超聲波輔助酸性緩沖液浸提木棗多糖的工藝優(yōu)化

李環(huán)宇 王 敏 李五霞 王曉琴 杜麗娟 冀曉龍（.西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 700；.上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物學院，上海 000）

木棗（Zizyphus jujubacv.Muzao）為鼠李科植物棗的果實，盛產(chǎn)于山西省呂梁地區(qū)和陜西省榆林地區(qū)，作為中草藥被廣泛使用。棗中富含糖類、皂苷、生物堿等多種生物活性物質(zhì)［1］。研究證實，棗多糖具有抗腫瘤［2］、抗氧化［3］、調(diào)節(jié)機體免疫力［4］等功效。

近年來，人們圍繞木棗多糖的抗小鼠運動疲勞活性［5，6］展開了深入細致的研究，而木棗多糖的提取是對其功能進行研究的基礎(chǔ)，目前專門針對木棗多糖提取工藝優(yōu)化的報道還比較少。酶法和水提法是木棗多糖提取的常規(guī)方法［5－7］，然而它們均存在耗能大、時間長、效率低等缺點，亟需得到改進優(yōu)化。楊春等［8］采用超聲波輔助傳統(tǒng)水浸提法提取木棗多糖，但該研究料液pH取值范圍局限于偏中性和堿性，沒有考慮酸性條件對多糖提取效果的影響。樊君等［9］研究發(fā)現(xiàn)以緩沖液作為提取劑較傳統(tǒng)水提法在動力學上占優(yōu)勢，提取率也較高。所以本試驗擬采用檸檬酸鹽緩沖液作為提取溶劑，利用單因素試驗和響應面法優(yōu)化木棗多糖的超聲波輔助提取工藝，旨在為木棗多糖的進一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

木棗：陜西省榆林市佳縣；

檸檬酸、檸檬酸鈉：分析純，天津市博迪化工有限公司；

重蒸酚：分析純，北京索萊寶科技有限公司；

濃硫酸：分析純，四川西隴化工有限公司；

乙醇：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

數(shù)控超聲波清洗器：KQ－700DE型，昆山市超聲儀器有限公司；

紫外—可見分光光度計：721型，上海光譜儀器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：SHZ－Ⅲ型，上海亞榮生化儀器廠；

低速離心機：KDC－40型，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；

精密pH計：HS－3C型，上海大普儀器有限公司；

真空冷凍干燥機：ZL－1型，上海醫(yī)療器械高等?？茖W校試驗廠。

1.3 方法

1.3.1 超聲波輔助檸檬酸鹽緩沖溶液浸提木棗多糖工藝

棗粉→加入檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖溶液→超聲波輔助提取→離心→濃縮→脫蛋白→透析→濃縮→無水乙醇沉淀→凍干→木棗多糖

1.3.2 操作要點

（1）樣品預處理：選擇全熟期的木棗鮮果，剔除殘次果，清洗、瀝干后人工去核、60℃干燥處理，粉碎后過60目篩，再經(jīng)80%乙醇回流脫脂后風干，得到的棗粉密封保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）緩沖溶液的配制：分別配制0.1mol/L的檸檬酸及檸檬酸鈉溶液，并按比例配成不同pH的緩沖液。

（3）離心：轉(zhuǎn)速為3 500r/min，時間10min。

（4）濃縮：采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，溫度45℃，將提取液處理至原體積的1/3。

（5）脫蛋白：采用傳統(tǒng)Sevag法脫蛋白，Sevag試劑（氯仿︰正丁醇＝4︰1）與提取液體積比為3︰1，重復操作5次。

（6）透析：采用透析袋（Mw＜3 500Da），流水透析48h。

（7）凍干：首先將樣液置于－60℃冰箱中預凍6h，然后置于冷凍干燥機處理24h。

1.3.3 多糖含量測定 采用苯酚—硫酸法［10］。

1.3.4 多糖提取率計算 為了便于操作，將提取液離心處理，直接測定上清液中的多糖含量。將其與棗粉質(zhì)量的比值定義為多糖提取率，并由此作為多糖提取效果的衡量標準［11］，多糖提取率按式（1）計算：

