紅葡萄酒中Vitisin A的合成及檢測

閆 衡，韓舜愈，王 波，周小平,*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)中心，甘肅 蘭州 730000）

紅葡萄酒中Vitisin A的合成及檢測

閆 衡1，韓舜愈1，王 波2，周小平2,*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)中心，甘肅 蘭州 730000）

使用錦葵色素-丙酮酸混合溶液作為反應(yīng)液合成錦葵色素衍生花色苷——Vitisin A，研究Vitisin A的高效液相色譜檢測方法，并優(yōu)化檢測條件。初步研究了Vitisin A合成過程中量的變化情況。結(jié)果表明，利用反相高效液相色譜法，采用CAPCELL PAK C18ACR色譜柱，乙腈-水（磷酸調(diào)pH值為1.5）溶液作為流動相，使用紫外檢測器在波長為507 nm條件下對Vitisin A進(jìn)行檢測。使用質(zhì)譜法對Vitisin A進(jìn)行定性分析，將結(jié)果與譜庫信息進(jìn)行對比。該方法同樣適用于檢測葡萄酒中的Vitisin A。

Vitisin A；錦葵色素；葡萄酒；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

葡萄酒是目前世界上產(chǎn)量最大、普及最廣的單糖釀造酒，其質(zhì)量指標(biāo)可分為感官指標(biāo)和理化指標(biāo)兩大類。其中，色澤是葡萄酒重要感官指標(biāo)之一?；ㄉ帐瞧咸丫浦兄饕娘@色物質(zhì)[1-2]。近年來研究表明，葡萄酒中的單體花色苷主要包括矢車菊色素、飛燕草色素、芍藥色素、牽?；ㄉ睾湾\葵色素[3]。葡萄酒陳釀過程中可以促進(jìn)酒中雜醇類物質(zhì)的分解，不僅可以減少葡萄酒的青澀味，提升葡萄酒的口感，還有益于人體健康。但是，陳釀時間較長會導(dǎo)致葡萄酒中花色苷的分解。在對陳釀葡萄酒中花色苷的檢測的相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，僅檢測到錦葵色素衍生花色苷Vitisin A的存在[4]。

錦葵色素-3-O-葡萄糖苷又稱二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷，是大多數(shù)葡萄酒的第一特征花色苷[5-6]。其結(jié)構(gòu)如圖1A所示，與其他花色苷相比較，因其無鄰二羥基而抗氧化性最強(qiáng)[7]。故在葡萄酒環(huán)境下，錦葵色素的穩(wěn)定性強(qiáng)于其他單體花色素[8]。隨著酒體發(fā)酵的進(jìn)行，單體錦葵色素葡萄糖苷會與葡萄糖發(fā)酵代謝的中間產(chǎn)物及其他物質(zhì)發(fā)生環(huán)化、加成、聚合等多種反應(yīng)，形成更為穩(wěn)定的呈色物質(zhì)（花色苷衍生物），從而造成酒體顏色產(chǎn)生變化[9]。吡喃花色苷是葡萄酒中主要呈色物質(zhì)之一[10]，包括Vitisins型、甲基吡喃花色苷、酚基吡喃花色苷等[11]。

Vitisin A是Vitisins類物質(zhì)的主要成分，結(jié)構(gòu)如圖1B所示，是在紅葡萄酒發(fā)酵及后熟過程中錦葵色素與烯醇化的丙酮酸反應(yīng)所產(chǎn)生的一類羧基吡喃環(huán)花色苷，反應(yīng)變化如圖1所示[12]。結(jié)構(gòu)的改變使在一定pH值范圍內(nèi)Vitisin A更穩(wěn)定，且更耐受二氧化硫的漂白作用[13-14]。其色澤主要呈現(xiàn)橙紅色，因此使得酒體色澤呈現(xiàn)磚紅色[15]。在葡萄酒釀造及陳釀過程的環(huán)境條件下，Vitisin A要比其他花色苷表現(xiàn)出更深的顏色[16]。此外，與錦葵花色苷相比，Vitisin A對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的清除能力更優(yōu)，有較強(qiáng)的抗氧化能力[17-19]；在對腫瘤壞死因子的抑制作用研究中還發(fā)現(xiàn)，Vitisin A在一定程度上能抑制腫瘤[20]。因此，研究錦葵色素及Vitisin A的分離檢測與合成變化對提高葡萄酒感官品質(zhì)及營養(yǎng)價值具有非常重要的意義。

