p66Shc基因調(diào)控早期胚胎發(fā)育阻滯的研究進(jìn)展

胡軍和，陽(yáng)仲斌，李 偉，金晨鐘，曾 智，吳 娟，張雪嬌，王 艷 (湖南人文科技學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，湖南婁底417000)

p66Shc基因最早是由Migliaccio等在1999年提出的。研究表明，在小鼠食物攝入和體重?zé)o明顯變化的情況下，p66Shc基因敲除小鼠的壽命要比對(duì)照組小鼠的壽命延長(zhǎng)30%，為此命名該基因?yàn)椤伴L(zhǎng)壽基因”［1］。p66Shc(66-kilodalton isoform of Shc gene products)基因編碼一種磷酸化酪氨酸信號(hào)適配蛋白，已發(fā)現(xiàn)與之相關(guān)的3種Shc基因:ShcA、ShcB(Sli)和ShcC(Rai)［2］。p66Shc(66-kilodahon isoform of Shc gene products)是哺乳動(dòng)物的原癌基因SHC編碼3個(gè)分子量相近的ShcA蛋白質(zhì)家族(p46Shc、p52Shc和 p66Shc)中3個(gè)成員之一［1］。近年來(lái)，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)p66Shc蛋白在由氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，而且該蛋白的表達(dá)水平與其氧化水平呈線性關(guān)系［3］。在胚胎早期發(fā)育過(guò)程中，活性氧(Reactive oxygen species，ROS)是導(dǎo)致胚胎體外發(fā)育阻滯的重要原因之一［4］。在正常生理狀態(tài)下，哺乳動(dòng)物胚胎在體內(nèi)發(fā)育環(huán)境(輸卵管和子宮)的含氧量一般為5% ～8%，可見(jiàn)胚胎內(nèi)ROS水平的高低對(duì)其發(fā)育非常重要。

1 p66Shc的分子結(jié)構(gòu)及功能

p66Shc的分子結(jié)構(gòu)組成包括PTB(an N-terminal phosphotyrosine-binding domain)、CH1(a central proline-rich domain)、SH2(a carboxy terminal Src homology 2)和CH2(an additional N-terminal proline-rich domain)，主要通過(guò)酪氨酸激酶信號(hào)通路調(diào)控有絲分裂等細(xì)胞生物學(xué)事件。其中的SH2結(jié)構(gòu)域是發(fā)揮功能的主要結(jié)合靶位點(diǎn)(如EGF受體或ErbB-2)，PTB結(jié)構(gòu)域可以綁定到磷脂，這說(shuō)明磷脂酰肌醇3激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)能夠在激活SHC基因中發(fā)揮作用;SH2結(jié)構(gòu)域和EGF受體酪氨酸激酶的激活對(duì)CH1結(jié)構(gòu)域中的酪氨酸激活具有重要的作用［5］。同時(shí)，在p66Shc蛋白上包含2個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)(位于CH2結(jié)構(gòu)域中36位絲氨酸和PTB結(jié)構(gòu)域中108位絲氨酸)，其中第1個(gè)位點(diǎn)與氧化應(yīng)激反應(yīng)有密切的關(guān)系，能夠影響胞內(nèi)ROS水平和對(duì)UV射線的反應(yīng)，而且能夠被MAPK(Mitogen-activated protein kinase)信號(hào)通路調(diào)節(jié)，并且通過(guò)相互作用調(diào)控細(xì)胞的凋亡［6］。叉頭轉(zhuǎn)錄因子(Forkhead transcription factor)是36位絲氨酸－磷酸化p66Shc下游調(diào)控的主要靶作用位點(diǎn)，這些叉頭轉(zhuǎn)錄因子家族至少包含80個(gè)成員，這些成員在調(diào)控凋亡及氧化有著復(fù)雜的作用。在淋巴細(xì)胞中，細(xì)胞因子能夠激活叉頭轉(zhuǎn)錄因子FKHR-L1(Forkhead(Drosophila)homolog(rhabdomyosarcoma)like 1)，這個(gè)轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)調(diào)控凋亡蛋白BIM(Bel-interaetion mediator)的表達(dá)，從而引起線粒體膜的破壞，引起細(xì)胞凋亡的發(fā)生［7］。同時(shí)，也有很多研究表明p66Shc能夠通過(guò)作用于線粒體調(diào)節(jié)胞內(nèi)的ROS水平的高低，引起細(xì)胞凋亡或衰老的發(fā)生［5］。具體的分子結(jié)構(gòu)及其調(diào)控作用型號(hào)通路如圖1所示。

