釀酒酵母DL28轉(zhuǎn)化產(chǎn)γ-氨基丁酸主要影響因子的篩選

烏云達(dá)來，郭雪娜，張博潤，王肇悅*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018;2.中國科學(xué)院微生物研究所，北京100101)

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid)簡稱 GABA，是谷氨酸脫羧酶(glutamic acid decarboxylase，GAD，EC 4.1.1.15)生物催化L-谷氨酸或鈉鹽α-羧基脫羧反應(yīng)而產(chǎn)生的非蛋白質(zhì)組成的天然氨基酸［1－2］，為哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)［3］，廣泛存在于從單細(xì)胞生物到哺乳動物的各種有機體活細(xì)胞中［4］，具有許多重要的生理功能，如降血壓［5］、鎮(zhèn)痛［6］、治療哮喘［7］等。近年來，GABA 相關(guān)功能性食品的開發(fā)引人關(guān)注，其中植物富集法(米胚、米糠、綠茶等)和微生物發(fā)酵法(乳酸菌、酵母)制得的富含GABA食品都獲得了良好的社會價值和經(jīng)濟效益。因此，GABA作為一種功能性因子越來越廣泛地用于食品、醫(yī)藥及化工等行業(yè)［8－11］。

酵母菌是單細(xì)胞真核生物，在我國已有2 000多年的使用歷史，如在釀酒業(yè)上的應(yīng)用，也是我國重要的微生物資源［12－13］。據(jù)研究報道，已篩選出發(fā)酵產(chǎn)生較高GABA產(chǎn)量的酵母菌株，如 Candida parapsilosis GPT-5-11為 1.76 g/L［14］、產(chǎn) GABA 酵母菌株的 GABA 產(chǎn)量達(dá) 1.69 g/L［15］、Saccharomyces uvarum 4#為 3.653 g/L［16］等。

Plackett-Burman試驗設(shè)計是一種經(jīng)濟而有效的二水平試驗設(shè)計方法，試驗組合數(shù)量較少也滿足試驗要求，且因子的交互作用僅部分的與主因子發(fā)生混淆［17］，應(yīng)用于生物工藝優(yōu)化研究中的報道很多，如糞腸球菌HX-3-6產(chǎn)γ-氨基丁酸發(fā)酵條件的優(yōu)化［11］、嗜酸乳桿菌NX2-6產(chǎn)細(xì)菌素的發(fā)酵條件優(yōu)化［18］等。筆者通過Plackett-Burman設(shè)計對釀酒酵母重組菌轉(zhuǎn)化產(chǎn)生GABA具有影響的內(nèi)在因素和外在因素進(jìn)行研究，篩選出主要影響因素，為其發(fā)酵條件的優(yōu)化提供試驗數(shù)據(jù)具有重要實際意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株。S.cerevisiae DL28是中國科學(xué)院微生物研究所工業(yè)微生物與生物技術(shù)研究室將產(chǎn)GABA的S.cerevisiae 28［19］通過聚合酶鏈反應(yīng)和核酸體外擴增技術(shù)改良的谷氨酸脫羧酶基因(GAD 1)高效表達(dá)的重組菌株。

1.1.2 主要培養(yǎng)基及試劑。YEPD液體培養(yǎng)基根據(jù)文獻(xiàn)［20－21］介紹的方法配制;GABA標(biāo)樣，Sigma公司;L-谷氨酸，國藥集團化學(xué)試劑有限公司;其他試劑及藥品均為分析純。

