右旋糖苷修飾超氧化物歧化酶及其產(chǎn)物活性研究

李 亮 趙有璽 冀頤之 龔 平（北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院，北京 0003）

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD），是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的金屬酶。因?yàn)槟軌虼呋蹶庪x子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，己成為生化研究領(lǐng)域的熱門課題。SOD在防輻射、抗衰老、消炎、抑制腫瘤及自身免疫治療等方面顯示出獨(dú)特的功能［1］，在醫(yī)學(xué)、食品、化妝品等領(lǐng)域應(yīng)用價(jià)值很大。不同介質(zhì)中SOD活性的穩(wěn)定性，是制約其應(yīng)用的關(guān)鍵因素之一。常用的解決方法包括對SOD相關(guān)氨基酸殘基進(jìn)行化學(xué)修飾，水溶性大分子（如聚乙二醇、聚蔗糖和聚烯屬烴基氧化物等）對SOD進(jìn)行共價(jià)修飾，以及酶切改造等等$2－5%。

在牛血清白蛋白、月桂酸、褪黑素、不飽和脂肪酸、環(huán)糊精、羧甲基纖維素、肝素、卵磷脂等可用于修飾SOD的修飾劑［6，7］中，右旋糖苷作為一種具有良好的生物相容性和水溶性的天然大分子多糖，其糖鏈上的醛基經(jīng)活化后可與酶蛋白分子上的游離氨基共價(jià)結(jié)合［8，9］，是目前應(yīng)用廣泛的酶分子及蛋白質(zhì)修飾劑之一。但關(guān)于其修飾SOD的報(bào)道較少［10］。

本研究擬采用右旋糖苷修飾SOD，通過紫外分光光度法測定修飾酶在高溫環(huán)境、酸性、堿性以及有機(jī)溶劑條件下的酶活性穩(wěn)定性變化，并采用紅外光譜法確認(rèn)修飾反應(yīng)。旨在改善SOD在不同環(huán)境條件下的酶活穩(wěn)定性，為SOD的應(yīng)用提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

超氧化物歧化酶：植物來源，200IU/mg，北京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司；

右旋糖苷：重均分子量（Mw）為1 500，國藥集團(tuán)北京化學(xué)試劑公司；

高碘酸鈉、亞硫酸氫鈉、磷酸鹽、三羥甲基氨基甲烷Tris鹽、EDTA、酒精等試劑：除特別注明外均為分析純，國藥集團(tuán)北京化學(xué)試劑公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

傅里葉變換紅外光譜儀：PE Spectrum 2型，美國PE公司；

紫外—可見光分光光度計(jì)：PE lambda35型，美國PE公司。

1.2 方法

1.2.1 右旋糖苷修飾SOD反應(yīng)原理 右旋糖苷是由α－葡萄糖通過α－1，6－糖苷鍵連接而成的高分子多糖，具有良好的生物相容性和水溶性。通過高碘酸將右旋糖苷上鄰雙羥基氧化成醛基，醛基再與酶分子上的氨基結(jié)合生成修飾酶。用高碘酸來調(diào)節(jié)右旋糖苷的氧化程度。一般氧化程度達(dá)20%～25%時(shí)，與酶具有較高的結(jié)合能力。

1.2.2 修飾反應(yīng)過程

（1）透析袋預(yù)處理：將透析袋剪成適當(dāng)長度（15cm）的小段；在600mL的2%（m/V）碳酸氫鈉和1mmol/L EDTA（pH 8.0）中將透析袋煮沸10min；用蒸餾水徹底清洗透析袋1 h；置于1mmol/L EDTA （pH 8.0）中煮沸10min；冷卻后，存放于1mmol/L EDTA中，確保透析袋始終浸沒在溶液內(nèi)。

（2）右旋糖苷活化處理：稱取0.5g右旋糖苷，加入100 mL蒸餾水中，水浴溶解，當(dāng)溶液澄清時(shí)取出放置至室溫，再置于冰箱，讓其溫度降至4℃；配制12%的高碘酸鈉溶液，于4℃向活化后的右旋糖苷中逐滴加人12%的高碘酸鈉溶液0.5mL，避光條件下繼續(xù)攪拌20min，避光低溫保存過夜；以新配置的5%的亞硫酸氫鈉溶液滴定未反應(yīng)的高碘酸鈉至琥珀色，滴定到接近終點(diǎn)時(shí)會出現(xiàn)紅褐色沉淀，搖動會溶解，不可出現(xiàn)黑色沉淀顆粒；將滴定后的活化糖苷用蒸餾水透析至完全透明時(shí)，換水繼續(xù)透析2h后取出；將透析出的活化糖苷用聚乙二醇反透析至約3～5mL。

