神經(jīng)酰胺通過JNK/c-Jun信號(hào)通路誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬性死亡

張露勇，張淼，劉師卜，李銳

神經(jīng)酰胺通過JNK/c-Jun信號(hào)通路誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬性死亡

張露勇1，張淼2，劉師卜1，李銳3

目的 探討神經(jīng)酰胺對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞87-MG和U251自噬性死亡的作用及機(jī)制。方法 采用MTT和流式細(xì)胞的方法檢測(cè)不同濃度神經(jīng)酰胺刺激87-MG和U251細(xì)胞后細(xì)胞存活和凋亡的改變；電鏡和Western blotting技術(shù)檢測(cè)自噬和JNK/c-Jun信號(hào)通路的改變，JNK藥理性抑制劑SP600125特異性抑制JNK通路，觀察其對(duì)神經(jīng)酰胺誘導(dǎo)自噬死亡的影響。結(jié)果 神經(jīng)酰胺刺激24 h后，87-MG和U251存活呈現(xiàn)時(shí)間依賴性下降(P＜0.05)；相應(yīng)的細(xì)胞死亡數(shù)目劑量依賴性升高(P＜0.05)，但凋亡性死亡比例較低；神經(jīng)酰胺刺激后鏡下觀察到的自噬小體計(jì)數(shù)，LC3B/LC3A和Beclin-1的表達(dá)以及JNK/c-Jun的磷酸化程度都增加(P＜0.05)。提前給予SP600125抑制JNK信號(hào)通路的活性后，可以阻斷神經(jīng)酰胺誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬性死亡(P＜0.05)。結(jié)論 神經(jīng)酰胺可誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞87-MG和U251出現(xiàn)自噬性死亡，機(jī)制可能與JNK信號(hào)通路的活化有關(guān)。

膠質(zhì)瘤；神經(jīng)酰胺；自噬性死亡；JNK信號(hào)通路

[本文著錄格式] 張露勇，張淼，劉師卜，等.神經(jīng)酰胺通過JNK/c-Jun信號(hào)通路誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬性死亡[J].中國康復(fù)理論與實(shí)踐,2015,21(8):905-912.

CITED AS:Zhang LY,Zhang M,Liu SB,et al.Autophagic cell death in glioma cell induced by ceramide through JNK/c-Jun pathway[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(8):905-912.

神經(jīng)酰胺(ceram ide,Cer)是生物膜上 “脂筏”的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，屬于神經(jīng)鞘脂類。此外，Cer作為第二信使發(fā)揮重要的生物學(xué)功能[1-2]。在腫瘤領(lǐng)域，Cer被認(rèn)為是有效的預(yù)防劑/治療劑，得到國內(nèi)外專家學(xué)者的廣泛關(guān)注。一些腫瘤的治療藥物和射線等都可以通過調(diào)節(jié)Cer的合成，最終促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，發(fā)揮良好的抗腫瘤功能[3]。過去的研究提示，Cer可以活化多種信號(hào)通路，比如激酶抑制因子(kinase suppressor of Ras, KSR)/Raf、蛋白激酶C(protein kinases C,PKC)和c-Jun的氨基末端蛋白激酶(C-Jun N-term inal kinase,JNK)等，最終誘導(dǎo)細(xì)胞的死亡[4]。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，Cer也可通過降低特定部位的黏著斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)表達(dá)的水平，抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲[5]。Cer既是JNK的激活劑，又參與細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)[6]，然而JNK在Cer誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的自噬性死亡中的關(guān)系尚未明確[7-8]。

1 材料和方法

1.1 材料

87-MG和U251細(xì)胞：中國科學(xué)院上海細(xì)胞所細(xì)胞庫。Cer和MTT試劑盒：美國SIGMA公司。DMEM培養(yǎng)基：美國GIBICO公司。Annexin V/PI流式試劑盒：美國BD PHARM INGINE公司?？笿NK、phospho-JNK、c-Jun和phospho-c-Jun抗體：美國CELL SINGNALING公司?？筁C3抗體和工具藥(SP600125和3-MA)：美國SIGMA公司。辣根酶過氧化物標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗：美國SANTACRUZ公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理

87-MG和U251細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含有體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清、10 mmol/L羥乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、100μg/m l青霉素、100μg/m l鏈霉素和3%谷氨酞胺的DMEM完全培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1～2 d換1次液。細(xì)胞長滿約90%后用胰酶進(jìn)行消化，1∶4傳代。3-MA和SP600125的終濃度分別為10mmol/L和10μmol/L，預(yù)處理細(xì)胞1 h后加入Cer(64mmol/L的DMSO儲(chǔ)液，4℃保存)。