式中：

W——木棗多糖提取率，%；

ρ——葡萄糖質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——緩沖溶液的體積，mL；

n——測定時多糖液的稀釋倍數(shù)；m——脫脂后棗粉的質(zhì)量，g。

1.3.5 單因素試驗設(shè)計 稱取2.0g棗粉置于小燒杯中，在其他條件相同的情況下，分別以檸檬酸鹽溶液pH、提取溫度、提取時間、超聲波功率、液料比為單因素進行超聲輔助緩沖液浸提木棗多糖試驗，以木棗多糖提取率為響應值，逐個考察不同條件對提取效果的影響。

（1）檸檬酸鹽溶液pH值的選擇：設(shè)定超聲波功率420 W，提取時間50min，提取溫度50℃，液料比25︰1（V︰m），比較pH 分別為3.2，4.0，4.8，5.6，6.4時的多糖提取率。

（2）提取溫度的選擇：設(shè)定超聲波功率420W，提取時間50min，pH 5.6，液料比25︰1（V︰m），比較提取溫度分別為40，50，60，70，80℃時的多糖提取率。

（3）提取時間的選擇：設(shè)定超聲波功率420W，pH 5.6，提取溫度50℃，液料比25︰1（V︰m），比較提取時間分別為10，30，50，70，90min時的多糖提取率。

（4）超聲波功率的選擇：設(shè)定提取溫度50℃，提取時間50min，pH 5.6，液料比25︰1（V︰m），比較超聲波功率分別為280，350，420，490，560W 時的多糖提取率。

（5）液料比的選擇：設(shè)定超聲波功率420W，提取時間50min，提取溫度50℃，pH 5.6，比較液料比分別為10︰1，20︰1，30︰1，40︰1，50︰1（V︰m）時的多糖提取率。1.3.6 響應面試驗設(shè)計 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，篩選對提取率影響顯著的單因素為變量，以多糖提取率為響應值，采用Box－Behnken試驗設(shè)計方法對檸檬酸—檸檬酸鹽緩沖液作為溶劑，超聲波輔助提取木棗多糖工藝進行優(yōu)化。

1.3.7 熱水浸提木棗多糖 以蒸餾水為提取劑，在液料比23.1︰1（V︰m），浸提溫度90℃，浸提時間180min條件下提取木棗多糖。其余操作均與超聲波輔助檸檬酸鹽緩沖溶液浸提木棗多糖一致。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析 采用Excel 2007和SPSS19對單因素試驗中的各因素進行比較分析。采用Design－Expert 8.05b進行響應面試驗設(shè)計和分析。所有試驗均重復3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 檸檬酸鹽溶液pH對多糖提取率的影響 由圖1可知，隨著pH值的升高，木棗多糖提取率呈先降低再升高而后又降低的趨勢；在pH 4出現(xiàn)最小值，在pH 5.6時有明顯最大值。這可能與某些特定基團在特定pH條件下溶解性不同有關(guān)［12］；超聲波作用使某些酶被激活，這些酶參與的細胞生理化學過程，在pH 5.6時協(xié)同作用最強。由于pH對多糖提取率影響不顯著，所以緩沖溶液的pH不作為響應面試驗設(shè)計的因素，選擇固定pH為5.6進行后續(xù)試驗。

圖1 pH對多糖提取率的影響Figure 1 Effect of pH on extraction rate of polysaccharides

圖2 提取溫度對多糖提取率的影響Figure 2 Effect of treatment temperature on extraction rate of polysaccharide

2.1.2 提取溫度對多糖提取率的影響 由圖2可知，在40～70℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，多糖的提取率升高，這可能是因為超聲波引起的空化作用產(chǎn)生的極大壓力造成生物細胞壁破裂，多糖的溶解度升高；超聲波作用激活的某些酶，促使細胞的新陳代謝過程加速，提取率升高［13］；在70℃達到峰值，繼續(xù)升高溫度，多糖提取率出現(xiàn)下降的情況，可能是溫度過高對多糖的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響；也可能是溫度過高使得某些酶活性降低，這些酶參與的生理化學反應減弱，細胞新陳代謝過程減慢導致［14］。因此提取溫度應控制在60～80℃。

