低蛋白質(zhì)飼糧中植物源血根堿替代色氨酸對(duì)仔豬門(mén)靜脈血漿流率及氨基酸代謝的影響

賀 喜 岳 龍 張石蕊* 李鳳娜 陳達(dá)圖胡官波 沈 俊 曾建國(guó)

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128;2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸用中藥資源與中獸藥創(chuàng)制國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，長(zhǎng)沙 410128;3.中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，長(zhǎng)沙 410125)

植物源血根堿(以下簡(jiǎn)稱(chēng)血根堿)是從博落回中提取的一種生物堿，血根堿除了具有生物堿共有的一些特性外［1］，一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)血根堿對(duì)色氨酸的代謝有一定的影響。Walterová等［2］研究表明，血根堿影響色氨酸代謝的可能途徑在于它們的結(jié)構(gòu)都具有類(lèi)似的含氮環(huán)狀結(jié)構(gòu)，均可以結(jié)合芳香族氨基酸代謝關(guān)鍵酶，血根堿競(jìng)爭(zhēng)性抑制色氨酸脫羧酶的活性而減少色氨酸的代謝量。血液是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、代謝產(chǎn)物、激素以及其他物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)媒介。豬體循環(huán)中，與養(yǎng)分運(yùn)輸有直接關(guān)系的循環(huán)為門(mén)脈循環(huán)。消化器官吸收的養(yǎng)分經(jīng)過(guò)門(mén)靜脈進(jìn)入肝臟，再加以處理［3］。因此，給豬安裝動(dòng)-靜脈血管插管，可以從其血液流速及成分動(dòng)態(tài)變化過(guò)程中反映飼糧因子對(duì)豬營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的影響。本試驗(yàn)通過(guò)安裝動(dòng)-靜脈血管插管的方法，測(cè)定豬門(mén)靜脈血漿流率(PVPF)、門(mén)靜脈氨基酸凈吸收量和門(mén)靜脈血漿尿素氮凈吸收量等指標(biāo)，探討血根堿替代色氨酸對(duì)仔豬PVPF及門(mén)靜脈氨基酸代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物分組

試驗(yàn)選取18頭20 kg左右的“杜×長(zhǎng)×大”三元雜交公豬，進(jìn)行血插管手術(shù)，待豬恢復(fù)正常后選取其中符合試驗(yàn)要求的12頭隨機(jī)分為4個(gè)處理，每個(gè)處理3頭豬。4個(gè)處理分別為低蛋白質(zhì)飼糧組(低蛋白質(zhì)組)、低蛋白質(zhì)不補(bǔ)充色氨酸飼糧組(缺色氨酸組)、低蛋白質(zhì)不補(bǔ)充色氨酸添加血根堿飼糧組(血根堿組)和常規(guī)飼糧組。

1.2 血根堿及試驗(yàn)飼糧

1.2.1 血根堿

本試驗(yàn)的血根堿由獸用中藥資源與中獸藥創(chuàng)制國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心提供，稀釋濃度為1.5% 。

1.2.2 試驗(yàn)飼糧

根據(jù)豬體重，參照NRC(1998)及本團(tuán)隊(duì)前期相關(guān)研究的氨基酸平衡模式配制飼糧，其中血根堿預(yù)混劑的添加量為40 mg/kg。試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets(air-dry basis) %

1.3 仔豬動(dòng)－靜脈插管系統(tǒng)的安裝

1.3.1 術(shù)前準(zhǔn)備

試驗(yàn)豬單籠飼喂于可調(diào)節(jié)不銹鋼代謝籠內(nèi)，籠內(nèi)有獨(dú)立的飲水器和給料器，室溫控制在20～22℃。試驗(yàn)前7 d開(kāi)始飼喂試驗(yàn)飼糧，手術(shù)前試驗(yàn)豬禁食12 h，不禁水。手術(shù)前應(yīng)準(zhǔn)備好手術(shù)需用的器械，藥品，人員安排妥當(dāng)。手術(shù)室消毒，室溫需保持25℃左右。