圖1 錦葵色素及Vitisin A結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)變[12]Fig.1 Structure and conversion of malvidin to vitisin A

目前，國外對Vitisin A的研究較多，主要集中在對葡萄酒中花色苷種類的定性及Vitisin A合成所需的反應(yīng)物質(zhì)及其穩(wěn)定性方面的研究。確定了Vitisin A的結(jié)構(gòu)，并使用液相色譜-質(zhì)譜法及核磁共振法對Vitisin A進(jìn)行定性分析[14]，明確了Vitisin A是錦葵色素與丙酮酸反應(yīng)的生成物，且生成量受反應(yīng)物含量制約[12]。部分研究涉及到了Vitisin A功能活性的研究，但研究并不全面[17-20]。而國內(nèi)針對Vitisin A的學(xué)術(shù)報道鮮少出現(xiàn)。

國內(nèi)外對于花色苷的檢測標(biāo)準(zhǔn)并未有明確規(guī)定。實(shí)驗(yàn)研究中常用方法主要有紙層析與薄層板層析[21-22]、紫外-可見光譜法[23]、高效液相色譜法[24-25]、花色苷水解法等[26]。其中，高效液相色譜法最為常見，可用于花色苷的定性和定量測定，但由于目前商業(yè)上可提供的花色苷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)有限，所以高效液相色譜多與質(zhì)譜聯(lián)用進(jìn)行花色苷的定性分析[3]。

本實(shí)驗(yàn)使用錦葵色素純?nèi)芤?，針對Vitisin A合成過程中的變化進(jìn)行研究，采用CAPCELL PAK C18ACR色譜柱、二極管陣列檢測器、反相色譜條件的高效液相色譜分析技術(shù)，對Vitisin A分離檢測方法進(jìn)行研究，在不同紅葡萄酒中同時分離錦葵色素-3-O-葡萄糖苷及Vitisin A。并通過檢測錦葵色素-3-O-葡萄糖苷與丙酮酸反應(yīng)生成Vitisin A含量以研究Vitisin A的變化規(guī)律。建立了檢測葡萄酒中Vitisin A含量的方法，并討論了Vitisin A合成過程中的變化趨勢，為葡萄酒中花色苷的進(jìn)一步研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

樣品酒來源于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)自種葡萄采用傳統(tǒng)釀造工藝釀成，釀成后4 ℃保藏。葡萄品種及釀造時間如表1所示。

表1 葡萄酒樣品信息Table1 Information about the sample grape wines used in this study

錦葵色素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%） 美國Chromadex公司；蒸餾水 廣州屈臣氏食品飲料有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜純） 德國Merck公司。

Ultimate 3000型雙三元二維液相色譜儀 美國Dionex公司；1290-6460超高效液相色譜儀-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司；CP224S型分析天平 德國Sartorius公司；100～1 000 μL移液器、20～200 μL移液器德國Witeg公司；0.45 μm有機(jī)相濾膜 上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制與樣品處理

標(biāo)準(zhǔn)貯備液配制：準(zhǔn)確稱量10.0 mg錦葵色素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，用V（甲醇）∶V（水）=1∶1（磷酸調(diào)pH 1.5）溶液溶解并定容，充分搖勻，配制成1 000 mg/L錦葵色素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)儲備液，4 ℃冷藏保存。

標(biāo)準(zhǔn)工作液配制：將1 000 mg/L錦葵色素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)貯備液準(zhǔn)確量取1.5 mL，用V（甲醇）∶V（水）= 1∶1（磷酸調(diào)pH 1.5）溶液定容至10 mL容量瓶中，配制成150 mg/L錦葵色素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)工作液，4 ℃條件下冷藏待用。

Vitisin A合成反應(yīng)液配制：準(zhǔn)確量取150 mg/L錦葵色素標(biāo)準(zhǔn)工作液5 mL，添加20 μL丙酮酸，使用V（甲醇）∶V（水）=1∶1（磷酸調(diào)pH 2.0）溶液定容至10 mL，于室溫條件下避光放置反應(yīng)。

樣品處理：葡萄酒樣品經(jīng)0.45 μm膜過濾后直接進(jìn)樣分析。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)條件