2.1.3 提取時間對多糖提取率的影響 由圖3可知，提取時間越長，提取率越高。提取時間在30min以內(nèi)，提取率增高明顯，但是由30min延長至90min多糖的提取率增加緩慢。這可能是由于短時間的超聲處理，介質(zhì)內(nèi)部的空化作用增強，溶劑中瞬間產(chǎn)生的空化氣泡迅速崩潰，溫度瞬間升高，棗粉迅速被擊碎［15］，多糖提取率快速升高。但是超聲波處理時間過長就會產(chǎn)生劇烈的機械剪切作用和引起過多的熱量聚集，使多糖發(fā)生降解，多糖提取率隨之增長緩慢［16］。所以從提高生產(chǎn)效率和節(jié)約成本的角度，選擇提取時間30min為宜。

2.1.4 超聲波功率對多糖提取率的影響 由圖4可知，隨著超聲波功率的增大，多糖提取率先升高而后逐漸降低，420 W時出現(xiàn)峰值。原因可能是：超聲波功率太低時，細胞壁的破碎程度低，多糖溶出慢；隨著功率的提高，產(chǎn)生的熱作用愈強，對液體顆粒的機械作用越明顯，多糖溶出速率變快［17］；但是超聲波功率太大時，一些能使目標物降解的酶被充分釋放出來，造成多糖提取率降低［18］。綜合考慮，選擇超聲波功率350～490W。

圖3 提取時間對多糖提取率的影響Figure 3 Effect of treatment time on extraction rate of polysaccharides

圖4 超聲波功率對多糖提取率的影響Figure 4 Effect of ultrasonic power on extraction rate of polysaccharides

2.1.5 液料比對多糖提取率的影響 由圖5可知，液料比對多糖提取率有顯著影響，隨著液料比增大，木棗多糖提取率先逐漸增高而后逐漸降低，在20︰1（V︰m）時出現(xiàn)峰值。其原因可能是液料比為20︰1（V︰m）時，超聲波在液體中形成最大比例的有效的攪動和流動，達到最高的提取率。隨著液料比增大，樣品溶液的濃度降低，超聲波對懸浮于液體中的微粒的凝聚作用相對減弱，使得提取率降低［14］?？紤]到后續(xù)處理工藝，液料比取10︰1～30︰1（V︰m）為宜。

圖5 液料比對多糖提取率的影響Figure 5 Effect of liquid－solid ratio on extraction rate of polysaccharides

2.2 響應面優(yōu)化試驗

2.2.1 響應面分析因素水平的選擇 根據(jù)Box－Behnken試驗設(shè)計原理，在單因素試驗基礎(chǔ)上，確定在pH 5.6、提取時間30min條件下，以提取溫度、液料比、超聲波功率為自變量，多糖提取率為響應值，設(shè)計三因素三水平試驗，試驗因素與水平見表1，試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

2.2.2 響應面優(yōu)化試驗結(jié)果分析 根據(jù)表2結(jié)果，利用Design Expert 8.05b軟件對所得數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到木棗多糖提取率對提取溫度、液料比和超聲功率的二次多項回歸方程為：

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels used in response surface analysis

表2 Box－Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Experimental design and result for response surface analysis

該回歸模型的方差分析結(jié)果見表3。由表3可知，回歸模型（P＜0.01）達到極顯著水平；失擬項（P＝0.550 1＞0.1）影響不顯著，且相關(guān)系數(shù)R2＝0.996 2，表明實測值與預測值高度相關(guān)。綜上所述，建立的回歸模型擬合度高，可用該模型較好地描述各因素與響應值之間的實際關(guān)系，可用該模型預測木棗多糖的提取工藝條件。從該回歸模型的方差分析還可以看出，3個因素對木棗多糖提取率的影響均不是簡單的線性關(guān)系。除了液料比和超聲功率的交互作用不顯著，其他一次項、交互項和二次項對木棗多糖提取率的影響均達到顯著水平。各因素對多糖提取率的影響程度大小順序為：液料比＞超聲波功率＞提取溫度。

