核桃炭疽病生防菌yb33的鑒定及其次生代謝物特性分析

韓長(zhǎng)志，霍 超

（西南林業(yè)大學(xué)a.林學(xué)院；b.云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224）

核桃炭疽病生防菌yb33的鑒定及其次生代謝物特性分析

韓長(zhǎng)志a,b，霍 超a,b

（西南林業(yè)大學(xué)a.林學(xué)院；b.云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224）

為了較好地利用生防菌防治核桃炭疽病，采用土壤稀釋平板法和對(duì)峙培養(yǎng)法，從核桃根際土壤中分離篩選獲得了yb23、yb31、yb33、yb34菌株（其對(duì)核桃炭疽病菌的抑菌活性均在60%以上），然后對(duì)其中生防效果較好的菌株yb33進(jìn)行了形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)鑒定，并對(duì)該菌次生代謝產(chǎn)物的性質(zhì)進(jìn)行了分析。鑒定結(jié)果表明：菌株yb33為芽孢桿菌屬細(xì)菌，其與Bacillus axarquiensis的親緣關(guān)系最近。分析結(jié)果表明：不同濃度yb33無(wú)菌濾液的抑菌效果間具有明顯的差別，其在65 ℃及其以下溫度條件下的熱穩(wěn)定性較好。

核桃炭疽病菌；yb33；枯草芽孢桿菌；生物防治

云南省的核桃生產(chǎn)在全國(guó)核桃生產(chǎn)中占有非常重要的地位，其核桃栽培面積和產(chǎn)量約占全國(guó)的1/3[1]。種植核桃歷史較為悠久的大理州漾濞彝族自治縣作為云南省五個(gè)“全國(guó)經(jīng)濟(jì)林核桃之鄉(xiāng)”之一，其核桃產(chǎn)量、品質(zhì)均居云南省首位[1]。然而，由膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides引起的核桃炭疽病是近幾年核桃樹(shù)遭到的重要真菌病害，嚴(yán)重地危害著當(dāng)?shù)睾颂耶a(chǎn)業(yè)健康、有序、快速的發(fā)展。據(jù)近3年對(duì)漾濞核桃產(chǎn)區(qū)核桃炭疽病的病害調(diào)查結(jié)果，病害嚴(yán)重的年份該病發(fā)生率高達(dá)90%以上，這給當(dāng)?shù)睾颂疑a(chǎn)造成了較為嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

核桃生產(chǎn)中對(duì)于核桃炭疽病的防治主要依賴于化學(xué)藥劑，而病原菌的抗藥性逐年顯現(xiàn)[2-4]，特別是該病害發(fā)展迅速，急需開(kāi)發(fā)適用于生產(chǎn)的優(yōu)良藥劑[5]。目前，學(xué)術(shù)界對(duì)于化學(xué)藥劑的替代品生防菌的研究報(bào)道逐年增加，對(duì)生防菌的篩選與研究多集中于農(nóng)作物[6]、蔬菜[7]等領(lǐng)域，而對(duì)于木本油料作物生防菌的研究報(bào)道卻較少。前人在對(duì)核桃炭疽病生防菌的篩選研究中發(fā)現(xiàn)，短芽孢桿菌Bacillus brevisPF-2對(duì)C. gloeosporioides的抑菌率最高（88.47%），還有3株均屬于芽孢桿菌屬的細(xì)菌對(duì)核桃炭疽病菌也有83%以上的抑菌率[8]。盡管如此，由于生防菌具有地域局限性特點(diǎn)[9]，對(duì)于能用以防治云南省核桃炭疽病的生防菌的研究卻尚未見(jiàn)諸報(bào)道。為此，以來(lái)自于當(dāng)?shù)氐暮颂姨烤也【鳛橹甘揪?，從核桃種植地根際土樣中分離出拮抗效果較好的生防細(xì)菌，并對(duì)其次生代謝物的特性進(jìn)行了研究，以期為當(dāng)?shù)睾颂姨烤也〉纳锓乐翁峁┚曩Y源和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

土壤樣本：選擇發(fā)病程度不同的核桃根際周圍的土壤，鏟去10 cm的表土層，取10～15 cm處的土樣50～200 g，共取土壤樣本8份。

供試菌株：西南林業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存的核桃炭疽病菌菌株yb-1。

培養(yǎng)基：葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）用于核桃炭疽病菌的培養(yǎng)，肉湯蛋白胨固體培養(yǎng)基（NA）用于土壤細(xì)菌的分離培養(yǎng)，馬鈴薯葡萄糖＋0.5%牛肉浸膏培養(yǎng)基用于分離細(xì)菌發(fā)酵液的培養(yǎng)。