液相色譜條件：色譜柱：CAPCELL PAK C18ACR（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相：A為乙腈-水（60∶40，V/V）；B為乙腈-水（5∶95，V/V）（均使用磷酸調(diào)pH 1.5）；進(jìn)樣體積：10 μL；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測波長：507 nm；梯度洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫程序Table2 Gradient elution program

使用該條件定期對反應(yīng)液進(jìn)行檢測，當(dāng)單體系反應(yīng)液色譜圖中出現(xiàn)第2物質(zhì)峰時表明有新物質(zhì)生成，采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對反應(yīng)溶液進(jìn)行定性分析，將結(jié)果同葡萄與葡萄酒中花色苷高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的分子離子與碎片離子峰譜庫信息[9]進(jìn)行比對，確定反應(yīng)生成物性質(zhì)。

質(zhì)譜條件：正離子掃描（m/z 100～600），毛細(xì)管電壓：3.50 kV；裂解電壓：125 V；鞘氣溫度：350 ℃；鞘氣流量：11 L/min；脫溶劑氣溫度：300 ℃；脫溶劑氣流量：7 L/min。

1.3 數(shù)據(jù)處理

花色苷含量采用峰面積表示法，以色譜圖中花色苷響應(yīng)峰面積值表征花色苷含量，進(jìn)行同種花色苷含量的比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 Vitisin A的合成及定性

由錦葵色素溶液與丙酮酸溶液組成反應(yīng)體系合成Vitisin A，反應(yīng)液在0、7、14、21、28、35、42、49、56、63、75、86、176 d后分別進(jìn)行檢測，其檢測結(jié)果顯示，反應(yīng)14 d后出現(xiàn)新物質(zhì)峰，其相應(yīng)面積隨時間延長而增加，反應(yīng)176 d后檢測得最大值。圖2為反應(yīng)液反應(yīng)初期與實(shí)驗(yàn)結(jié)束時檢測所得色譜圖?？梢悦黠@看出，新物質(zhì)出峰時間晚于錦葵色素，約為21.3 min；錦葵色素含量顯著減少，其響應(yīng)峰面積由最初的38.48 mAU·min降至11.65 mAU·min。由于該反應(yīng)體系初期僅存在錦葵色素與反應(yīng)前體丙酮酸，故該新物質(zhì)很有可能為錦葵色素衍生花色苷Vitisin A。

對反應(yīng)液進(jìn)行質(zhì)譜分析，圖2中峰2的質(zhì)譜圖如圖3所示。該物質(zhì)分子離子[M＋H]＋為m/z 561.1，碎片離子為m/z 398.9，是由分子離子失去了一個質(zhì)量數(shù)為m/z 162.2的碎片（脫水六碳糖基）而得，在本系統(tǒng)中，很有可能為葡萄糖基。檢測結(jié)果同葡萄與葡萄酒中花色苷高效液相色譜-質(zhì)譜的分子離子與碎片離子峰譜庫信息相符，故判定，生成物為Vitisin A。

圖2 反應(yīng)液色譜圖Fig.2 Chromatogram of the reaction solution

圖3 Vitisin A ESI＋-MSS圖及結(jié)構(gòu)Fig.3 ESI+-MS spectrum and structure of vitisin A

根據(jù)質(zhì)譜信息推測，質(zhì)量數(shù)為m/z 162.2的碎片離子可能為葡萄糖基，Vitisin A斷裂過程中與葡萄糖基相連的鍵更易斷裂，裂解為一碎片離子與一葡萄糖基，裂解圖如圖4所示。

圖4 Vitisin A裂解圖Fig.4 Cleavage map of vitisin A

2.2 高效液相色譜條件選擇

花色苷為極性化合物，溶于極性溶劑，在低pH值條件下保持相對穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)選用CAPCELL PAK C18ACR色譜柱，乙腈、水混合液作為流動相可對花色苷進(jìn)行較好分離，且重復(fù)性較好。因此，本實(shí)驗(yàn)在上述色譜條件基礎(chǔ)上，對流動相pH值及檢測波長進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

2.2.1 流動相pH值的選擇

在pH值較高時（pH＞2.5），花色苷中常有非花色烊陽離子形式存在的干擾，而在pH為1.5時，約96%的花色苷呈紅色花色烊陽離子結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)對比了流動相pH 1.5與pH 2.5時2014年赤霞珠釀造酒中各花色苷出峰情況，色譜圖及相鄰峰分離度如圖5、表3所示。