（3）SOD的修飾：將反透析后的活化糖苷，溶解于10 mL的碳酸緩沖溶液（pH 9.0）中；取0.01g SOD，溶于5mL蒸餾水，將調(diào)好pH值的活化糖苷滴加入SOD溶液并緩慢攪拌，4℃反應(yīng)20h，期間每隔一段時(shí)間緩慢搖勻；加入7.5%的甘氨酸溶液終止反應(yīng)；4h后取出反應(yīng)液，放入截留分子量為3 500的透析袋中蒸餾水透析，至透析液pH值為中性時(shí)，取出透析物冷凍干燥得到凍干品，凍干品呈白色或淡黃色。

1.2.3 原SOD酶和右旋糖苷修飾酶酶活測定 采用鄰苯三酚終止劑法$11%。

1.2.4 修飾反應(yīng)的結(jié)構(gòu)分析 采用紅外光譜法。KBr壓片。

2 結(jié)果與分析

2.1 SOD酶活的熱穩(wěn)定性分析

分別將植物SOD干粉、右旋糖苷修飾SOD溶解于蒸餾水中，置于70℃水浴，一定時(shí)間后取出進(jìn)行酶活分析，結(jié)果見圖1。

圖1 修飾前后SOD在70℃下酶活隨時(shí)間的變化Figure 1 The relation of SOD enzyme activity on time，before and after modification

由圖1可知，修飾后SOD初始活性有所下降。這可能是由于右旋糖苷的加入使SOD分子量增大導(dǎo)致的，也可能是由于70℃已經(jīng)超出酶的最適溫度，導(dǎo)致酶變性加劇引起的。但是經(jīng)右旋糖苷修飾后的SOD熱穩(wěn)定性要高于未經(jīng)修飾的。這是因?yàn)槊概c右旋糖苷交聯(lián)后，使酶的天然構(gòu)象產(chǎn)生“剛性”，不易伸展打開，減少了酶分子內(nèi)部基團(tuán)的熱振動，從而增強(qiáng)了酶的熱穩(wěn)定性［12］。原酶在70℃條件下，酶活明顯下降，5min后下降到30%，15min后完全失活。而經(jīng)修飾后的SOD失活速率明顯低于原酶，5min內(nèi)僅下降到70%，20min后仍具活性。

2.2 SOD在酸性條件下酶活穩(wěn)定性分析

分別將植物SOD干粉、右旋糖苷修飾SOD溶解于pH 5.2Na2HPO3—KH2PO3緩沖溶液，置于30℃水浴，一定時(shí)間后取出進(jìn)行酶活力測定，結(jié)果見圖2。

圖2 修飾前后SOD在酸性Na2HPO3—KH2PO3緩沖溶液中酶活隨時(shí)間的變化Figure 2 The relation of SOD enzyme activity on time in acid Na2HPO3—KH2PO3buffer solution，before and after modification

由圖2可知，SOD在酸性條件下酶活整體下降。這可能是因?yàn)樵損H值低于SOD酶的最適pH，導(dǎo)致酶失活引起的。經(jīng)右旋糖苷修飾后的SOD在酸性環(huán)境中穩(wěn)定性明顯高于未經(jīng)修飾的。這是因?yàn)橛倚擒盏目臻g保護(hù)，降低了SOD酶活性中心的暴露程度，從而減緩了活性損失的速度。原酶在pH 5.2條件下，酶活明顯下降，5min后下降50%，15min后完全失活。而經(jīng)修飾后的SOD失活速率明顯低于原酶，5 min后僅下降10%，20min后仍具有活性。

2.3 SOD在堿性條件下酶活穩(wěn)定性分析

分別將植物SOD干粉、右旋糖苷修飾SOD溶解于pH 10.8Na2CO3—NaHCO3緩沖溶液，置于30℃水浴，一定時(shí)間后取出進(jìn)行酶活測定，結(jié)果見圖3。