1.3.2 動(dòng)-靜脈插管的安裝

參照黃瑞林等［4］方法分別在頸動(dòng)脈、門(mén)靜脈和腸系膜靜脈安裝插管。

豬門(mén)靜脈與腸系膜靜脈插管安裝:手術(shù)前15 min給豬注射阿托品，5 min后將其麻醉并固定于手術(shù)臺(tái)上，同時(shí)借助金陵-01型麻醉呼吸機(jī)(南京普澳醫(yī)療設(shè)備有限公司)，用異氟醚通過(guò)呼吸道對(duì)豬進(jìn)行全身麻醉，在豬耳靜脈滴注葡萄糖生理鹽水。術(shù)部刮毛，清洗并消毒，縱向切開(kāi)約10 cm長(zhǎng)的切口，分離肌肉，剪開(kāi)腹膜，找到門(mén)靜脈并剝離門(mén)靜脈處血管的漿膜等結(jié)締組織，首先用引導(dǎo)針從后心方向插入門(mén)靜脈，再將插管插入門(mén)靜脈血管內(nèi)，約2 cm深，并確保插管通順后固定。然后找出回盲瓣，在近回盲瓣的腸系膜處選一根較粗的靜脈血管，剝離結(jié)締組織，將插管順血液回流方向插入，約5 cm深，確保插管通順后固定。插管安裝完畢后，關(guān)閉腹膜，縫合肌肉，然后用自制的約20 cm長(zhǎng)的牽引針?lè)謩e將腸系膜插管和門(mén)靜脈插管通過(guò)皮下?tīng)恳良珉尾坎⒋┏鲶w表，插管與牽引針需先用75%的酒精進(jìn)行消毒處理，最后縫合皮膚。

豬頸動(dòng)脈插管安裝:豬頸部右側(cè)刮毛，清洗并消毒，于喉結(jié)處縱向切開(kāi)約5 cm的切口，鈍性分離肌肉和筋膜組織，找到頸動(dòng)脈，并剝離迷走神經(jīng)總干及周?chē)M織，游離頸動(dòng)脈，將離心端結(jié)扎，將插管向心方向插入，約10～12 cm深，并固定，縫合肌肉，然后將插管通過(guò)皮下?tīng)恳良珉尾看┏鲶w表。縫合皮膚。

1.3.3 術(shù)后護(hù)理

術(shù)后為保護(hù)豬不因傷口恢復(fù)時(shí)痛癢而磨蹭掉插管，應(yīng)定期向傷口涂抹止癢膏和消炎藥，并給豬穿上特制的保護(hù)服。術(shù)后每天需定時(shí)抽出1 mL左右的淤血，并用200 IU/mL肝素鈉溶液清洗插管，防止插管堵塞。

1.4 試驗(yàn)操作程序

試驗(yàn)前預(yù)飼7 d，飼喂相應(yīng)試驗(yàn)飼糧，自由采食，記錄每天采食量，自由飲水。在第7天從腸系膜靜脈處連續(xù)灌注對(duì)氨基馬尿酸(PAH)，然后采集豬動(dòng)靜脈血樣。采樣當(dāng)天結(jié)束后稱(chēng)豬體重，記錄。

1.4.1 PAH 的配制和灌注

PAH的配制和灌注方法參照李鐵軍等［5］試驗(yàn)方法進(jìn)行。

1.4.2 采樣當(dāng)天的飼喂方式

參照方正鋒等［6］的方法:豬在采樣前1 d晚上停止喂食，在采樣當(dāng)天08:00開(kāi)始第1次飼喂，以后每隔1 h飼喂1次，連續(xù)飼喂6次，每次給料量為日采食量的1/24，日采食量按體重的4.5%計(jì)算。

1.4.3 血液樣品的采集與制備

在第1次飼喂開(kāi)始前15 min，即采樣當(dāng)天的07:45，采取基線血樣。然后從09:00開(kāi)始每1 h采集1次，連續(xù)采集6次(不包括基線血樣)。采樣方法為:用一次性注射器緩慢均勻地從動(dòng)靜脈插管中抽取血液，從每個(gè)插管抽取前的1 mL均丟棄，然后換新注射器抽取血樣，將血樣放入經(jīng)400 IU/mL的肝素鈉溶液抗凝處理的離心管中，于2 500×g、4℃離心機(jī)中離心15 min制備血漿。

