胡蘿卜品種資源遺傳多樣性及親緣關(guān)系研究

馬振國 歐承剛 劉莉潔 趙志偉 莊飛云

（農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

胡蘿卜品種資源遺傳多樣性及親緣關(guān)系研究

馬振國 歐承剛 劉莉潔 趙志偉 莊飛云*

（農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

結(jié)合表型和SSR標(biāo)記對29份中國胡蘿卜地方資源、40份橘色栽培品種以及1份土耳其紫色品種進(jìn)行遺傳多樣性和親緣關(guān)系研究。田間農(nóng)藝性狀多樣性分析表明，除葉長、根長、根粗外，春秋兩季胡蘿卜橘色栽培品種的多樣性指數(shù)平均值低于地方資源。主成分分析結(jié)果表明，中國橘色地方資源和橘色栽培品種表型在秋季較為相似，但在春季差異較大。利用38對SSR引物對胡蘿卜品種進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增出133個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，其中中國地方資源與橘色栽培品種的平均多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)分別為4.2和2.9個(gè)。中國地方資源的多態(tài)性信息含量值（0.74±0.06）明顯高于橘色栽培品種（0.42±0.03）。聚類分析將供試胡蘿卜材料分為2組，第I組包括所有橘色栽培品種和橘色地方資源B0241，第Ⅱ組包含其他地方資源和紫色品種L1。

胡蘿卜；表型；SSR；聚類分析；遺傳多樣性；親緣關(guān)系

胡蘿卜（Daucus carota L.）是傘形科中種植最廣泛的蔬菜作物，含有豐富的α和β胡蘿卜素。但我國一些胡蘿卜種植基地黑腐病、黑斑病、軟腐病及根結(jié)線蟲等病蟲害發(fā)生日趨嚴(yán)重（歐承剛 等，2009），同時(shí)國內(nèi)冬春大棚栽培、早春露地栽培規(guī)模不斷擴(kuò)大，先期抽薹現(xiàn)象也極為嚴(yán)重，因此挖掘胡蘿卜抗逆資源、培育優(yōu)良品種越發(fā)重要，但我國關(guān)于胡蘿卜資源的遺傳多樣性報(bào)道較少（莊飛云等，2006），對胡蘿卜病蟲害及抗性資源篩選研究也非常薄弱。國外對于這些研究極為重視，有研究表明，Brasilia品種對黑斑病及根結(jié)線蟲具有一定的抗性（Boiteux et al.，1993；Vieira et al.，2003）?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)中國也存在抗根結(jié)線蟲品種資源，而且基因位點(diǎn)不同于Brasilia（Ali et al.，2013）。

普遍認(rèn)為，栽培胡蘿卜起源于10世紀(jì)前亞洲中部阿富汗等周邊地區(qū)，最早馴化的胡蘿卜類型為紫色、黃色和紅色，13世紀(jì)傳播到中國。中國關(guān)于胡蘿卜最早的記載出現(xiàn)在王繼先《紹興校定經(jīng)史證類備急本草》（1159年），該書記載胡蘿卜已作為常用蔬菜，而且廣泛用于生產(chǎn)，說明栽培胡蘿卜在12世紀(jì)以前就已出現(xiàn)在中國，這與國外學(xué)者提出的觀點(diǎn)不同，但沒有提及根色。而在李時(shí)珍《本草綱目》（1578年）中提到了黃色和紅色兩種。最新研究表明，中國胡蘿卜地方資源與阿富汗等周邊地區(qū)資源親緣關(guān)系較近，但這些報(bào)道只提及中國少量資 源（Iorizzo et al.，2013；Grzebelus et al.，2014；Rong et al.，2014）。橘色胡蘿卜是全世界最主要的種植類型，是類胡蘿卜素積累形成的胡蘿卜演化歷史的一個(gè)重要（Iorizzo et al.，2013），最早記載橘色栽培胡蘿卜的歷史文獻(xiàn)出現(xiàn)于15、16世紀(jì)（Banga，1957；Stolarczyk & Janick，2011）。Banga（1957）認(rèn)為橘色胡蘿卜是從黃色胡蘿卜中選育得到的，而Heywood（1983）認(rèn)為橘色胡蘿卜是由歐洲栽培種和野生種雜交形成的。目前大多認(rèn)為中國橘色胡蘿卜品種是由19世紀(jì)末引入的日本橘色品種逐漸演化形成的，但至今沒有直接證據(jù)。