根 據(jù)表2試驗所得的響應面圖見圖6～8。由圖6～8可知，液料比對木棗多糖提取率的影響極為顯著，其繪制的曲線最為陡峭；超聲波功率對木棗多糖的影響次之，而影響最小的則是提取溫度，與提取溫度相比，其曲線較為平滑一些。此外，圖6（b）和圖7（b）中的等高線呈明顯的橢圓形，說明提取溫度和液料比，提取溫度和超聲功率之間均具有非常顯著的交互作用。這些結(jié)果與表3的結(jié)果相一致。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance table

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance table

＊顯著（P＜0.05）；＊＊極顯著（P＜0.01）。

方差來源 自由度 平方和 均方 F值 P 值 顯著性X1 1 8.76 8.77 8.79 0.031 3＊X2 1 295.85 296.08 296.61 ＜0.000 1 ＊＊X3 1 9.50 9.51 9.52 0.027 2 ＊X1X2 1 197.26 197.30 197.65 ＜0.000 1 ＊＊X1X3 1 21.07 21.00 21.04 0.005 8 ＊＊X2X3 1 6.50 6.49 6.51 0.050 9 X12 1 335.72 335.78 336.38 ＜0.000 1 ＊＊X22 1 475.69 475.47 476.32 ＜0.000 1 ＊＊X32 1 22.22 22.16 22.20 0.005 2 ＊＊模型 9 1 296.79 144.09 144.35 ＜0.000 1 ＊＊誤差項 5 4.98 1.00失擬項 3 2.92 0.98 0.95 0.550 1純誤差 2 2.06 1.03所有項14 1 301.76

圖6 提取溫度和液料比交互作用對木棗多糖的提取率影響的響應面圖Figure 6 Response surface plots for the interaction effects between extraction temperature and liquid－solid ratio on the polysaccharides extraction ratio of Zizyphus jujube cv.Muzao

圖7 提取溫度和超聲功率交互作用對木棗多糖的提取率影響的響應面圖Figure 7 Response surface plots for the interaction effects between extraction temperature and ultrasonic power on the polysaccharides extraction ratio of Zizyphus jujube cv.Muzao

圖8 液料比和超聲功率交互作用對木棗多糖的提取率影響的響應面圖Figure 8 Response surface plots for the interaction effects between liquid－solid ratio and ultrasonic power on the polysaccharides extraction ratio of Zizyphus jujube cv.Muzao

2.2.3 模型驗證 通過Design－Expert 8.05b軟件進行數(shù)據(jù)分析確定各因素的最佳取值，Y的最大估計值67.63%，穩(wěn)定點（X1，X2，X3）的編碼值為（－0.16，0.31，－0.06）。與之對應的提取溫度68.4℃、液料比23.1︰1（V︰m）、超聲波功率415.8W?？紤]實際操作的便利，將提取工藝參數(shù)修正為超聲波功率420W，提取溫度68℃，液料比23.1︰1（V︰m），pH 5.6，時間30min，并進行3次平行驗證實驗，實際測得的多糖提取率為（67.38±0.16）%，實測值與預測值相對誤差＜1%，說明回歸方程擬合度高。

2.3 不同提取方法的比較

由表4可知，與熱水浸提法相比，超聲波輔助檸檬酸鹽緩沖溶液浸提木棗多糖可使多糖提取率提高66.41%，效果十分顯著。

3 結(jié)論

本試驗在單因素的基礎(chǔ)上，利用Box－Behnken響應面法對木棗多糖的超聲波輔助酸性緩沖液浸提工藝進行優(yōu)化研究。結(jié)果表明，其提取工藝條件為：以pH為5.6的檸檬酸鹽緩沖溶液為提取劑，液料比23.1︰1（V︰m），超聲波功率420W，提取溫度68℃，時間30min。該條件下木棗多糖的實測提取率為（67.38±0.16）%。與傳統(tǒng)熱水提取法相比，超聲波輔助酸性緩沖溶液浸提木棗多糖能顯著縮短提取時間，降低提取溫度，提高多糖提取率，可為木棗的開發(fā)利用和木棗多糖的研究提供依據(jù)，但是關(guān)于此方法提取的木棗多糖的生物活性還有待于進一步的研究。