分離度和拖尾因子計算如公式（1）、（2）所示：

式（1）中：Rs為分離度；tR1、tR2分別為相鄰峰1、峰2的保留時間；W1、W2分別為峰1、峰2的基線寬度。

式（2）中：T為拖尾因子；h為峰高；W0.05h為0.05峰高處的峰寬：d1為峰頂點(diǎn)至峰前沿之間的寬度。

圖5 不同pH值條件下葡萄酒色譜圖Fig.5 Chromatograms of grape wine at different pH values

表3 不同pH值條件下相鄰峰分離度及拖尾因子Table3 The resolution and tailing factor of adjacent peaks at different pH values

由圖5和表3可見，當(dāng)流動相pH 1.5時赤霞珠葡萄酒中所有色譜峰峰寬均小于流動相pH 2.5條件下的色譜峰，分離度較高。同時，流動相pH 1.5時，色譜峰峰形更優(yōu)，拖尾因子較小。因此本實(shí)驗(yàn)選擇在流動相pH 1.5條件下對花色苷進(jìn)行分離。

2.2.2 Vitisin A檢測波長優(yōu)化

使用DIONEX UltimateTM3000二維液相色譜對反應(yīng)液進(jìn)行全波段掃描，光電二極管陣列檢測器掃描范圍為200～700 nm，得時間（X軸），檢測波長（Y軸）Vitisin A光譜吸收等高圖如圖6所示。由圖6可以看出，Vitisin A有4 個最大吸收峰，分別為204、235、300 nm。最高吸收峰出現(xiàn)在檢測波長204 nm處，但該區(qū)域低紫外檢測區(qū)域，檢測過程中基線不穩(wěn)，次高峰出現(xiàn)在檢測波長為235 nm時，易受到干擾物質(zhì)影響且噪音大，故選擇第3高峰對應(yīng)檢驗(yàn)波長507 nm。

圖6 Vitisin A紫外-可見吸收圖譜Fig.6 UV-Vis spectra of vitisin A

2.3 樣品中Vitisin A的檢測

圖7 3 種葡萄酒樣品色譜圖Fig.7 Chromatograms of three kinds of grape wine

用上述方法對3 種供試葡萄酒樣進(jìn)行了檢測，如圖7所示。結(jié)果顯示，葡萄酒中均檢測出Vitisin A，且與其他花色苷基本分離，且重復(fù)性良好。表明此方法可以用于對葡萄酒中的Vitisin A進(jìn)行直接檢測。3 種葡萄酒中錦葵色素及Vitisin A響應(yīng)面積值如表4所示，其中，赤霞珠葡萄酒中錦葵色素及Vitisin A含量均為最高，黑比諾葡萄酒與蛇龍珠葡萄酒中較少。由此推斷，Vitisin A的含量可能是與葡萄酒中錦葵色素含量多少有關(guān)。

表4 3 種葡萄酒中錦葵色素及Vitisin A響應(yīng)面積值Table4 Response area values of malvidin and vitisin A in three kinds of grape wine mAU·min

2.4 Vitisin A合成過程中的變化規(guī)律

圖8 花色苷含量變化趨勢圖Fig.8 Time course of anthocyanin formation/depletion during the synthesis of vitisin A

自反應(yīng)液配制起定期對反應(yīng)液中錦葵色素與Vitisin A進(jìn)行檢測，兩種花色苷檢測結(jié)果及含量變化趨勢如圖8所示。伴隨著反應(yīng)物錦葵色素含量的大量減少，生成物Vitisin A的含量顯著升高，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時Vitisin A生成量響應(yīng)面積為2.45 mAU·min。反應(yīng)物錦葵色素含量顯著減少，由38.48 mAU·min降至11.78 mAU·min。

從變化趨勢來看，2 種花色苷趨勢相同，方向相反。兩種花色苷含量變化前期較快，Vitisin A大量合成，與此同時，錦葵色素迅速減少；隨著時間推移，含量變化速率不斷減小，Vitisin A生成速度及錦葵色素減少速度均降低，可能是由于反應(yīng)液中錦葵色素及丙酮酸的濃度降低，制約了Vitisin A的合成；第10周后，Vitisin A含量變化極小，合成速率接近為0。與此同時，錦葵色素的含量仍然不斷減小，是因?yàn)殄\葵色素在該環(huán)境體系下穩(wěn)定性差，不斷分解為其他物質(zhì)。從總變化量上來看，共消耗錦葵色素26.70 mAU·min，Vitisin A總生成量為2.45 mAU·min，比值約為0.1，以峰面積增減趨勢可以看出，每生成1 mAU·min Vitisin A需消耗約10 mAU·min錦葵色素。