我國收集保存了389份胡蘿卜地方品種資源，遍布29個(gè)省、市和自治區(qū)，包括黃色、紅色、紫紅色和橘色等不同類型資源（朱德蔚 等，2008）。本試驗(yàn)篩選了有代表性的中國地方資源以及國內(nèi)外引進(jìn)推廣的橘色栽培品種，通過田間農(nóng)藝性狀鑒定和SSR標(biāo)記分析中國地方品種資源與橘色栽培品種之間的親緣關(guān)系，為研究中國胡蘿卜的演化及抗性資源篩選奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所國家蔬菜種質(zhì)資源中期庫篩選了29份中國胡蘿卜地方資源，來源于19個(gè)省、市和自治區(qū)（莊飛云 等，2006）；篩選了40份國內(nèi)外市場銷售的胡蘿卜橘色栽培品種，包括20份一代雜種（F1）和20份常規(guī)品種（open-pollinated），以及1份土耳其紫色地方品種（表1），均通過商業(yè)購買獲得。2013年7月25日（2013-秋）、2014年3月10日（2014-春）分別在本所順義基地進(jìn)行露地播種，常規(guī)管理。

1.2 田間農(nóng)藝性狀調(diào)查及數(shù)據(jù)分析

田間農(nóng)藝性狀調(diào)查主要包括葉著生角度、葉面茸毛、葉型、葉色、葉基部花青素、根肩型、根肩綠色程度、根型、根尖型、根表皮顏色、根肉色、根心柱顏色、抽薹率、葉長、根長、根粗等16項(xiàng)。

葉長、根長和根粗為連續(xù)性變異，分別計(jì)算其平均值（X）和標(biāo)準(zhǔn)差（σ），進(jìn)行10級分類，1級＜X-2σ，10級≥X+2σ，中間每級別差0.5σ（王述民等，2002），每個(gè)性狀的多樣性指數(shù)的計(jì)算公式為：H’=-Σ piln pi，其中H’為Shannon-Weaver多樣性指數(shù)，pi為某性狀第i級材料份數(shù)占總份數(shù)的百分比。其他13項(xiàng)農(nóng)藝性狀采用賦值后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，賦值依據(jù)胡蘿卜種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)（莊飛云和朱德蔚，2007）。利用R3.1.1軟件對春秋兩季田間農(nóng)藝性狀進(jìn)行主成分（principle component，PC）分析（Detlef et al.，2013），通過第一、第二主成分系數(shù)構(gòu)建PC圖。

表1 供試胡蘿卜品種資源

1.3 SSR標(biāo)記分析

每份試材隨機(jī)選取6～10株植株幼嫩葉片混合取樣，冷凍抽干，-80 ℃冰箱貯存。研碎后取約100 mg放入2 mL離心管，參照Doyle和Doyle（1987）改良的CTAB法提取DNA，工作液濃度稀釋至30 ng·μL-1。參照Cavagnaro等（2011）發(fā)表的304對SSR引物，利用胡蘿卜品種C3、C37、L1、B0214篩選出38對條帶清晰、位點(diǎn)多態(tài)性明顯的SSR引物。PCR反應(yīng)體系為10 μL，包括2 μL （30 ng·μL-1）DNA，0.4 μL（2.5 mmol·L-1）dNTPs，上下游引物各0.25 μL（10 μmol·L-1），10×PCR Buffer（ 含 Mg2+）1 μL和 0.1 μL（2.5 U·μL-1）Tap酶，在MultiGene PCR儀中（Labnet，美國）進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性20 s，50～60 ℃退火 （參考不同引物）45 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物4 ℃保存。6 %聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯色。根據(jù)Cavagnaro等（2011）發(fā)表的引物擴(kuò)增片段大小，統(tǒng)計(jì)電泳圖譜上的條帶，在同一位置出現(xiàn)的條帶記為“1”，無條帶記為“0”。