表4 不同提取方法的比較Table 4 Comparison of different extraction methods

1 柳楊，羅瑞明.長棗多糖水提工藝參數(shù)的響應面分析及優(yōu)化［J］.食品與機械，2010，26（5）：128～130.

2 Hung Chi－feng，Hsu Bo－yang，Chang Shyh－chung.Antiproliferation of melanoma cells by polysaccharide isolated from Zizyphus jujuba［J］.Nutrition，2012，28（1）：98～105.

3 亓樹艷，王荔，莫曉燕.大棗多糖的提取工藝及抗氧化作用研究［J］.食品與機械，2012，28（4）：117～120.

4 Li Jin－wei，Shan Liang，Liu Yuan－fa，et al.Screening of a functional polysaccharide from Zizyphus Jujuba cv.Jinsixiaozao and its property［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2011，49（3）：255～259.

5 曹犇.木棗多糖抗小鼠運動疲勞的實驗研究［J］.食品科學，2008，29（9）：571～574.

6 池愛平，陳錦屏，熊正英.木棗多糖抗疲勞組分對力竭游泳小鼠糖代謝的影響［J］.中國運動醫(yī)學雜志，2007，26（4）：411～415.

7 曹奔，池愛平.酶法提取木棗多糖對游泳小鼠血清酶的影響［J］.食品科學，2006，27（10）：531～534.

8 楊春，丁衛(wèi)英，鄧曉燕，等.超聲波輔助浸提木棗多糖優(yōu)化工藝的研究［J］.農(nóng)產(chǎn)品加工（學刊），2008（5）：24～26.

9 樊君，尚紅偉，王華敏，等.大棗多糖的提取工藝研究［J］.食品研究與開發(fā)，2002，23（3）：29～31.

10 Li Jin－wei，Liu Yuan－fa，F(xiàn)an Liu－ping，et al.Antioxidant activities of polysaccharides from the fruiting bodies of Zizyphus Jujuba cv.Jinsixiaozao［J］.Carbohydrate Polymers，2011，84（1）：390～394.

11 張利芳.苦瓜多糖的純化及其免疫和抗氧化活性作用［D］.武漢：華中農(nóng)業(yè)大學，2010.

12 劉鵬，程顯好，劉亞麗，等.蟲草菌絲體多糖的提取方法［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33（3）：140～142.

13 Wang Zhao－mei，Cheung Yi－ching，Leung Po－h(huán)ong，et al.Ultrasonic treatment for improved solution properties of a high－molecular weight exopolysaccharide produced by a medicinal fungus［J］.Bioresource Technology，2010，101（14）：5 517～5 522.

14 曾里，夏之寧.超聲波和微波對中藥提取的促進和影響［J］.化學研究與應用，2002，14（3）：245～249.

15 閃俊杰，杜振雷，李青，等.超聲波在化學工業(yè)中的應用［J］.河北工業(yè)科技，2009，26（2）：127～130.

16 楊昱，白靖文，俞志剛.超聲輔助提取技術(shù)在天然產(chǎn)物提取中的應用［J］.食品與機械，2011，27（1）：170～174.

17 Chen Xiao－ping，Wang Wan－xiang，Li Shui－bing，et al.Optimization of ultrasound－assisted extraction of Lingzhi polysaccharides using response surface methodology and its inhibitory effect on cervical cancer cells［J］.Carbohydrate Polymers，2010，80（10）：944～948.

18 潘利華，徐學玲，羅建平.超聲輔助提取水不溶性大豆膳食纖維及其物理特性［J］.農(nóng)業(yè)工程學報，2011，27（9）：387～392.