比較圖2、3可知，SOD在堿性條件下的酶活比酸性條件高。這可能是pH值變化能引起酶分子中可離解極性基團(tuán)的離解狀態(tài)和電荷發(fā)生改變，改變酶的構(gòu)型和構(gòu)象，影響了酶分子的電荷分布，從而影響酶的最適pH值所致［13］。圖3中，經(jīng)右旋糖苷修飾后的SOD在堿性環(huán)境中穩(wěn)定性要好于未經(jīng)修飾的。原酶在pH 10.8條件下，酶活明顯下降，5min后下降了70%，10min后已完全失活。而經(jīng)修飾后的SOD失活速率明顯低于原酶，5min內(nèi)僅下降了10%，20 min后仍具有初始酶活力的40%。

圖3 修飾前后SOD在堿性Na2CO3—NaHCO3緩沖溶液中酶活隨時(shí)間的變化Figure 3 The relation of SOD enzyme activity on time in base Na2CO3—NaHCO3buffer solution，before and after modification

2.4 SOD在乙醇溶液中酶活穩(wěn)定性分析

分別將植物SOD干粉、右旋糖苷修飾SOD溶解于濃度分別 為5%，10%，15%，20%，25%，30% 的 乙 醇 緩 沖 溶 液，5 min后取出進(jìn)行酶活力測定，結(jié)果見圖4。

圖4 修飾前后SOD在乙醇溶液中酶活的變化Figure 4 The relation of SOD enzyme activity on ethanol concentration

由圖4可知，隨乙醇濃度升高，SOD活性呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢；修飾后的SOD比未修飾的酶活高，在乙醇濃度為30%時(shí)，前者的酶活是后者的1.7倍。這可能是由于水溶性有機(jī)溶劑乙醇使SOD溶解能力升高，酶活因此升高；隨著乙醇濃度的逐漸升高，溶劑極性降低，SOD內(nèi)部的非極性疏水基翻出機(jī)率增大，從而使酶的活力降低［14］。

2.5 SOD修飾反應(yīng)紅外光譜分析

修飾反應(yīng)前后物質(zhì)的紅外光譜圖見圖5、6。

圖5 SOD紅外光譜圖Figure 5 The IR Spectra of SOD

圖6 右旋糖酐修飾SOD的紅外光譜圖Figure 6 The IR spectra of dextran－modified SOD

圖5中3 442cm－1吸收帶是肽鍵的—NH振動吸收帶。由于活化右旋糖苷修飾的SOD中醇羥基—OH的伸縮振動［15，16］，該吸收帶遷移至3 398cm－1處，形成更強(qiáng)的吸收（圖6）。由于—OH之間，以及—OH和—NH的氫鍵締合，使得峰型變寬。

更為關(guān)鍵的紅外吸收變化出現(xiàn)在官能團(tuán)區(qū)。圖5SOD紅外圖譜中1 657cm－1吸收峰是由肽鍵中C═O雙鍵振動引起的。而圖6中，相關(guān)吸收在修飾的SOD中出現(xiàn)了1 637cm－1的吸收帶。這是多糖類物質(zhì)最具特征的紅外吸收之一。該吸收帶由部分活化糖苷在與SOD共價(jià)結(jié)合時(shí)帶入，由此證實(shí)該SOD被糖苷成功修飾。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用右旋糖苷對超氧化物歧化酶進(jìn)行修飾，通過紅外光譜證實(shí)該修飾反應(yīng)的發(fā)生。通過鄰苯三酚終止劑法分別測定了高溫（70℃）、酸性及堿性條件下以及水溶性有機(jī)溶劑中修飾前后SOD活性變化情況。酶活測定結(jié)果表明，經(jīng)修飾后的SOD在70℃高溫、pH 5.2的酸性、pH 10.8的堿性條件下20min不失活，且可以保持一定活性。右旋糖苷修飾能提高SOD酶活穩(wěn)定性，是增強(qiáng)酶穩(wěn)定性的有效方法之一。

本研究對提高SOD穩(wěn)定性，改善SOD易失活及在體內(nèi)的半衰期較短等應(yīng)用性能提供了一種可行手段，為SOD在醫(yī)藥、食品及化妝品等方面的推廣應(yīng)用提供了試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

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