原花青素對(duì)大鼠脊髓損傷后神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)的影響

陳春梅

原花青素對(duì)大鼠脊髓損傷后神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)的影響

陳春梅

目的 觀察原花青素對(duì)脊髓損傷后大鼠膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)表達(dá)變化的影響。方法 48只健康成年Sprague-Daw ley大鼠分為原花青素組(A組)和對(duì)照組(B組)。采用Allen法復(fù)制大鼠T9急性脊髓損傷模型，于術(shù)后1 d、3 d和7 d對(duì)各組大鼠行后肢運(yùn)動(dòng)功能BBB評(píng)分和斜板試驗(yàn)；測(cè)定血清丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)；以及免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)脊髓GFAP和BDNP的表達(dá)。結(jié)果 術(shù)后3 d、7 d，A組大鼠BBB評(píng)分和斜板試驗(yàn)成績(jī)均優(yōu)于B組(P＜0.05)。術(shù)后1 d、3 d及7 d，A組大鼠血清SOD活性和MDA含量?jī)?yōu)于B組(P＜0.05)。術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)，A組GFAP表達(dá)均明顯低于B組(P＜0.01)；A 組BDNF表達(dá)均顯著高于B組(P＜0.001)。結(jié)論 原花青素可有效抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，抑制脊髓損傷后大鼠脊髓組織GFAP的表達(dá)，促進(jìn)內(nèi)源性BDNF的合成，從而促進(jìn)脊髓損傷大鼠功能恢復(fù)。

脊髓損傷；原花青素；神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白；神經(jīng)生長(zhǎng)因子；大鼠

[本文著錄格式] 陳春梅.原花青素對(duì)大鼠脊髓損傷后神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2015,21(8):883-888.

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脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)是一種主要由異常外力(交通事故、運(yùn)動(dòng)、塌方、高空墜落摔傷、高空墜物砸傷以及地震等自然災(zāi)害引起的外力)作用脊柱而導(dǎo)致的創(chuàng)傷性疾病，其發(fā)病率高，往往造成不同程度的四肢癱或截癱。

脊髓損傷可以分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷兩類。原發(fā)性損傷是指損傷即刻的機(jī)械性暴力引起的椎管連續(xù)性破壞，骨折或脫位壓迫脊髓等形式的損傷，這種損傷往往是不可逆轉(zhuǎn)的；繼發(fā)性損傷是在原發(fā)性損傷的基礎(chǔ)上，由于繼發(fā)性水腫，炎癥反應(yīng)，局部缺血，細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子及過(guò)氧化基團(tuán)異常變化等對(duì)脊髓產(chǎn)生的毒害作用，這種繼發(fā)性損害可能更嚴(yán)重并可造成永久性功能障礙[1]。

目前臨床上對(duì)脊髓損傷的治療除及時(shí)、有效地穩(wěn)定脊柱，解除脊髓壓迫，脊髓減壓等治療外，也不能忽視早期及時(shí)地應(yīng)用有效的藥物治療以減少繼發(fā)性損傷，促進(jìn)損傷脊髓的功能恢復(fù)[2-3]。

花青素是一種來(lái)源廣泛的存在于植物中的水溶性色素?；ㄇ嗨爻俗鳛橹参锷赝?，同時(shí)也是一類具有藥理功能的活性成分，具有很強(qiáng)的抗氧化功能，可以清除體內(nèi)的自由基、降低氧化酶的活性，抑制炎癥等[4-5]。同西藥相比，花青素具有天然、低毒、安全的優(yōu)勢(shì)，是一種理想的藥物選擇。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)花青素在脊髓損傷方面的研究較少。本實(shí)驗(yàn)以膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)為觀察指標(biāo)，制備脊髓損傷模型，探討經(jīng)原花青素對(duì)大鼠脊髓損傷后GFAP、BDNF表達(dá)的影響，進(jìn)而探究原花青素對(duì)脊髓損傷后早期中樞神經(jīng)功能恢復(fù)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

清潔級(jí)健康成年Sprague-Daw ley大鼠48只，雌雄不拘，體質(zhì)量(240±20)g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。按照隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為原花青素組(A 組)和對(duì)照組(B組)，每組24只。每組再分為1 d、3 d、7 d 3個(gè)亞組，每個(gè)亞組8只。

1.2 模型制備

大鼠術(shù)前常規(guī)行行為學(xué)測(cè)試，確認(rèn)其運(yùn)動(dòng)功能正常后，用1.5%戊巴比妥鈉30mg/kg腹腔注射麻醉。大鼠俯臥固定于手術(shù)臺(tái)上，背部去毛，碘伏常規(guī)消毒。沿正中線切開(kāi)大鼠背部皮膚，顯露椎板及棘突。明確T9位置后，沿緊靠棘突的兩邊切開(kāi)背部肌肉，去除椎板，暴露脊髓，用自制數(shù)字式脊髓損傷動(dòng)物模型制備儀打擊制備脊髓損傷模型(A llen法)，打擊強(qiáng)度為10 g×25mm。打擊后即刻見(jiàn)大鼠雙后肢發(fā)生不同程度抽搐，尾部甩動(dòng)，隨后完全松弛，標(biāo)志模型制備成功。逐層縫合切口。立即腹腔注射0.9%氯化鈉注射液9 m l/kg補(bǔ)液。術(shù)后每天腹腔注射8×104U青霉素鈉3 d以防感染。待動(dòng)物清醒后放回飼養(yǎng)籠中單籠飼養(yǎng)。術(shù)后大鼠自由進(jìn)食、飲水，定時(shí)清潔籠具，保持適宜室溫；每天擠壓膀胱排尿3次，直至大鼠能自主排尿。