用PowerMarker V3.25軟 件 進(jìn) 行 UPGMA（unweighted pair-group method using arithmetic averages）聚類分析（Liu & Muse，2005）。遺傳多態(tài)性分析采用多態(tài)性信息含量（polymorphism information content，PIC）指標(biāo)，按照Anderson等（1993）的計(jì)算方法，標(biāo)記i的PIC值計(jì)算公式為：PICi=1–ΣPij2，其中Pij表示標(biāo)記i第j種帶型出現(xiàn)的頻率，本試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)帶型為“0”和“1”。PIC值范圍為0～1，0表示無多態(tài)性，1表示具有多態(tài)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 春秋兩季胡蘿卜田間農(nóng)藝性狀數(shù)據(jù)分析

在調(diào)查的13個(gè)田間農(nóng)藝性狀中（表2），2013年秋季橘色栽培品種葉色的多樣性指數(shù)為1.09，高于地方資源的0.84，其余12個(gè)性狀中，地方資源多樣性指數(shù)均高于橘色栽培品種。2014年春季橘色栽培品種葉著生角度、葉面茸毛、葉型、根肩型、根型、根尖型的多樣性指數(shù)高于地方資源。橘色栽培品種抽薹率春秋兩季之間存在顯著差異，秋季抽薹率多樣性指數(shù)為0，而春季為0.53。綜合比較兩季13個(gè)性狀的多樣性指數(shù)平均值，地方資源均高于橘色栽培品種。

春秋兩季之間橘色栽培品種和地方資源的葉長變異較大（表3），橘色栽培品種2013年秋季、2014年春季平均葉長分別為62.4 cm和52.5 cm，變幅分別為40.8～80.2 cm和33.2～73.0 cm，變異系數(shù)和多樣性指數(shù)相似；地方資源2013年秋季、2014年春季的平均葉長分別為50.7 cm和70.0 cm，變幅分別為38.3～69.4 cm和50.2～91.0 cm，變異系數(shù)和多樣性指數(shù)存在較大差異。橘色栽培品種和地方資源的根長和根粗在春秋兩季之間差異不明顯，但地方資源的根長和根粗變異系數(shù)要明顯高于橘色栽培品種，而兩者多樣性指數(shù)則相似。

表2 橘色栽培品種和地方資源田間農(nóng)藝性狀多樣性指數(shù)（H’）比較

表3 橘色栽培品種和地方資源數(shù)量性狀比較

2.2 田間農(nóng)藝性狀主成分分析

通過田間農(nóng)藝性狀主成分分析，春秋兩季材料分布存在明顯差異（圖1）。秋季前9個(gè)性狀主成分累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為72.9%，第一主成分為根表皮顏色、根肉色，第二主成分為葉長，第三主成分為根心柱顏色。春季前7個(gè)性狀主成分累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為76.6%，第一主成分為根心柱顏色、抽薹率，第二主成分為葉基部花青素，第三主成分為葉長、根粗（數(shù)據(jù)未列出）。秋季胡蘿卜栽培橘色地方資源與橘色栽培品種重疊區(qū)域較多，即秋季兩者表型相似品種較多，但橘色地方資源變異范圍較大（圖1-A）。春季橘色地方資源和橘色栽培品種表型特征差異較大，只有少部分重疊（圖1-B），部分分布在其他根色資源品種之間。紅色和黃色地方資源在春秋兩季均形成自身分布區(qū)域，兩者之間沒有重疊。橘黃色品種B0089在兩季均介于橘色和紅色地方資源之間。紫色品種L1在兩季均分布在外圍。