由此可見(jiàn)，通過(guò)p66Shc基因中36位的絲氨酸發(fā)生磷酸化，可以提高細(xì)胞內(nèi)ROS水平和激活MAPK通路，同時(shí)也能促進(jìn)叉頭轉(zhuǎn)錄因子活性的升高，從而加強(qiáng)叉頭轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的相關(guān)蛋白(如凋亡蛋白BIM等)的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)其ROS水平升高和細(xì)胞發(fā)生凋亡。

2 p66Shc調(diào)控活性氧水平研究進(jìn)展

p66Shc已被研究證實(shí)在細(xì)胞的氧化應(yīng)激應(yīng)答中起重要作用，通過(guò)叉頭轉(zhuǎn)錄因子家族調(diào)節(jié)胞內(nèi)氧化還原平衡及凋亡［8］。p66Shc在氧化應(yīng)激狀況下調(diào)節(jié)FoxO(Forkhead box class O)轉(zhuǎn)錄因子的活性，而FoxO是PI3K-AKT-FoxO信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的環(huán)節(jié)［9］。p66Shc上的絲氨酸磷酸化位點(diǎn)的磷酸化狀態(tài)直接影響著其信號(hào)適配功能，從而參與細(xì)胞的凋亡調(diào)控，而p46/p52Shc通過(guò)與細(xì)胞表面的有絲分裂信號(hào)受體結(jié)合從而參與Ras-MAPK(Mitogen activated protein kinase)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，此途徑影響細(xì)胞的增殖和分化［10］。研究表明，p66Shc是P53的下游調(diào)控作用因子，2種一起調(diào)控ROS水平及細(xì)胞凋亡的發(fā)生，因?yàn)榍贸?個(gè)基因的細(xì)胞內(nèi)的氧化損傷及DNA斷裂顯著減少［11］。但是，后來(lái)的研究結(jié)果卻與之不同，認(rèn)為P53在調(diào)控ROS的水平方面未充分發(fā)揮作用，主要是p66Shc的作用所引起的［5，12］。最近研究發(fā)現(xiàn)，p66Shc的功能主要在于其蛋白特異的N端結(jié)構(gòu)能夠形成一個(gè)氧化結(jié)構(gòu)單元(這個(gè)結(jié)構(gòu)單元能夠引起凋亡的發(fā)生)，其結(jié)構(gòu)單元能夠被2個(gè)二硫化物結(jié)合形成可變化四聚體化引起激活。其中，谷胱甘肽和硫氧還蛋白的作用能夠減弱或滅活p66Shc的氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而形成一個(gè)以硫醇發(fā)揮氧化還原作用的傳感發(fā)生裝置，來(lái)對(duì)包內(nèi)的ROS水平做出相應(yīng)的調(diào)節(jié)反應(yīng)，導(dǎo)致相應(yīng)功能反應(yīng)［3］。有關(guān)其調(diào)控機(jī)制的研究，有報(bào)道認(rèn)為主要通過(guò)絲裂原激活蛋白激酶－激活蛋白激酶2(Mitogen activated protein kinase-activated protein kinase 2，MAPKAP-2)作用發(fā)揮其調(diào)控作用，因?yàn)橥ㄟ^(guò)免疫共沉淀能夠得到2種蛋白的復(fù)合體［13］。盡管具體的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)不是很清楚，目前大多數(shù)研究表明Shc基因表達(dá)主要受ROS水平的調(diào)節(jié)，然后發(fā)生磷酸化二激活，同時(shí)表帶的不同蛋白產(chǎn)物作用方式和功能也不同，如p66Shc可作用于線粒體引起凋亡的發(fā)生等。