2.5 不同年份赤霞珠葡萄酒中錦葵色素及Vitisin A含量的檢測

圖9 花色苷響應(yīng)面積值隨陳釀時間的變化趨勢圖Fig.9 Time course of anthocyanins formation/depletion during the aging of red wine

對酒中錦葵色素及Vitisin A進(jìn)行檢測，錦葵色素與Vitisin A的響應(yīng)面積值隨陳釀時間的變化趨勢如圖9所示。錦葵色素在陳釀初期含量大量減少，在陳釀2a的葡萄酒中含量幾乎為0。而Vitisin A含量則呈現(xiàn)先增長后降低的趨勢，在陳釀2a的葡萄酒中檢測到Vitisin A含量達(dá)最大值。在酒體中幾乎不存在錦葵色素時仍能檢測到Vitisin A的存在，表明Vitisin A的穩(wěn)定性強(qiáng)于錦葵色素。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)使用由錦葵色素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)工作液與丙酮酸溶液配制而成的混合反應(yīng)液，合成錦葵色素衍生花色苷Vitisin A。并在使用高效液相色譜儀，采用CAPCELL PAK C18ACR色譜柱，乙腈-水（磷酸調(diào)pH值為1.5）溶液作為流動相，使用紫外檢測器在檢測波長為507 nm條件下對反應(yīng)液及葡萄與葡萄酒中Vitisin A與其他花色苷進(jìn)行檢測，使用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對Vitisin A進(jìn)行定性，初步建立了高效液相色譜檢測葡萄酒中Vitisin A的方法，并在實(shí)際樣品中得以驗(yàn)證。通過對合成過程中錦葵色素及Vitisin A的檢測，分析了Vitisin A合成過程中的變化趨勢，以峰面積變化趨勢可以判定，Vitisin A的生成量及生成速率受錦葵色素及丙酮酸含量制約，其生成量與錦葵色素消耗量響應(yīng)峰面積之比約為1∶10。在對陳釀時間不同的葡萄酒中錦葵色素與Vitisin A的檢測實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，Vitisin A含量在酒體中先增加后減少，其穩(wěn)定性強(qiáng)于錦葵色素。

本實(shí)針對葡萄酒中錦葵色素及Vitisin A的研究，為檢測葡萄酒中單體花色苷及其衍生色素的檢測分析提供了有力的證據(jù)，為今后研究葡萄酒中花色苷的進(jìn)一步研究做出貢獻(xiàn)。

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Synthesis and Detection of Vitisin A in Red Grape Wine

YAN Heng1, HAN Shunyu1, WANG Bo2, ZHOU Xiaoping2,*
(1. College of Food Science and Engineering, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China; 2. Central Laboratory of Technical Center, Gansu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Lanzhou 730000, China)

This study aimed to develop an HPLC method for detecting vitisin A in red grape wine under optimized testing conditions. Malvidin-pyruvate mixed solution was used as the reaction liquid to synthesize vitisin A derived from malvidin. The preliminary study demonstrated the quantitative changes of vitisin A during the synthesis process. The optimal chromatographic conditions for vitisin A separation were determined by using a CAPCELL PAK C18ACR acidproof column with acetonitrile-water (adjusted to pH 1.5 with phosphoric acid) as the mobile phase, and the UV detector wavelength was set at 507 nm. Mass spectrometry was used to conduct the qualitative analysis of vitisin A, and the results were compared with those from the mass spectral library. The method is suitable for detecting both synthetic and natural vitisin A in red grape wine.

vitisin A; malvidin; grape wine; high performance liquid chromatography-mass spectrometry-mass spectrometry (HPLC-MS-MS)

TS262.6

A

1002-6630（2015）20-0139-06

10.7506/spkx1002-6630-201520026

2014-12-05

質(zhì)檢行業(yè)公益性科研專項(xiàng)（201310071）

閆衡（1989—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槠咸丫粕?。E-mail：yanheng89@126.com

*通信作者：周小平（1965—），男，高級工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称匪幤分杏卸居泻ξ镔|(zhì)檢驗(yàn)檢測。E-mail：zhxp1123@163.com