1.2 土壤生防菌的分離與純化

采用土壤稀釋平板法進(jìn)行分離[10]，置于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，平板劃線進(jìn)行純化，每處理重復(fù)4次，獲得菌株，并進(jìn)行編號(hào)，然后置于4 ℃的冰箱中保存以備用。將分離得到的菌株以“yb”為開(kāi)頭字符進(jìn)行編號(hào)，“yb”字符后的前一個(gè)編碼表示土壤樣本的編號(hào)，后一個(gè)編碼表示菌株的編號(hào)，如yb11，即從1號(hào)土樣中分離到的1號(hào)菌株。將分離到的菌株經(jīng)純化后轉(zhuǎn)入試管斜面保存以備用。

1.3 生防菌株的篩選

采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法[11]進(jìn)行篩選，根據(jù)處理病原菌生長(zhǎng)直徑和對(duì)照病原菌生長(zhǎng)直徑的差異來(lái)計(jì)算抑菌率，計(jì)算公式為：

抑菌率(%)＝(對(duì)照組菌落直徑－處理組菌落直徑)/對(duì)照組菌株菌落直徑×100。

先對(duì)所獲得的全部菌株進(jìn)行初次篩選，病原菌和土壤分離菌的比例為1∶4，記錄抑菌圈的大小，篩選出效果較好的菌株；然后對(duì)初次篩選出的效果較好的菌株進(jìn)行第二次篩選即復(fù)篩，病原菌和土壤分離菌的比例為1∶2，記錄抑菌圈的大小，篩選出對(duì)病原菌作用效果明顯且穩(wěn)定的生防菌株，以備后續(xù)研究之用。

1.4 對(duì)yb33的形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定

將在NA平板上培養(yǎng)24 h的菌株yb33裝片，在生物顯微鏡尼康E800下觀察菌株的微觀形態(tài)，并測(cè)定其大小，根據(jù)革蘭氏染色呈現(xiàn)出的顏色和形態(tài)特征，依據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行鑒定[12-13]。

挑取以NA培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌落，將其置于肉湯蛋白胨培養(yǎng)液中過(guò)夜培養(yǎng)，過(guò)濾，提取菌 株 yb33的 DNA。PCR 反 應(yīng) 體 系 為 50 μL，其 中，2×MasterMix 25 μL，DNA 5 μL， 上 游引物（27f）、下游引物（1492r）均為 5 μL，ddH2O 為 10 μL。 通 用 引 物 分 別 為 27f（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’） 和 1492r（5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’）；反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 2 min，72 ℃延伸5 min，35個(gè)循環(huán)。

利用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，選擇具有特異性條帶的樣品送至昆明碩陽(yáng)科技公司測(cè)序。將所測(cè)序列與NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）數(shù)據(jù)庫(kù)中已報(bào)道的序列進(jìn)行Blastn比對(duì)，確定其分類地位。同時(shí)，利用ClustalX[14]對(duì)已經(jīng)報(bào)道的枯草芽孢桿菌及yb33進(jìn)行多重比對(duì)分析，再利用MEGA 5.2.2軟件[15]構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，即采用鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，采用p-distance模型計(jì)算各分支之間的距離，采用自舉法，重復(fù)1 000次，對(duì)系統(tǒng)的可信度進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 yb33次生代謝產(chǎn)物的提取

將在NA上培養(yǎng)24 h的yb33接種于馬鈴薯葡萄糖＋0.5%牛肉浸膏培養(yǎng)液中，于轉(zhuǎn)速為200 r/min、溫度為30 ℃的搖床上振蕩培養(yǎng)48 h，取適量發(fā)酵液，室溫下以轉(zhuǎn)速為4 800 r/min離心20 min，獲得上清液，之后用孔徑為0.2 μm的細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾，即得無(wú)菌濾液，將無(wú)菌濾液置于4 ℃的冰箱中保存以備用[16]。

1.6 yb33次生代謝產(chǎn)物抑菌活性及熱穩(wěn)定性的測(cè)定

采用平板稀釋法，將yb33無(wú)菌濾液分別以1/10、1/50、1/100倍的比例與40 ℃左右的PDA培養(yǎng)基均勻混合，以未加無(wú)菌濾液的PDA作為對(duì)照。各平板中央接種直徑為6 mm的核桃炭疽菌菌絲塊，28 ℃下培養(yǎng)，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)。待對(duì)照菌落長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿時(shí)，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，并計(jì)算抑菌率。

