SMART技術(shù)構(gòu)建的辣椒疫霉菌與辣椒互作AD-cDNA文庫

周志國 明月梅

（廊坊師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河北廊坊 065000）

SMART技術(shù)構(gòu)建的辣椒疫霉菌與辣椒互作AD-cDNA文庫

周志國 明月梅

（廊坊師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河北廊坊 065000）

為了分離和克隆辣椒中疫霉菌誘導(dǎo)基因，以接種辣椒疫霉菌的葉片為材料，利用SMART技術(shù)構(gòu)建辣椒疫霉菌與辣椒互作的雙雜交cDNA文庫。結(jié)果表明：該文庫容量為3.6×106cfu，重組率88%左右，插入片段集中在300～2 000 bp之間，平均長度約為800 bp，表明獲得的文庫質(zhì)量較高，該文庫將為分子育種提供重要的基因資源。

辣椒疫霉菌；SMART技術(shù)；雙雜交cDNA文庫

辣椒是我國重要的蔬菜和加工原料作物，產(chǎn)值居蔬菜之首（謝思惠 等，2011）。在辣椒生產(chǎn)過程中，病害種類多，發(fā)生頻繁，其中疫?。≒hytophthora blight）是重要的真菌性土傳病害，發(fā)病快，蔓延迅速，病程期短，防治困難（杜曉華 等，2005），常造成辣椒大面積減產(chǎn)甚至絕收，在我國吉林、遼寧、青海、河北、北京、云南、甘肅、陜西、上海、浙江、湖南、江蘇、江西等地均有發(fā)生（周啟明 等，1984；關(guān)天舒 等，1995；鄒學(xué)校 等，2004）。研究人員已對辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）的生理與致病機理、辣椒的疫病病理、栽培方式、化學(xué)防治、生物防治等方面進(jìn)行了相關(guān)研究（田林 等，1989；朱英波和李超，2002；李智軍 等，2007；劉學(xué)敏，2007；江厚春 等，2011），但抗病育種作為防治辣椒疫病的重要方法，其抗病資源相對缺乏（程芳，2007；史云國，2007；徐劉平和郭堅華，2007）。

cDNA文庫是現(xiàn)代研究功能基因組學(xué)的最有效手段之一，可直接從cDNA文庫中篩選所需目的基因，并用于基因的表達(dá)分析（Colin et al.，1999；蔡寧波 等，2007；朱利軍 等，2009）。利用SMART技術(shù)（Switching Mechanism At 5′end of RNA Transcript）構(gòu)建全長cDNA文庫，可從中發(fā)現(xiàn)候選基因，從而在生產(chǎn)上實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的廣泛應(yīng)用（張沖 等，2013）。為充分開發(fā)和利用辣椒抗病基因，本試驗以辣椒為材料，利用SMART技術(shù)構(gòu)建辣椒疫霉菌誘導(dǎo)的混合葉片Y2H的AD-cDNA文庫，測定文庫的滴度和重組率，并隨機挑選50個單克隆，對測序成功的序列進(jìn)行初步生物信息學(xué)分析。該文庫為篩選辣椒-疫霉互作蛋白分子基因提供豐富資源，為研究辣椒-疫霉相互作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取8～10葉期的卞椒1號辣椒無菌苗，接種疫霉菌孢子懸浮液（含游動孢子1 000個·mL-1）2 mL，分別于12、24、48、60、72 h后取樣，液氮凍存，用于RNA提取。

Trizol試劑即TRIzon Reagent（CW0580），購自康為世紀(jì)，文庫構(gòu)建試劑盒Make Your Own“Mate & Plate”Library System User Manual（630490）購自Clonetech 公司。

1.2 文庫的構(gòu)建

1.2.1 高質(zhì)量RNA的提取 采用Trizol法分別提取辣椒疫霉菌誘導(dǎo)的接種12、24、48、60、72 h后葉片的總RNA，具體方法參考說明書CW0580，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測，同時用核酸蛋白測定儀檢測總RNA的濃度及純度。