1.1.3 主要設(shè)備。Eppendorf高速冷凍離心機，5415R型和5804R型;分光光度計，SHIMADZU UV-2450型。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株DL28的培養(yǎng)及菌懸液的制備。將S.cerevisiae DL28菌株接種于5 ml YEPD液體培養(yǎng)基中，置29℃、搖床培養(yǎng)12～24 h。傳代培養(yǎng)2次后接種于YEPD液體培養(yǎng)基中，置29 ℃、搖床培養(yǎng)12 h，3 000 r/min、4 ℃離心10 min，棄掉上清液，加入與培養(yǎng)液等量的滅菌生理鹽水(約5 ml)，振蕩混勻，再次離心，同法洗滌2次。然后，棄掉上清液的菌體加入4.5 ml滅菌生理鹽水，振蕩混勻，即成為供試菌液。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。采用 Berthelot法［21－22］建立 GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線，即取30 mmol/ml標(biāo)準(zhǔn) GABA 溶液0.05、0.10、0.20、0.30、0.40 ml，依次加 30 mmol/ml L-Glu 溶液 0.35、0.30、0.20、0.10、0 ml，混合，加入0.2 ml碳酸鈉溶液(1.0 mol/L)混合，加入1.0 ml四硼酸鈉緩沖液(0.2 mol/L)，混勻，加入 1.0 ml 6.0%苯酚溶液，再加入5.0 ml 7.5%次氯酸鈉溶液后沸水浴10 min，然后冰浴5 min，加入60%的乙醇溶液2.0 ml，在波長640 nm下測定其吸光值，以L-Glu溶液做空白對照。以GABA濃度為橫坐標(biāo)，波長640 nm處的吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 轉(zhuǎn)化液中GABA含量的測定［22－23］。轉(zhuǎn)化液中 GABA含量的測定方法同上。將轉(zhuǎn)化液0.5 ml與0.2 ml碳酸鈉溶液混合，加入1.0 ml四硼酸鈉緩沖液，混勻，加入1.0 ml 6%苯酚溶液，再加入5.0 ml 7.5%次氯酸鈉溶液后沸水浴10 min，然后冰浴5 min，加入60%的乙醇溶液2.0 ml，在640 nm下測定其吸光值。

1.2.4 GABA轉(zhuǎn)化條件關(guān)鍵影響因子的篩選——Plackett-Burman設(shè)計。通過Berthelot法以菌體濃度、底物濃度及起始pH等6個因素作為研究對象，從中篩選對菌株DL28轉(zhuǎn)化產(chǎn)生GABA有顯著影響的因子。選取的6個因素及其代碼、編碼水平見表1，其響應(yīng)值為每組轉(zhuǎn)化液中GABA含量(mmol/L)。利用JMP軟件進(jìn)行試驗設(shè)計、數(shù)據(jù)分析及模型的建立。該試驗采用二水平Plackett-Burman設(shè)計，試驗設(shè)計見表1。

表1 影響因素及編碼水平Plackett-Burman設(shè)計

2 結(jié)果與分析

2.1 GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 通過Berthelot比色法，以GABA濃度為橫坐標(biāo)，波長640 nm處的吸光值(A640)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，GABA的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

經(jīng)數(shù)據(jù)分析得知，GABA的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程式為Y=0.014 4X+0.412 1，相關(guān)系數(shù) R2=0.999。因此，待測轉(zhuǎn)化液中GABA濃度在4.0～30.0 mmol/L的范圍內(nèi)與吸光值的相關(guān)性很好。

2.2 轉(zhuǎn)化液中GABA含量的測定 PB試驗結(jié)果及其響應(yīng)值見表2，各因素方差分析見表3。采用JMP軟件對表3中的Y值(GABA含量)進(jìn)行方差分析，該數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.000 1)。通過逐步回歸分析，得到轉(zhuǎn)化液GABA含量為響應(yīng)值的最優(yōu)多元線性回歸方程(α=0.05):

式中，Y為GABA含量預(yù)測值;由自變量編碼方程可知，x1=(菌體濃度－2)/1，x5=(轉(zhuǎn)化時間－36)/12，x6=(起始 pH－4.5)/0.5。

方差分析表明，所得最優(yōu)多元線性回歸方程達(dá)到極顯著(P ＜0.000 1)，而且各因子系數(shù)均有意義(P ＜0.05)。該回歸模型在被研究的整個回歸區(qū)域擬合的很好。決定系數(shù)R2=0.952 076 和 R2Adj=0.916 133，Y 值(GABA 含量)表明95.2%的試驗數(shù)據(jù)的變異性可用此回歸模型來解釋。由偏回歸系數(shù)及顯著性檢驗得到影響菌株DL28轉(zhuǎn)化GABA主要影響因子為:菌體濃度(P=0.012 3)、轉(zhuǎn)化時間(P=0.047 5)和起始 pH(P=0.001 9)。