在30、45、65、85、100、121 ℃的條件下對(duì)yb33無(wú)菌濾液分別處理10、30、60 min，與40 ℃左右的PDA培養(yǎng)基混勻，制成含有濃度為1/10的無(wú)菌濾液的PDA平板，以無(wú)菌水和未經(jīng)熱處理的無(wú)菌濾液作為對(duì)照，其處理方法同上。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤生防菌的分離和篩選

經(jīng)初篩總共獲得33個(gè)菌株，其中抑菌率超過(guò)60%的菌株有7個(gè)，其編號(hào)分別為yb21、yb42、yb23、yb31、yb33、yb34、yb41；將上述初篩出的菌株進(jìn)行復(fù)篩，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株yb33、yb31的抑菌效果最好，可達(dá)80%以上，其與病原菌相接處有很明顯的拮抗菌帶，抑菌效果明顯且穩(wěn)定。土壤拮抗菌株初篩與復(fù)篩的抑菌效果詳見(jiàn)表1與圖1。

2.2 yb33的鑒定及遺傳關(guān)系分析

對(duì)yb33的形態(tài)特征進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖2A～C所示。圖2A～C顯示，菌落表面粗糙不透明，呈污濁的白色或微黃色，該菌落呈桿狀，有芽孢，單個(gè)細(xì)胞的大小為（0.7～0.8）×（2.0～3.0）mm，經(jīng)革蘭氏染色呈陽(yáng)性，著色均勻。

表1 土壤拮抗菌株初篩與復(fù)篩的抑菌效果Table 1 Antifungal effects of antagonistic strains obtained by preliminary screening and second screening

圖1 yb33和yb31的抑菌效果Fig. 1 Antifungal effects of yb33 and yb31

圖2 yb33形態(tài)特征的鑒定結(jié)果Fig. 2 Identification result of yb33 based on morphological characteristics

依據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[13]對(duì)該菌株進(jìn)行鑒定，同時(shí)對(duì)其16S RNA序列進(jìn)行克隆、測(cè)序等分子生物學(xué)鑒定，通過(guò)NCBI比對(duì)分析，明確了yb33與枯草芽孢桿菌屬包括Bacillus mojavensisstrain SWFU16、Bacillus tequilensisstrain YJ-S4、Bacillus mojavensisstrain 263XG8等菌種在內(nèi)的眾多菌株相一致，此外，結(jié)合已經(jīng)報(bào)道的芽孢桿菌序列[17]進(jìn)行遺傳關(guān)系分析，結(jié)果（如圖3）表明，諸多已經(jīng)報(bào)道的枯草芽孢桿菌屬可以分為六大類，其中，yb33與Bacillus axarquiensisstrain 261MG2的親緣關(guān)系最近，屬于A類。

圖3 yb33與芽孢桿菌屬其他菌之間的遺傳關(guān)系分析Fig. 3 Genetic relationships analysis of yb33 strain and other strains in Bacillus

2.3 yb33次生代謝產(chǎn)物的抑菌作用

與yb33菌株具有抑菌作用相似，其無(wú)菌濾液對(duì)核桃炭疽病菌也有較好的抑制作用，能減慢病原菌菌絲的生長(zhǎng)，濃度為0.1時(shí)，抑菌效果高達(dá)92.86%，然而，隨著濃度的減小，抑菌效果明顯減弱，濃度為0.02時(shí)，抑菌率為29.76%，濃度減到0.01時(shí)，抑菌率只有14.29%，上述結(jié)果表明，不同濃度無(wú)菌濾液的抑菌效果之間具有明顯差別，推測(cè)無(wú)菌濾液中含有抑制病原菌生長(zhǎng)的拮抗物質(zhì)（如圖4所示）。

圖4 不同濃度無(wú)菌濾液對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響Fig. 4 Effect of different concentrations of sterile filtrates on growth of pathogens

2.4 yb33次生代謝產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性

yb33無(wú)菌濾液的抑菌效果在65 ℃及其以下的熱穩(wěn)定性較好，處理10～60 min后，其抑菌效果變化波動(dòng)比較小；而65～100 ℃處理下，其抑菌效果變化波動(dòng)非常大，特別是在121 ℃處理下，其抑菌效果則出現(xiàn)較大的變化（圖5）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，相同溫度不同時(shí)間處理也會(huì)對(duì)抑菌效果產(chǎn)生影響，即隨著處理時(shí)間的增加，其無(wú)菌濾液的抑菌效果則減弱（圖5）。上述結(jié)果表明，yb33無(wú)菌濾液在室溫條件以及較為極端的自然溫度條件下具有較好的熱穩(wěn)定性，具有進(jìn)一步作為生防菌資源的潛力。

