海安亭儀器廠)、微孔酶標(biāo)儀(美國(guó)寶特公司)、洗板機(jī)(美國(guó)寶特公司)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司)、氮?dú)獯蹈裳b置(瑞士Buchi公司)、離心管、微量移液器(單道 20～200 μl、100～1 000 μl)。

1．1．2 試劑。乙酸乙酯(分析純)、冰乙酸(分析純)、正己烷(分析純)、孔雀石綠隱性高濃度標(biāo)準(zhǔn)品(2．5 μg/L)、孔雀石綠ELISA檢測(cè)試劑盒(力德力諾生物技術(shù)有限公司)。

1．2 方法

1．2．1 樣品制備與提取。水產(chǎn)品樣品去除非食用部分，用勻漿器均質(zhì)樣品;稱取(1．00±0．05)g勻漿樣品至50 ml離心管中，加入10 ml冰醋酸－乙酸乙酯(1∶99，V/V)溶液，劇烈振蕩2 min;室溫下4 000 r/min離心10 min，取1 ml上層液于離心管中，加入氧化劑液50 μl，輕輕搖勻后室溫避光放置3～5 min;40℃氮?dú)獯蹈?，吹干后立即加? ml樣品稀釋液，再加入1 ml正己烷，渦動(dòng)20 s混勻，4 000 r/min離心5 min;去除上層有機(jī)相，取下層水相50 μl進(jìn)行檢測(cè)。

1．2．2 酶標(biāo)板操作。取出所需的酶標(biāo)板孔，在每孔中加入50 μl工作標(biāo)準(zhǔn)品 (0、0．1、0．3、0．9、2．7、27．0 ng/ml)和樣品于所設(shè)定的孔中。在每孔中加入50 μl抗體，輕敲微孔板邊緣1 min混勻。25℃避光環(huán)境中反應(yīng)30 min。

洗板4～5次，每次應(yīng)該加入250 μl 1倍洗液，最后一次使板盡量甩干并在吸水紙上吸干。加入100 μl酶標(biāo)物，輕敲微孔板邊緣混勻，在25℃下避光培養(yǎng)30 min。重復(fù)洗板步驟，加入底物A液50 μl，再加底物B液50 μl，輕輕振蕩混勻，25℃下避光反應(yīng)15～20 min。加入50 μl終止液終止反應(yīng)，在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定每孔OD值。

1．2．3 樣品加標(biāo)回收率試驗(yàn)。用已檢測(cè)的陰性樣品做基體空白，取(1．00 ±0．05)g勻漿樣品，分別加入 0．1 μg/ml孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液 100、300、500 μl，每個(gè)濃度2 個(gè)平行，采用該試驗(yàn)方法測(cè)定回收率。

2 結(jié)果與分析

2．1 孔雀石綠的標(biāo)準(zhǔn)曲線 結(jié)果表明，孔雀石綠含量(x，ng/ml)與吸光度之比(y=B/B0，%)的線性方程為:y=－22．889lnx+30．763，R2=0．998 7(圖1)。

表1 不同濃度樣品加標(biāo)回收率

2．2 樣品中孔雀石綠檢測(cè)結(jié)果 共檢測(cè)樣品43份，其中檢出陽(yáng)性結(jié)果樣品有3份，殘留量分別為2．137、1．581、1．439 μg/kg，檢出率為6．98%。均超過(guò)水產(chǎn)品中孔雀石綠限量標(biāo)準(zhǔn)1．000 μg/kg。

2．3 樣品加標(biāo)回收率 由表1可知，水產(chǎn)品中孔雀石綠的平均回收率為78．27% ～88．73%，表明試驗(yàn)方法回收率穩(wěn)定、可靠。

3 討論

樣品檢測(cè)如為陰性結(jié)果，可直接排除水產(chǎn)品中含有孔雀石綠和隱性孔雀石綠殘留;如為陽(yáng)性結(jié)果，需進(jìn)一步用高效液相色譜法或液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜確證和定量。該試驗(yàn)中檢出的3份陽(yáng)性樣品用高效液相色譜法確認(rèn)后，均檢出含有孔雀石綠殘留。

ELISA試劑盒的所有試劑需要恢復(fù)至20～25℃保證靈敏度，吸附試驗(yàn)中溶液每次加量要嚴(yán)格相同，酶標(biāo)板洗板時(shí)確保干凈，甩干并在吸水紙上吸干后使用。

酶聯(lián)免疫快速檢測(cè)技術(shù)相對(duì)傳統(tǒng)和經(jīng)典的化學(xué)檢測(cè)和儀器檢測(cè)而言，其特點(diǎn)是檢測(cè)所需的時(shí)間相對(duì)較少，對(duì)儀器設(shè)備、操作人員等條件要求不高，樣品前處理簡(jiǎn)單，既快速方便又節(jié)約成本，可滿足水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留的篩選以及疑似樣品的確證，應(yīng)用前景廣闊，有利于政府監(jiān)管并指導(dǎo)企業(yè)自控，促進(jìn)水產(chǎn)品衛(wèi)生質(zhì)量的提高，保護(hù)消費(fèi)者身體健康，提高我國(guó)水產(chǎn)品的國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力。

［1］史東杰，孫向軍，梁擁軍，等．水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留檢測(cè)的ELISA與HPLC 法的比較［J］．現(xiàn)代漁業(yè)信息，2009，24(4):11－14．

［2］農(nóng)業(yè)部．中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào):動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量［S］．2002．

［3］王麗玲．應(yīng)用快速檢測(cè)試劑盒預(yù)測(cè)水樣和水產(chǎn)品中孔雀石綠［J］．實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2007，14(6):1900 －1901．

［4］鄭斌，趙紅萍，冷凱良，等．GB/T20361－2006，水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定［S］．北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2006．