1.4.4 PAH 濃度的測(cè)定

從1%PAH灌注液(為10 000 mg/L)中移取1 mL，用雙蒸水定溶至100 mL(為100 mg/L)，再?gòu)?100 mL PAH 溶液中分別移取 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 和 1.0 mL PAH，按順序分別加入2 mL的NaNO2溶液、氨基磺酸銨溶液和N-1-萘乙二胺鹽酸鹽溶液，用雙蒸水定溶至50 mL，其 PAH 濃度則分別為 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 和 2.0 mg/L，然后用Multiskan型酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)550 nm處測(cè)吸光度(A)。

分別取豬動(dòng)-靜脈血漿1 mL，置于50 mL容量瓶中，按順序分別加入2 mL的NaNO2溶液、氨基磺酸銨溶液和N-1-萘乙二胺鹽酸鹽溶液，用雙蒸水定溶至50 mL，然后用Multiskan型酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)550 nm處測(cè)定吸光度(A)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)濃度方程計(jì)算樣品的PAH濃度。

1.5 計(jì)算公式

根據(jù)下面3個(gè)公式，計(jì)算出PVPF，門(mén)靜脈氨基酸凈吸收量和門(mén)靜脈血漿尿素凈吸收量。

其中，CPAH為血漿中PAH的濃度;APAH為血漿中PAH吸光度;a和b為PAH標(biāo)準(zhǔn)溶液所測(cè)系數(shù)。

其中，PVPF為門(mén)靜脈血漿流率［mL/(min·kg BW)］;Ci為 PAH 灌注液濃度(mg/mL);IR為PAH灌注流速(mL/min);PAHpv和PAHa分別為門(mén)靜脈與頸動(dòng)脈血漿中PAH濃度(mg/mL);BW為采樣當(dāng)天試驗(yàn)豬體重。

其中，q為短時(shí)間內(nèi)(當(dāng)dt在5 min內(nèi)，時(shí)間因素dt可以考慮為常數(shù))某營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收的量;Cp和Ca分別為門(mén)靜脈與頸動(dòng)脈某營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的量;D為PVPE;Q為采食后在時(shí)間T0與t1之間某營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收的量，但這一吸收量不包含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)總的吸收量，僅為門(mén)靜脈血液某營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的凈吸收量。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，表中數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，差異顯著性用Duncan氏法統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬PVPF的測(cè)定結(jié)果

從表2可以看出，缺色氨酸組6 h內(nèi)PVPF平均比低蛋白質(zhì)組、血根堿組、常規(guī)飼糧組分別低5.13%、4.36%、8.92%，但差異不顯著(P＞0.05)。同一試驗(yàn)組不同時(shí)間段的PVPF結(jié)果顯示，低蛋白質(zhì)組和缺色氨酸組的PVPF采食前到采食后6 h呈上升趨勢(shì)，各點(diǎn)間差異不顯著(P＞0.05)，血根堿組的PVPF呈上升趨勢(shì)，5 h的PVPF顯著高于前4 h(P＜0.05)，并在6 h達(dá)到最高值，且顯著高于5 h(P＜0.05)。常規(guī)飼糧組的 PVPF采食后1 h的PVPF顯著低于后面5個(gè)時(shí)間段(P＜0.05)。同一時(shí)間點(diǎn)不同試驗(yàn)組PVPF結(jié)果顯示，在采食1 h血根堿組的PVPF顯著高于低蛋白質(zhì)組(P＜0.05)，與缺色氨酸組和常規(guī)飼糧間差異不顯著(P＞0.05);采食2 h缺色氨酸組的 PVPF比低蛋白質(zhì)組和血根堿組低6.84%和6.68%(P＞0.05)，比常規(guī)飼糧組低 15.82%(P＜0.05)。上述結(jié)果表明豬PVPF會(huì)隨著采食時(shí)間變化而呈上升的趨勢(shì)，總體水平不隨飼糧變化而變化。