3 p66Shc調(diào)控胚胎發(fā)育阻滯的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

Favetta等［12］研究發(fā)現(xiàn)有13．5%左右的牛體外生產(chǎn)胚胎阻滯在2－4細(xì)胞階段，一般第一次胚胎分裂發(fā)生在激活后的26～48 h，雖然在開始只有大約0．6%比例的胚胎發(fā)生阻滯發(fā)育，但是在后來(lái)的阻滯卻有大約14．2%的胚胎發(fā)生阻滯;采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)這2種阻滯的胚胎，結(jié)果表明其p66ShcmRNA的表達(dá)都顯著高于對(duì)照組，但是其p53 mRNA的表達(dá)及蛋白的磷酸化等沒(méi)有明顯變化，由此可見(jiàn)其由ROS水平升高引起胚胎的發(fā)育阻滯主要在于p66ShcmRNA的表達(dá)，而與p53 mRNA及蛋白的表達(dá)關(guān)系不大。同時(shí)，以牛IVF胚胎作為對(duì)照組，通過(guò)在牛GV期的卵母細(xì)胞中注射12 000～24 000個(gè)短的發(fā)夾式反義RNA p66Shc分子研究其p66Shc分子對(duì)由ROS引起的胚胎發(fā)育阻滯的影響研究發(fā)現(xiàn)，Real-time PCR結(jié)果表明試驗(yàn)組的p66Shc的mRNA表達(dá)顯著低于對(duì)照組，但是其內(nèi)參基因的表達(dá)沒(méi)有差異，同時(shí)其熒光染色發(fā)現(xiàn)其試驗(yàn)組的熒光顯著弱于對(duì)照組;在試驗(yàn)組中胚胎發(fā)育阻滯的比例顯著低于對(duì)照組，但是在囊胚階段其p66ShcmRNA的表達(dá)沒(méi)有顯著差異［14］。利用發(fā)生胚胎發(fā)育阻滯的牛胚胎為研究材料，研究其胚胎內(nèi)ROS水平與胚胎發(fā)育阻滯的聯(lián)系，其結(jié)果發(fā)現(xiàn)胚胎在20%的氧濃度下培養(yǎng)會(huì)使得其氧化刺激提高近10倍，相應(yīng)發(fā)現(xiàn)在2－4細(xì)胞發(fā)生阻滯的胚胎比例提高2倍，同時(shí)其發(fā)育潛能顯著低于在5%氧濃度下培養(yǎng)的胚胎;同時(shí)，p66ShcmRNA的表達(dá)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其20%氧濃度下顯著高于5%的表達(dá)水平，但是其p53的表達(dá)在2種條件下顯著差異［5］?？傊?，在胚胎培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的ROS(如可見(jiàn)光、氨基酸氧化物等)，這些胚胎內(nèi)ROS水平的升高可能是胚胎在發(fā)育過(guò)程中發(fā)生阻滯現(xiàn)象的重要原因之一。由此可見(jiàn)，胚胎發(fā)育阻滯在體外培養(yǎng)胚胎中是一種普通現(xiàn)象，而且與ROS產(chǎn)生及其水平密切相關(guān)。

由此可見(jiàn)，p66Shc是外源氧化物質(zhì)誘導(dǎo)細(xì)胞或胚胎內(nèi)部發(fā)生由ROS引起細(xì)胞損傷反應(yīng)的主要作用靶點(diǎn)，能夠誘導(dǎo)p66Shc基因表達(dá)的加強(qiáng)，從而調(diào)控作用于線粒體膜的因子的表達(dá)。這些因子作用于線粒體膜后，引起線粒體膜的破壞，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生，影響其功能的發(fā)揮。

總而言之，目前人們胚胎早期發(fā)育阻滯的機(jī)理不是很清楚，一般認(rèn)為是由于在胚胎發(fā)育過(guò)程中合子基因的表達(dá)沒(méi)有有效啟動(dòng)，但是具體的靶基因及相互調(diào)控關(guān)系也不清楚。盡管已有研究發(fā)現(xiàn)p66Shc基因與細(xì)胞或胚胎內(nèi)ROS的產(chǎn)生存在某些聯(lián)系，但是有關(guān)胚胎p66Shc通過(guò)調(diào)控ROS影響胚胎合子基因表達(dá)機(jī)制還不是很清楚，有待于進(jìn)一步研究。

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