圖5 無(wú)菌濾液經(jīng)不同溫度不同時(shí)間處理后的抑菌效果Fig. 5 Antifungal effects of sterile filtrates after treated for different time at different temperatures

3 結(jié)論與討論

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)于生防菌篩選的研究開(kāi)展了大量工作，盡管如此，對(duì)于木本油料作物的重要病害的生防菌的研究報(bào)道卻較為少見(jiàn)[18]，同時(shí)，鑒于生防菌具有較強(qiáng)的地域性特點(diǎn)，本研究采用對(duì)峙培養(yǎng)法對(duì)分離于云南省漾濞縣核桃根際周圍土壤的拮抗核桃炭疽病菌的生防菌進(jìn)行了篩選，結(jié)果顯示，枯草芽胞桿菌屬細(xì)菌yb33對(duì)核桃炭疽病菌具有較好的抑菌效果，其無(wú)菌濾液具有較好的抑菌效果和熱穩(wěn)定性，作為田間生防菌其有進(jìn)一步研究的潛力。

目前研究報(bào)道的生防菌主要包括芽孢桿菌、假單胞桿菌、放射性土壤農(nóng)桿菌和巴氏桿菌等種細(xì)菌，尤以枯草芽胞桿菌屬細(xì)菌居多，如XG-1對(duì)西瓜枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)具有較強(qiáng)的抑制作用[19]，Henu11對(duì)禾谷絲核菌具有較好的抑制作用[6]，N-193對(duì)辣椒炭疽病菌具有明顯的拮抗作用[20]。此外，枯草芽孢桿菌OBS-2對(duì)尖鐮孢香草蘭專化型和腐皮鐮孢菌能產(chǎn)生明顯的拮抗帶，且該菌株較外地菌株（1.936菌株）的生防效果要好[9]，因此，篩選本地枯草芽孢桿菌更具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

此外，對(duì)于云南省漾濞縣核桃的研究還有關(guān)于引種核桃品種嫁接成活率及苗期生長(zhǎng)性狀[21]方面的報(bào)道，而對(duì)于其他省份不同核桃品種的遺傳多樣性[22]也有一些研究報(bào)道，然而，尚缺乏對(duì)于核桃上諸多病害的系統(tǒng)研究以及利用生防菌開(kāi)展某種病害防治的研究報(bào)道，這將成為未來(lái)核桃研究的重要方向。

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Identification of bio-control strain yb33 against walnut anthracnose and analysis of its secondary metabolite characteristics

HAN Chang-zhia,b, HUO Chaoa,b
(a. Key Laboratory of Forest Disaster Warning and Control of Yunnan Province; b. College of Forestry, Southwest Forestry University, Kunming 650224, Yunnan, China)

In order to better utilizing bio-control strains against walnut anthracnose, the strains of yb23, yb31, yb33 and yb34 were isolated by using soil dilution plate method and dual culture method, which had over 60% of the antifungal activity. The yb33 strain with higher antifungal activity was identified from the aspects of morphology and molecular biology, and characteristics of its secondary metabolites were analyzed. The results showed that, yb33 strain belongedBacillus subtilis, and had close genetic relationships withB. axarquiensis.Antifungal effects had significant differences between the yb33 sterile filtrates at different concentrations, and the sterile filtrates had good thermal stability at below 65 ℃.

walnut anthracnose; yb33;Bacillus axarquiensis; bio-control

10.14067/j.cnki.1003-8981.2015.03.011 http: //qks.csuft.edu.cn

2014-10-04

云南省優(yōu)勢(shì)特色重點(diǎn)學(xué)科生物學(xué)一級(jí)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（50097505）；云南省高校林下生物資源保護(hù)及利用科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（2014015）；云南省教育廳科學(xué)研究基金項(xiàng)目（2014Y330）。

韓長(zhǎng)志，講師，博士。E-mail：hanchangzhi2010@163.com

韓長(zhǎng)志,霍 超.核桃炭疽病生防菌yb33的鑒定及其次生代謝物特性分析[J].經(jīng)濟(jì)林研究,2015,33(3):63－67, 74.

S664.1

A

1003—8981(2015)03—0063—05

[本文編校：伍敏濤]