表2 食后不同時(shí)間點(diǎn)PVPF變化情況Table 2 Post-prandial PVPF of piglets at different time mL/(min·kg BW)

2.2 豬采食后6 h內(nèi)門(mén)靜脈氨基酸凈吸收量

從表3可以看出，缺色氨酸組門(mén)靜脈賴(lài)氨酸、色氨酸及精氨酸凈吸收量顯著低于蛋白質(zhì)組、血根堿組和常規(guī)飼糧組(P＜0.05)，而低蛋白質(zhì)組、血根堿組和常規(guī)飼糧組間門(mén)靜脈賴(lài)氨酸、色氨酸及精氨酸凈吸收量差異不顯著(P＞0.05)。缺色氨酸組門(mén)靜脈必需氨基酸及總氨基酸凈吸收量顯著低于蛋白質(zhì)組、血根堿組和常規(guī)飼糧組(P＜0.05)，而低蛋白質(zhì)組和血根堿組間門(mén)靜脈必需氨基酸及總氨基酸凈吸收量差異不顯著(P＞0.05)。上述結(jié)果說(shuō)明在低蛋白質(zhì)飼糧中不添加色氨酸，氨基酸不平衡時(shí)，其門(mén)靜脈必需氨基酸與總氨基酸凈吸收量受到影響，添加血根堿替代色氨酸，能一定程度改善門(mén)靜脈必需氨基酸和總氨基酸的凈吸收量。

表3 試驗(yàn)豬6 h內(nèi)門(mén)靜脈氨基酸凈吸收量Table 3 The levels of amino acids net absorption in portal vein post-prandial 6 hours %

2.3 豬門(mén)靜脈血漿尿素氮凈吸收量

從表4可以看出，缺色氨酸組門(mén)靜脈血漿尿素氮凈吸收量比低蛋白質(zhì)組和血根堿組高0.02%和1.97%，比常規(guī)飼糧組低3.80%，差異不顯著(P＞0.05)。結(jié)果說(shuō)明在低蛋白質(zhì)飼糧基礎(chǔ)上，添加色氨酸、不添加色氨酸或血根堿替代色氨酸條件下動(dòng)物機(jī)體對(duì)血液中氮元素吸收量相近，常規(guī)飼糧亦如此。

表4 試驗(yàn)豬6 h內(nèi)血漿尿素氮凈吸收量Table 4 The levels of plasma UN net absorption in portal vein post-prandial 6 hours mmol/g

3 討論

3.1 血根堿對(duì)PVPF的影響

有關(guān)豬PVPF的研究較少。方正鋒等［6］研究表明，仔豬采食1 h內(nèi)血流速度快速上升，2～5 h趨于平穩(wěn)，在6 h達(dá)到最高值。另?yè)?jù)資料報(bào)道［7］，盡管PVPE在采食前后各時(shí)間點(diǎn)的流率有所不同，呈下降趨勢(shì)，但其不隨飼糧的變化而發(fā)生較大的改變。本試驗(yàn)研究表明，各組的PVPE在采食前后各時(shí)間點(diǎn)的流率都有所不同，整體呈上升趨勢(shì)，后期較緩。相對(duì)于不補(bǔ)充色氨酸組，添加血根堿后，對(duì)PVPF有一定提高。結(jié)果表明添加血根堿對(duì)豬PVPF有一定影響。