表2 Plackett-Burman試驗設(shè)計及響應(yīng)值

S.cerevisiae DL28轉(zhuǎn)化產(chǎn)生GABA的含量受內(nèi)條件(如菌體濃度、底物濃度等)和外條件(如轉(zhuǎn)化溫度、轉(zhuǎn)化時間等)的制約。因此，為提高該菌株通過轉(zhuǎn)化產(chǎn)生GABA的含量，首先從眾多的相關(guān)影響因素中篩選出主要影響因子，并了解轉(zhuǎn)化因素之間的相互作用是至關(guān)重要的。由顯著因素的偏回歸系數(shù)和重要影響因子動態(tài)預(yù)測圖(圖2)可知，在各項影響因素的2個水平范圍內(nèi)，菌體濃度、轉(zhuǎn)化時間和起始pH均對菌株DL28轉(zhuǎn)化GABA為正效應(yīng)，即隨菌體濃度的增加、起始pH的提高及轉(zhuǎn)化時間的延長，GABA含量呈增加趨勢。

谷氨酸脫羧酶(glutamic acid decarboxylase，GAD，EC 4.1.1.15)是一種磷酸吡哆醛(PLP)類酶，是生物體催化L-谷氨酸或鈉鹽脫羧反應(yīng)生成非蛋白質(zhì)組成的天然氨基酸GABA的唯一酶［24－25］。因此，GAD的含量和活性對GABA產(chǎn)量的影響最重要，該研究中菌體濃度、轉(zhuǎn)化時間及起始pH對菌株DL28轉(zhuǎn)化產(chǎn)GABA的產(chǎn)量具有顯著影響也說明了這一點，如菌體濃度對應(yīng)GAD的含量，而轉(zhuǎn)化時間和起始pH是對應(yīng)GAD活性。據(jù)研究報道，Candida parapsilosis GPT-5-11合成γ-氨基丁酸的最佳pH為6.5和37℃發(fā)酵時間為48 h［26］;酵母菌突變菌株的最佳接種量為4%、起始pH為5.5及37 ℃培養(yǎng)時間為4 d［27］;L.plantarum LpL328 的固定化細(xì)胞在菌體濃度為6%、pH為4.7及37℃培養(yǎng)20 h時GABA最高催化產(chǎn)量為 0.96 g/L［28］;Lactococcus lactis 1.009 的細(xì)胞在菌體濃度為10 g/L、pH 4.7的醋酸緩沖液及50℃下反應(yīng)60 h 時 GABA 的積累量可達(dá) 19.1 g/L，轉(zhuǎn)化率為99.9%［29］等。增加菌體濃度和延長轉(zhuǎn)化時間對GABA產(chǎn)量具有促進(jìn)作用，但乳酸菌的GAD的最適起始pH相對低于酵母菌，原因由菌株特性所致。

用上述方程對轉(zhuǎn)化液GABA含量最大預(yù)期值及合意性(圖2)進(jìn)行分析，可知欲得到較高的含GABA的轉(zhuǎn)化液，需提高菌體濃度和起始pH，并延長轉(zhuǎn)化時間。

表3 偏回歸系數(shù)及顯著性檢驗

3 結(jié)論

利用PB試驗設(shè)計對S.cerevisiae DL28轉(zhuǎn)化產(chǎn)GABA的菌體濃度、底物濃度、轉(zhuǎn)化溫度等6個相關(guān)因素進(jìn)行主要影響因子的篩選，發(fā)現(xiàn)在各項影響因素的2個水平范圍內(nèi)，菌體濃度、轉(zhuǎn)化時間和起始pH均對菌株DL28轉(zhuǎn)化GABA為正效應(yīng)，即隨著菌體濃度的增加、起始pH的提高及轉(zhuǎn)化時間的延長，GABA含量呈增加趨勢，其他相關(guān)因素沒有顯著效應(yīng)。通過動態(tài)預(yù)期圖直觀地了解到各因素的效應(yīng)趨勢及大致水平范圍，為進(jìn)一步優(yōu)化酵母菌轉(zhuǎn)化產(chǎn)GABA的工藝參數(shù)提供了重要的理論依據(jù)與實踐基礎(chǔ)。

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