圖1 春秋季田間農(nóng)藝性狀主成分分析

2.3 SSR標(biāo)記聚類分析

表4顯示38對SSR引物共擴(kuò)增出133個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，平均多態(tài)性位點(diǎn)3.5個(gè)。其中地方資源的多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)（122個(gè)）與橘色栽培品種（116個(gè)）相當(dāng)，但是地方資源平均多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)（4.2）高于橘色栽培品種（2.9），特有位點(diǎn)數(shù)（12個(gè)）也多于橘色栽培品種（7個(gè)）。而且地方資源的多樣性信息含量值（0.74±0.06）明顯高于橘色栽培品種（0.42±0.03）。

聚類結(jié)果顯示胡蘿卜材料可分為2組（圖2），第I組包括所有橘色栽培品種和中國橘色地方資源B0241，而第Ⅱ組包含其他地方資源和紫色品種L1。I組中又可分為2個(gè)亞組，Ⅰa由來自俄羅斯的C27、C31、C33、C34、C36、C38和C39，加拿大的C20和C21，荷蘭的C24、C22和中國臺灣的C15等組成；Ib主要包括國內(nèi)育種公司引進(jìn)推廣的橘色栽培品種，包括日本、韓國的黑田類型，其中B0241、C10、C40、C29、C25分布在最外圍。Ⅱ組也可分為2個(gè)亞組，Ⅱa包括中國大部分地方橘色資源、紅色B0059、橘黃色B0089和紫色L1，Ⅱb由其他橘色、紅色以及黃色中國地方資源組成，而且這些不同顏色資源呈相間分布。

表4 胡蘿卜品種資源SSR位點(diǎn)多態(tài)性分析

圖2 SSR標(biāo)記聚類結(jié)果

3 結(jié)論與討論

中國是胡蘿卜種植面積最大的國家，近十年間生產(chǎn)面積3 不斷結(jié)增論長與，我討國論胡蘿卜產(chǎn)業(yè)正處于數(shù)量快速增長向質(zhì)量中發(fā)國展是的胡轉(zhuǎn)蘿型卜期種，植但面品積種最單大一的、國病家蟲，害近泛濫、缺于少數(shù)適量應(yīng)快現(xiàn)速有增栽長培向模質(zhì)式量品發(fā)種展等的成轉(zhuǎn)為型制期約，我但國品胡蘿卜產(chǎn)種業(yè)等發(fā)成展為的制主約要我問國題胡，蘿篩卜選產(chǎn)抗業(yè)逆發(fā)性展資的源主和要培問育優(yōu)良品胡種蘿是卜目發(fā)前展我的國首胡要蘿任卜務(wù)發(fā)。本展試的驗(yàn)首通要過任對務(wù)。29本份試驗(yàn)通過間對農(nóng)2藝9性份狀中變國異地和方多資樣源性和分40析份發(fā)橘現(xiàn)色，栽胡培蘿品卜種春秋兩方季資田源間差農(nóng)異藝不性大狀，變但異綜和合多比樣較性其分余析1發(fā)3個(gè)現(xiàn)性，胡蘿卜橘種色，栽說培明品中種國葉地長方、資根源長表、型根多粗樣多性樣豐性富指。數(shù)通