1.2.2 MTT法測(cè)定細(xì)胞活力

87-MG和U251細(xì)胞分別以3×103/孔的密度接種于96孔板，分別加入4μmol/L、8μmol/L、16μmol/ L、32μmol/L、64μmol/L的Cer，作用24 h后加入5 g/LMTT溶液，37℃培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液。最后加入DMSO 0.2m l。待結(jié)晶溶解后，在570 nm波長處酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值(A)和半抑制濃度(halfmaximal inhibitory concentration,IC50)。

1.2.3 流式測(cè)定細(xì)胞凋亡

30μmol/L Cer刺激87-MG和U251，分別作用0 h、6 h、12 h、24 h后用胰酶消化。消化物1500 r/m in離心15min，加入AnnexinⅤ4μl和PI5μl，常溫避光孵育15 min。上流式細(xì)胞儀測(cè)定(Becton Dickinson)，軟件分析(cellquest)。

1.2.4 Western blotting

30μmol/LCer分別刺激87-MG和U251細(xì)胞6 h、12 h、24 h，棄培養(yǎng)基，PBS清洗2次，加細(xì)胞裂解液后冰上孵育15m in，收集細(xì)胞，4℃、12000 r/m in離心15m in，留取上清。用BCA蛋白定量后，加入4× SDS-PAGE上樣緩沖液，100℃水浴10m in，對(duì)蛋白進(jìn)行變性處理，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｈ】偟鞍?5μg的各組樣品，SDS-PAGE電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜后封閉，1∶1000加一抗(anti-LC3；anti-Beclin-1；anti-JNK；anti-p-JNK；anti-c-JUN；anti-p-c-JUN；anti-GAPH)4℃孵育，次日1∶5000加入二抗，室溫?fù)u床2 h。最后ECL顯色，暗室曝光。

1.2.5 電鏡觀察自噬小體

30μmol/L Cer處理87-MG和U251細(xì)胞24 h后，PBS洗3次，加入2.5%戊二醛溶液固定2.5～3 h。棄戊二醛，0.1mol/L的PBS洗3次。隨后用1%餓酸后固定2 h。乙醇逐級(jí)脫水后用乙酸異戊酯替換細(xì)胞內(nèi)酒精，臨界點(diǎn)干燥后送電鏡室。HITACHIH-7650型透射電鏡觀察自噬體、溶酶體的形態(tài)及數(shù)量，并攝片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞存活率

不同濃度Cer作用24 h后87-MG(F=8.09,P＜0.05) 和U251(F=9.07,P＜0.05)細(xì)胞抑制率具有劑量依賴性；IC50分別為5.57μmol/L和15.27μmol/L，95%可信區(qū)間分別為(1.9×10-5,2.4×10-5)和(1.8×10-5,2.3×10-5)。見圖1。

可見Cer對(duì)兩種惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞均有較強(qiáng)的抑制作用，且87-MG細(xì)胞的敏感性高于U251細(xì)胞。32 μmol/L Cer即可產(chǎn)生明顯抑制細(xì)胞存活的作用(P＜0.01)，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)我們采用近似濃度(30μmol/L)進(jìn)行檢測(cè)，與本室前期機(jī)制相關(guān)實(shí)驗(yàn)保持一致。

2.2 細(xì)胞凋亡

隨著Cer濃度的增加，兩種細(xì)胞PI陽性率(壞死細(xì)胞)逐漸增加，作用1 h后即表現(xiàn)出顯著性差異(F= 7.01,F=6.72,P＜0.05)。

Cer作用后，兩種細(xì)胞的Annexin V陽性率(早期凋亡)均較低，且Cer作用后不同時(shí)間點(diǎn)，細(xì)胞早期凋亡無顯著性差異(P＞0.05)。見圖2。

2.3 細(xì)胞自噬水平

給藥0 h、6 h、12 h、24 h后，LC3B/LC3A水平表達(dá)水平逐漸上調(diào)。作用12 h后，兩種細(xì)胞的LC3B/ LC3A表達(dá)水平均明顯高于0 h(F=8.59,F=7.31,P＜0.01)；87-MG中Beclin-1表達(dá)水平明顯高于0 h(F= 9.85,P＜0.01)。作用24 h后，U251中Beclin-1表達(dá)水平明顯增加(F=7.59,P＜0.01)。見圖3A、3C。

給予3-MA后，LC3B/LC3A(P＜0.05)和Beclin-1的表達(dá)水平降低(P＜0.01)，見圖3B、3D。腫瘤細(xì)胞死亡減少(F=5.09,P＜0.01)，見圖4A、4B。電鏡下可以觀察到Cer誘導(dǎo)自噬小體數(shù)目的增加。見圖4C、4D。