3.2 血根堿對(duì)豬6 h內(nèi)血漿氨基酸凈吸收量和尿素氮凈吸收量的影響

動(dòng)物的生長(zhǎng)主要表現(xiàn)在蛋白質(zhì)的沉積，而蛋白質(zhì)沉積取決于門(mén)靜脈凈吸收的必需氨基酸量［8］。Yin 等［3］研究表明，豬飼糧中被消化吸收的氨基酸，僅有50% ～60%出現(xiàn)在門(mén)靜脈中供外周組織蛋白質(zhì)合成，其余則被門(mén)靜脈回流組織本身所利用。本試驗(yàn)結(jié)果顯示低蛋白質(zhì)飼糧補(bǔ)充色氨酸和不補(bǔ)充色氨酸比較，6 h內(nèi)必需氨基酸和總氨基酸凈吸收量均以低蛋白質(zhì)補(bǔ)充色氨酸組高于不補(bǔ)充色氨酸組。說(shuō)明在色氨酸不能滿足的條件下會(huì)降低豬對(duì)飼糧必需氨基酸和總氨基酸的凈吸收量。血根堿替代色氨酸后，6 h內(nèi)必需氨基酸凈吸收量和總氨基酸凈吸收量與低蛋白質(zhì)飼糧組基本相近，說(shuō)明用血根堿替代色氨酸后動(dòng)物機(jī)體能在一定程度上影響色氨酸的代謝，從而影響必需氨基酸和總氨基酸的代謝。Walterová等［2］研究表明，血根堿與色氨酸結(jié)構(gòu)相似，具有類(lèi)似的含氮環(huán)狀結(jié)構(gòu)，可以競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合腸道芳香族氨基酸代謝關(guān)鍵酶，這也許是血根堿影響色氨酸代謝的原因之一。

尿素氮是衡量豬體內(nèi)氮平衡的一個(gè)重要指標(biāo)。本研究門(mén)靜脈血漿尿素氮凈吸收量結(jié)果表明，在低蛋白質(zhì)飼糧基礎(chǔ)上，添加色氨酸、不添加色氨酸或血根堿替代色氨酸條件下動(dòng)物機(jī)體對(duì)血液中氮元素吸收量相近，說(shuō)明血根堿不會(huì)影響豬體氮平衡。

4 結(jié)論

在低蛋白質(zhì)飼糧基礎(chǔ)上，不補(bǔ)充色氨酸添加血根堿后會(huì)相對(duì)提高PVPF，增加門(mén)靜脈總氨基酸和必需氨基酸凈吸收量，不影響門(mén)靜脈血漿尿素氮凈吸收量。

［1］ 羅國(guó)富，肖世玖.血根堿的藥理作用及其應(yīng)用［J］.獸藥與飼料添加劑，2009，14(5):22-24.

［2］ WALTEROVá D，ULRICHOVá J，VáLKA I，et al.Benzo［c］phenanthridine alkaloids sanguinarine and chelerythrine:biological activities and dental care applications［J］.Acta Universitatis Palackianae Olomucensis Facultatis Medicae，1995，139:7-16.

［3］ YIN Y L，HUANG R L，LIBAO-MERCADO A J.Net portal appearance of amino acids and glucose，and energy expenditure by portal vein-drained organs in growing pigs fed casein and cornstarch based diets ora wheat shorts based diet［C］//9th Symposium on Digestive Physiology in Pigs.Albert，Canada，2003:340-342.

［4］ 黃瑞林，印遇龍，李鐵軍，等.用于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝的豬動(dòng)靜脈插管技術(shù)的研究.Ⅰ.插管及血流量計(jì)安裝手術(shù)［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，2003，39(6):19-20.

［5］ 李鐵軍，印遇龍，黃瑞林，等.用于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝的豬動(dòng)靜脈插管技術(shù)的研究.Ⅱ.門(mén)靜脈營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)凈流量測(cè)定方法［J］.中國(guó)畜牧雜志，2003，39(2):28-29.

［6］ 方正鋒，彭建，齊智利，等.腸道營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝的仔豬動(dòng)-靜脈插管技術(shù)的建立［J］.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2010，30(8):1098-1101.

［7］ 李鐵軍，黃瑞林，印遇龍.不同日糧對(duì)豬血液紅細(xì)胞壓容積及其血流量的影響［J］.廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué)，2003，22(3):159-164.

［8］ 印遇龍.豬氨基酸營(yíng)養(yǎng)與代謝［M］.北京:科學(xué)出版社，2008:147-149.