與地方資源差異不大，但綜合比較其余13 個(gè)性狀，地方資源多樣性指數(shù)平均值高于橘色栽培品種，說明中國地方資源表型多樣性豐富。通過表型性狀主成分分析，發(fā)現(xiàn)春秋兩季橘色栽培品種分布集中，表型較為一致，遺傳背景較為單一；而地方資源品種分布較分散，黃色、紅色資源形成獨(dú)立的區(qū)域，表型變異較大，并且我國橘色地方資源介于其他資源之間，表型變異較橘色栽培品種大。結(jié)合表型多樣性指數(shù)分析結(jié)果，說明我國胡蘿卜地方資源表型具有豐富的多樣性。通過SSR 標(biāo)記研究發(fā)現(xiàn)中國胡蘿卜地方資源的多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)、特有位點(diǎn)數(shù)以及多樣性PIC值均高于橘色栽培品種，與表型鑒定結(jié)果一致，這為深入開展抗性資源篩選提供了依據(jù)。

通過聚類分析發(fā)現(xiàn)，市場上銷售的所有橘色栽培品種聚到了第I組，包含加拿大丹佛斯類型品種C16和南特斯類型品種C17、C18、C19，俄羅斯阿姆斯特丹類型C37等常規(guī)品種，以及荷蘭Bejo、韓國世農(nóng)等育種公司推廣的C1、C25、C40等雜交品種，說明國內(nèi)外橘色胡蘿卜栽培品種親緣關(guān)系較近。Ⅱ組由橘色、紅色以及黃色資源組成，而且在Ⅱb亞組這些不同顏色資源呈相間分布，說明中國橘色資源可能來自于本地紅色或黃色資源的突變，這與Banga（1957）和Iorizzo等（2013）提出的橘色胡蘿卜可能選自黃色栽培品種的觀點(diǎn)較為相似。同時(shí)，土耳其地方品種L1與中國橘色地方資源聚到了一起，這與Rong等（2014）結(jié)果一致。綜上所述，中國胡蘿卜品種可能存在自身獨(dú)特的馴化過程，其中橘色資源并不是從日本黑田類型演化形成的，實(shí)際上日本黑田類型品種是由歐洲引進(jìn)的品種與亞洲資源雜交選育而成的（Simon et al.，2008）。

歐承剛，莊飛云，趙志偉，黃建新． 2009． 胡蘿卜主要病害及抗病育種研究進(jìn)展． 中國蔬菜，（4）：1-6．

王述民，曹永生，胡家蓬． 2002． 我國小豆種質(zhì)資源形態(tài)多樣性鑒定與分類研究． 作物學(xué)報(bào)，28 （6）：727-733．

朱德蔚，王德檳，李錫香． 2008． 中國作物及其野生近緣植物． 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社：93-114．

莊飛云，趙志偉，李錫香，胡鴻，方智遠(yuǎn)． 2006． 中國地方胡蘿卜品種資源的核心樣品構(gòu)建． 園藝學(xué)報(bào)，33 （1）：46-51．

莊飛云，朱德蔚． 2007． 胡蘿卜種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社．

Ali A，William C M，Cavagnaro P F，Iorizzo M，Roberts P A，Simon P W. 2013. Inheritance and mapping of Mj-2，a new source of rootknot nematode （Meloidogyne javanica）resistance in carrot. Journal of Heredity，105 （2）：288-291.

Anderson J A，Churchill G A，Aurtique J E，Tanksley S D，Sorrells M E. 1993.Optimizing parental selection for genetic linkage maps. Genome，36 （1）：181-186.

Banga O. 1957. The development of the original European carrot material. Euphytica，6：64-76.

Boiteux L S， Vecchia P T D，Reifschneider F J B. 1993. Heritability estimate for resistance to Alternaria dauci in carrot. Plant Breeding，110：165-167.

Cavagnaro P F，Chung S M，Manin S，Yildiz M，Ali A，Alessandro M S，Iorizzo M，Senalik D A，Simon P W. 2011. Microsatellite isolation and marker development in carrot-genomic distribution，linkage mapping，genetic diversity analysis and marker transferability across Apiaceae. BMC Genomics，12：386-407.

Detlef G，Stefanie H，Sebastian K，Joachim S. 2013. Principal components analysis. Methods in Molecular Biology，930：527-547.