圖1 不同濃度Cer對(duì)87-MG and U251細(xì)胞增殖的影響

2.4 Cer激活JNK/c-Jun信號(hào)通路促進(jìn)自噬的發(fā)生

87-MG和U251細(xì)胞中JNK的磷酸化水平升高(F= 8.59,F=9.29,P＜0.01)，并隨作用時(shí)間的延長激活作用越明顯。JNK下游重要的轉(zhuǎn)錄因子c-Jun的磷酸化水平也明顯上調(diào)(F=8.14,F=9.01,P＜0.01)，并具有時(shí)間依賴性。見圖5A、5B。

應(yīng)用JNK高選擇性抑制劑SP600125預(yù)處理87-MG和U251細(xì)胞1 h后，聯(lián)用SP600125與單用Cer相比，可以抑制JNK激酶的磷酸化(F=7.59,F=8.29, P＜0.05)，并減少LC3A向LC3B的轉(zhuǎn)化(F=7.36,F= 7.39,P＜0.05)。見圖6A、6B。

3 討論

細(xì)胞死亡主要有程序性死亡和非程序性死亡兩大類。近年來，自噬性死亡作為一種新的程序性死亡方式，成為生物學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

自噬又被稱為第二類程序性死亡，該過程首先是細(xì)胞形成雙層膜結(jié)構(gòu)包裹待降解物質(zhì)形成自噬小體，后者與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體，最終待降解物質(zhì)在酶的作用下被降解清除。

自噬在腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮極為重要的作用。眾多研究發(fā)現(xiàn)，多種治療方法都可以激活腫瘤細(xì)胞的自噬過程，自噬被認(rèn)為是抗腫瘤藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡的機(jī)制之一[9]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的膠質(zhì)瘤具有高發(fā)病率、高惡性的特點(diǎn)，至今公認(rèn)的治療手段是手術(shù)與放、化療綜合處理。但惡性較高的膠質(zhì)瘤在術(shù)后易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，病患平均的生存時(shí)間只有13個(gè)月[10]。保守的藥物治療又很容易引起耐藥性的出現(xiàn)。

綜上所述，尋找新的藥物靶點(diǎn)，對(duì)惡性膠質(zhì)瘤的治療十分關(guān)鍵。越來越多數(shù)據(jù)顯示，自噬在藥物抗腫瘤的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，比如替莫唑胺[11]、姜黃素[12]、原人參萜二醇[13]等的抗腫瘤作用均與自噬的誘導(dǎo)有關(guān)。近年來有關(guān)Cer促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡的機(jī)制研究得到越來越多重視[14]，但其誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的作用是否與自噬相關(guān)還不清楚。

我們前期的實(shí)驗(yàn)證明Cer可以活化下游的JNK信號(hào)，介導(dǎo)大鼠腦膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞的自噬性死亡。然而該細(xì)胞株不能代表所有的膠質(zhì)瘤，有一定的局限性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Cer誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬性死亡的普遍性，我們進(jìn)一步在不同遺傳背景和不同敏感性的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中進(jìn)行研究。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Cer可劑量依賴性地降低87-MG和U251細(xì)胞的存活率，增加細(xì)胞的死亡率，與前期C6細(xì)胞系的結(jié)果相一致。但Annexin V-FITC/PI雙染的數(shù)據(jù)提示，凋亡細(xì)胞只占死亡細(xì)胞的極少部分，因此推測(cè)Cer誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡可能是凋亡之外的其他方式。

為了更好地研究自噬，自噬的檢測(cè)方法尤為重要。自噬相關(guān)蛋白的檢測(cè)是常用方法之一。如自噬相關(guān)蛋白LCA3向LC3B的轉(zhuǎn)化，參與自噬小體的形成，LC3B/LC3As比值反映了細(xì)胞的自噬水平的高低[15]。Beclin-1也是自噬調(diào)節(jié)的一個(gè)重要基因，可以通過與Vps34/PI3K形成復(fù)合物參與自噬小體的形成[16-17]，Beclin-1的雜合性缺失被認(rèn)為是腫瘤惡性轉(zhuǎn)化的原因之一[18]。

圖2 Cer對(duì)87-MG和U251細(xì)胞凋亡的影響

圖3 Western blotting檢測(cè)Cer對(duì)自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin-1水平的調(diào)控