1.2.2 cDNA的合成與純化 以Total RNA為模板，參照說明書630490，以CDSIII/6 PCR Primer合成第一鏈，然后以3′PCR Primer和5′PCR Primer為引物通過LD-PCR合成雙鏈cDNA。經(jīng)CHROMA SPIN+TE-400（Clonetech）分離柱去除雙鏈cDNA中200 bp以下短片段。

1.2.3 文庫的構(gòu)建 將質(zhì)粒載體pGADT7-Rec與純化后的雙鏈cDNA連接，然后轉(zhuǎn)入新鮮制備的酵母感受態(tài)Y187，涂布于100個SD/-Leu培養(yǎng)基平板，同時分別吸取1∶100、1∶1 000轉(zhuǎn)化后的Y187細(xì)胞稀釋液100 μL到SD/-Leu平板上，計算轉(zhuǎn)化效率。4 d后用玻璃珠法，將收集下來的酵母溶于YPDA液體，混勻后與75%的甘油以2 V ∶1 V的比例混合保存于-80 ℃冰箱。

1.3 cDNA文庫的檢測

將酵母菌液10 μL稀釋10 000倍后，取出50 μL涂布SD/-Leu平板，培養(yǎng)4 d，計算文庫滴度。

文庫滴度（cfu·mL-1）=平板上的克隆數(shù)/0.05 mL×10-4

庫容量=文庫滴度×懸浮體積（mL）

隨機挑取50個單菌落，以pGADT7-Rec載體上的引物（參照說明書680490）進(jìn)行PCR擴增，之后測序（上海生工生物工程有限公司），在辣椒數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站（http：//peppersequence.genomics.cn）對測序結(jié)果進(jìn)行比對與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 AD-cDNA文庫構(gòu)建

2.1.1 RNA質(zhì)量檢測 提取高質(zhì)量RNA是cDNA文庫構(gòu)建成功的關(guān)鍵，采用Trizol法分別提取辣椒疫霉菌誘導(dǎo)的卞椒1號葉片總RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測可看出，提取的5個樣品總RNA可見2條清晰的28S、18S RNA條帶，完整性較好（圖1）。經(jīng)核酸蛋白儀測定（表1），5個樣品的總RNA均符合文庫構(gòu)建的要求。將5個總RNA樣品分別吸取1、0.6、0.5、0.6、0.8μL混勻，用于cDNA的合成。

圖1 辣椒疫霉菌誘導(dǎo)的辣椒葉片總RNA凝膠電泳結(jié)果

表1 RNA質(zhì)量檢測

2.1.2 cDNA的合成 以CDSIII/6 PCR Primer引物合成cDNA，得到的雙鏈cDNA帶呈彌散狀均勻分布（圖2-a），質(zhì)量完全符合建庫要求。經(jīng)CHROMA SPIN+TE-400樹脂柱純化后的雙鏈cDNA帶富集在400～3 000 bp（圖2-b），經(jīng)檢測其質(zhì)量和濃度均達(dá)到建庫的要求。

2.2 AD-cDNA文庫的質(zhì)量鑒定

根據(jù)同源重組的原理，將合成的cDNA和pGADT7-Rec載體共轉(zhuǎn)化酵母Y187感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過SD/-Leu平板篩選，4 d后獲得陽性重組子（圖3-a）。經(jīng)統(tǒng)計，酵母轉(zhuǎn)化液稀釋1 000倍后涂布獲得的重組子數(shù)目為24個單克?。▓D3-b），文庫的轉(zhuǎn)化效率為4.8×106cfu·μg-1，高于建庫要求。文庫容量 = 24（每皿平均克隆數(shù)）/100 μL× 1 000×15×103μL = 3.6×106cfu。取轉(zhuǎn)化后的酵母菌原液通過血球計數(shù)板計數(shù)，所得文庫的酵母細(xì)胞濃度為2×108cfu·mL-1，達(dá)到酵母雙雜交所需要的細(xì)胞濃度。