Doyle J J，Doyle J L. 1987. A rapid DNA isolation method for small quantities of fresh tissues. Phytochem Bull，19：11-15.

Grzebelus D，Iorizzo M，Senalik D，Ellison S，Cavagnaro P F，Alicja M P，Kasia H U ，Kilian A，Thomas N，Allender C，Simon P W，Rafal B. 2014. Diversity，genetic mapping，and signatures of domestication in the carrot（Daucus carota L.）genome，as revealed by Diversity Arrays Technology（DArT）markers. Molecular Breeding，33：625-637.

Heywood V H. 1983. Relationships and evolution in the Daucus carota complex. Israel Journal of Ecology and Evolution，32： 51-65.

Iorizzo M，Douglas A S，Shelby L E S，Grzebelus D，Cavagnaro P F，Allender C，Brunet J，Spooner D M，Allen D V，Simon P W. 2013. Genetic structure and domestication of carrot（Daucus carota subsp. stivus）（Apiaceae）. American Journal of Botany，100 （5）：930-938.

Liu K J，Muse S V. 2005. PowerMarker：an integrated analysis environment for genetic marker date. Bioinformatics，9：2121-2129.

Rong J，Lanmers Y，Strasburg J L，Schidlo N S，Ariyurek Y，de Jong T J，Klinkhamer P G，Smulders M J，Vrieling K. 2014. New insights into domestication of carrot from root transcriptome analyses. BMC Genomics，15：895-909.

Simon P W， Freeman R E， Vieira J V， Boiteux L S， Briard M， Nothnagel T， Michalik B， Kwon Y S. 2008. Carrot//Prohens J， Nuez F. Vegetables Ⅱ: Fabaceae， Liliaceae， Solanaceae， and Umbelliferae. Handbook of Plant Breeding Vol 2. New York：Springer：327-357.

Stolarczyk J，Janick J. 2011. Carrot：history and iconography. Chronica Horticulture，51：13-18.

Vieira J V，Charchar J M，Arag?o F A S，Boiteux L S. 2003. Heritability and gain from selection for field resistance against multiple root-knot nematode species（Meloidogyne incognita race 1 and M. javanica）in carrot. Euphytica，130：11-16.

Abstract：Genetic diversity and relationship between 29 Chinese carrot landraces，40 orange varieties and 1 Turkey purple cultivar were investigated using phenotypic and SSR markers. Phenotypic result showed that diversity index of orange varieties was lower than Chinese landraces except for leaf length，root length and root diameter. Principal component analysis showed that Chinese orange landraces had similar phenotypic variation with orange varieties in the autumn，but different in the spring. 133 polymorphic loci were amplified from 38 pairs of SSR primers. The average number of polymorphic loci of Chinese carrot landraces and orange varieties were 4.2 and 2.9，respectively. PIC value of Chinese carrot landraces（0.74±0.06）was obviously higher than that of orange varieties（0.42±0.03）. All accessions were divided into 2 groups: group I including orange varieties and orange B0241，and group Ⅱ containing other landraces and purple cultivar L1.

Studies on Genetic Diversity and Relationship of Carrot Varieties and Germplasm Resources

MA Zhen-guo，OU Cheng-gang，LIU Li-jie，ZHAO Zhi-wei，ZHUANG Fei-yun*
（Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops，Beijing 100081，China）

Carrot；Phenotype；SSR；Cluster analysis；Genetic diversity；Relationship

馬振國，男，碩士研究生，專業(yè)方向：蔬菜遺傳育種，E-mail：mazhenguo2015@163.com

*通訊作者（Corresponding author）：莊飛云，男，博士，副研究員，碩士生導(dǎo)師，專業(yè)方向：蔬菜遺傳育種，E-mail：zhuangfeiyun@caas.cn

2015-04-15；接受日期：2015-06-01

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（2060302-2），國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2013BAD01B04），國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31272162），中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程項(xiàng)目