圖4 Cer通過促進(jìn)自噬誘導(dǎo)87-MG和U251細(xì)胞的死亡

圖5 Western bloting 檢測(cè)Cer對(duì)JNK信號(hào)通路的影響

圖6 JNK抑制劑SP600125逆轉(zhuǎn)Cer誘導(dǎo)的87-MG and U251細(xì)胞自噬水平的增加

本研究發(fā)現(xiàn)，Cer作用時(shí)間的延長可以誘導(dǎo)87-MG和U251細(xì)胞LC3B和Beclin-1表達(dá)水平的升高，并具有時(shí)間依賴性，提示Cer可以誘導(dǎo)87-MG和U251通過自噬途徑死亡，與流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果一致。在細(xì)胞應(yīng)對(duì)外界刺激的過程中，Cer能夠激活信號(hào)通路包括JNK并誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[19]。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提示，放射線和化療藥物作用于腫瘤后可以產(chǎn)生Cer，后者作為第二信使，可以活化下游JNK信號(hào)通路[5]。最新的數(shù)據(jù)還顯示，JNK信號(hào)通路和細(xì)胞自噬也密切相關(guān)[20]。應(yīng)用半胱氨酸酶(caspase)的藥理性抑制劑zVAD抑制caspase-8，或者小干擾RNA沉默caspase-8，都可以激活纖維母細(xì)胞中JNK信號(hào)通路介導(dǎo)的自噬性死亡[8]。還有研究認(rèn)為，JNK可以磷酸化Bcl-2的多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，降解Bcl-2-Beclin1的復(fù)合物，游離Beclin-1，進(jìn)而誘導(dǎo)自噬[21]。如上所述，JNK信號(hào)與自噬的關(guān)系十分密切，且是Cer下游的重要信號(hào)通路之一。在本項(xiàng)研究中，我們發(fā)現(xiàn)JNK信號(hào)的活化在Cer誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬的環(huán)節(jié)中發(fā)揮十分關(guān)鍵的作用。Cer能明顯上調(diào)87-MG和U251細(xì)胞中JNK及其下游轉(zhuǎn)錄因子c-Jun的磷酸化程度。當(dāng)借助JNK特異性抑制劑SP600125抑制JNK的活性后，Cer誘導(dǎo)的自噬激活被逆轉(zhuǎn)。

綜上所述，JNK可能是Cer誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬死亡的機(jī)制之一。Cer通過上調(diào)JNK信號(hào)通路，介導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡，為抗腫瘤藥物的開發(fā)提供了新的思路。

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Autophagic CellDeath in G lioma Cell Induced by Ceram ide through JNK/c-Jun Pathway

ZHANG Lu-yong1,ZHANGMiao2,LIU Shi-bu1,LIRui3
1.Institute for Food and Cosmetics Control,National Institutes for Food and Drug Control,Beijing 100044,China; 2.Departmentof PharmaceuticalCare,Chinese PLAGeneralHospital,Beijing 100853,China;3.Departmentof Neurosurgery,China-Japan Friendship Hospital,Beijing 100029,China

Objective To observe the autophagy of 87-MG and U251 glioma cells induced by ceramide and explore the possiblemechanism.Methods The viability and apoptosisof 87-MG and U251 cellswere detected by MTT assay and flow cytometry,respectively.Autophagic-related protein expressions of LC3B/LC3A and Beclin-1 were determined byWestern blotting.The activation of JNK/c-Jun signaling pathway induced by ceram idewith orwithout the treatmentof JNK specific inhibitor SP600125 was alsomeasured.Results 24 hours after treatmentof ceram ide,the grow th of 87-MG and U251 cellswas significantly inhibited time-dependently(P＜0.05);and the number of autophagic cells increased dose-dependently(P＜0.05).The levels of LC3B/LC3A and Beclin-1 significantly increased after ceram ide treatment(P＜0.05).JNK signaling pathway wasactivated in the87-MG and U251 cellsand the phosphorylation of c-Jun also increased after ceramide treatment.This activation of autophagy could be reversed by the pre-treatmentof SP600125.Conclusion Ceramidemay induce autophagy in 87-MG and U251 glioma cellsand themechanism may be related to the activation of JNK/c-Jun signaling pathway.

glioma cell;ceram ide;autophagic celldeath;JNK signaling pathway

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.08.007

R730.264

A

1006-9771(2015)08-0905-08

2015-04-08

2015-06-12)

1.中國食品藥品檢定研究院食品化妝品所，北京市100044；2.中國人民解放軍總醫(yī)院外科藥房，北京市100853；3.中日友好醫(yī)院神經(jīng)外科，北京市100029。作者簡介：張露勇(1980-)，男，漢族，山東榮成市人，碩士，助理研究員，主要從事食品、保健食品、化妝品的功能毒理評(píng)價(jià)研究工作。通訊作者：李銳(1971-)，男，漢族，云南昆明市人，主治醫(yī)師，主要從事神經(jīng)相關(guān)疾病的研究。E-mail:reedleer@sina.com。