圖2 dsDNA電泳結(jié)果

圖3 文庫構(gòu)建與質(zhì)量評估

用玻璃珠法收集文庫克隆，取收集的文庫菌液稀釋10 000倍后涂布培養(yǎng)，觀察計數(shù)（圖4），計算文庫滴度=286 cfu/0.05 mL×10-4=5.72×107cfu·mL-1。

圖4 稀釋平板計數(shù)文庫滴度

隨機挑取50個酵母菌落進(jìn)行PCR檢測，檢查文庫的空載率以及插入片段的平均長度。其結(jié)果表明，有6個單克隆未出現(xiàn)條帶，文庫質(zhì)粒的空載率12%左右，重組率88%，插入片段長度為300～2 000 bp，平均長度約為800 bp（圖5）。

圖5 文庫隨機菌落PCR電泳檢測

測序結(jié)果經(jīng)Blast和DNAMAN多重序列比對，共有20個無重復(fù)序列，在辣椒數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站上進(jìn)行序列比對，共有20組基因，編碼17種已知蛋白，3種未知蛋白（表2）。

表2 文庫克隆測序基因

3 結(jié)論與討論

SMART技術(shù)構(gòu)建文庫操作簡單，且獲得全長比例較高。該技術(shù)避免了mRNA在分離純化時發(fā)生降解和丟失；利用同源重組把外源雙鏈cDNA定向重組到載體上，解決了連接效率低等問題，保證了cDNA文庫的方向性和完整性（Zhu et al.，2001）。

辣椒基因組測序已經(jīng)完成，研究人員構(gòu)建了高密度的連鎖圖譜，并組裝得到高質(zhì)量的基因組精細(xì)圖譜，基因組大小約為3.3 Gb，其中約90%的基因都錨定在染色體上（Qin et al.，2014）。本試驗所構(gòu)建的辣椒疫霉菌誘導(dǎo)的辣椒葉片全長cDNA文庫轉(zhuǎn)化效率約為4.8×106cfu·μg-1，文庫滴度為5.72×107cfu·ml-1，重組率近90%，插入片段集中在300～2 000 bp之間，平均長度約為800 bp，達(dá)到了文庫構(gòu)建要求，還滿足蛋白互作實驗（酵母雙雜交）。通過構(gòu)建誘餌基因載體，可以在較短時間內(nèi)從AD-cDNA文庫中篩選出與誘餌基因互作的基因。

cDNA文庫的重組率、滴度、插入片段的大小及片段完整性是檢測文庫的重要指標(biāo)?？俁NA質(zhì)量直接決定cDNA文庫質(zhì)量的好壞，本文庫構(gòu)建中選取了條帶清晰，無酚類、蛋白、多糖等污染的RNA樣品，符合構(gòu)建高質(zhì)量cDNA文庫的條件。利用多樣品混合的文庫來篩選和挖掘誘導(dǎo)相關(guān)基因，可為培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和抗病的新品種辣椒提供豐富的基因資源，為辣椒新品種分子育種奠定基礎(chǔ)。

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Construction of AD-cDNA Library for Interaction of Phytophthora capsici and Pepper in SMART Technology

ZHOU Zhi-guo，MING Yue-mei
（Life Science Department，Langfang City Normal College，Langfang 065000，Hebei，China）

In order to identify the Phytophthora capsici stress induced genes of pepper， a double-hybrid cDNA library of Phytophthora capsici infected pepper leaves was constructed using SMART technology. The results showed that the cDNA library contained 3.6×106independent clones， and the recombination rate was 88%. Insert fragments ranged from 300 bp to 2 000 bp， and the average length of the library was about 800 bp. These data demonstrate that the library is qualified， and able to provide important genetic resources for molecular breeding.

Phytophthora capsici；SMART technology；Double-hybrid cDNA library

周志國，男，講師，主要從事蔬菜作物遺傳育種工作，E-mail：zhiguo_zhou@163.com

2015-06-19；接受日期：2015-07-30

河北省科技計劃項目（12226306），河北省高校食藥用菌應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心項目（YF201411）