1.3 治療方法

A組：造模成功后30m in，腹腔注射原花青素40 mg/kg，此后每天注射1次；B組：造模成功后腹腔注射等體積生理鹽水。

1.4 運(yùn)動(dòng)功能評(píng)定

于造模后1 d、3 d、7 d，各組選取8只大鼠，進(jìn)行以下測(cè)試。

1.4.1 BBB評(píng)分[6]

大鼠置于寬大活動(dòng)場(chǎng)地，采用雙人盲法觀察其后肢運(yùn)動(dòng)情況，聯(lián)合考察大鼠后肢的運(yùn)動(dòng)，軀干的位置及穩(wěn)定性、步態(tài)、協(xié)調(diào)性、爪的置放、足趾間隙及尾的位置。取左右兩側(cè)評(píng)分的平均值作為最后評(píng)分。

1.4.2 斜板試驗(yàn)[7]

大鼠置自制斜板上，墊一個(gè)橡膠墊，將大鼠身體縱軸與斜板縱軸平行，大鼠頭朝斜板抬高側(cè)，斜板傾斜角度從0°開(kāi)始緩慢上升。記錄大鼠停留在斜板上維持至少5 s時(shí)的最大角度，每次測(cè)試3遍，取平均值。采用雙人盲法。

1.5 血清中丙二醛和超氧化物歧化酶

測(cè)定行為學(xué)測(cè)試完成后，大鼠經(jīng)右心室取血3 m l，3000 r/m in離心15m in，取上清液，-20℃冰箱保存。用丙二醛(methane dicarboxylic aldehyde,MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)測(cè)定試劑盒測(cè)定，按試劑盒說(shuō)明操作。

1.6 組織取材與切片制備

每組各取8只大鼠，于運(yùn)動(dòng)功能評(píng)測(cè)后，1.5%戊巴比妥鈉30mg/kg腹腔注射麻醉。打開(kāi)胸腔，充分暴露心臟和主動(dòng)脈根部。從左心室插管到主動(dòng)脈根部，剪開(kāi)右心耳，經(jīng)左心室快速灌注肝素生理鹽水約200 m l，至肝臟及鞏膜蒼白。4%多聚甲醛150～200m l灌注40m in。以損傷處為中心切取脊髓組織約1 cm，4%多聚甲醛固定24 h。常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，連續(xù)橫切，厚5μm，用于免疫組織化學(xué)染色。

1.7 免疫組織化學(xué)染色

非生物素二步法進(jìn)行GFAP和BDNF免疫組化染色。將各組切片置于二甲苯中脫蠟，梯度酒精水化，行高壓熱抗原修復(fù)，用3%H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，正常山羊血清封閉非特異性抗原。分別滴加GFAP抗體(效價(jià)1∶500)或BDNF抗體(效價(jià)1∶20)，4℃冰箱過(guò)夜。次日用兔抗鼠二抗37℃恒溫孵育60 m in，在切片上加入DAB-H2O2顯色液，室溫下反應(yīng)，顯色充分，及時(shí)用0.01 mol/L PBS漂洗；蘇木素復(fù)染，梯度酒精逐級(jí)脫水，二甲苯透明，樹(shù)膠封片。每張切片在顯微鏡400倍下隨機(jī)拍攝5個(gè)無(wú)重復(fù)的視野，采用Image-ProPlus6.0病理圖像分析軟件測(cè)定每個(gè)視野中累積光密度和其分布面積，計(jì)算平均積分光密度值(IOD)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 運(yùn)動(dòng)功能評(píng)定

術(shù)前各組大鼠BBB評(píng)分運(yùn)動(dòng)功能正常，評(píng)分均為21分。術(shù)后1 d，兩組評(píng)分無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。術(shù)后3 d、7 d，A組評(píng)分高于B組(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組大鼠BBB評(píng)分比較

術(shù)后1 d，A組與B組斜板試驗(yàn)角度無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。術(shù)后3 d、7 d，A組角度大于B組(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

表2 兩組大鼠斜板試驗(yàn)比較(°)

2.2 SOD與MDA

術(shù)后1 d、3 d、7d，A組SOD活性高于B組(P＜0.05)；A組MDA含量低于B組(P＜0.05)。見(jiàn)表3、表4。

表3 兩組血清SOD活性比較(U/m l)

表4 兩組血清MDA含量比較(nmol/m l)

2.3 免疫組化結(jié)果

2.3.1 GFAP

GFAP主要標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞。免疫組織化學(xué)GFAP染色發(fā)現(xiàn)損傷處星形膠質(zhì)細(xì)胞呈局灶性增生，胞質(zhì)豐富且染色加深，體積增大，細(xì)胞形態(tài)不一，突起增多，隨著損傷后時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)目增多。脊髓損傷區(qū)GFAP的表達(dá)在A組比較少，分布比較均勻；在B組大部分為空洞，空洞周?chē)袕?qiáng)的GFAP表達(dá)，分布相對(duì)不均勻。脊髓損傷1 d后星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的GFAP表達(dá)明顯增高，1～7 d內(nèi)呈現(xiàn)進(jìn)行性增高趨勢(shì)。A組脊髓損傷后1 d、3 d、7 d內(nèi)損傷處GFAP表達(dá)明顯少于B組(P＜0.01)，尤其是7 d A組減少最明顯。見(jiàn)表5、圖1。

表5 兩組大鼠脊髓組織GFAP比較(IOD)

2.3.2 BDNF

術(shù)后1 d、3 d、7 d，兩組胞漿呈黃色染色，但染色強(qiáng)度不一。術(shù)后1 d兩組脊髓組織中有BDNF的微弱表達(dá)，1～7 d內(nèi)呈現(xiàn)進(jìn)行性增高趨勢(shì)。A組在術(shù)后1 d、3 d、7 d BDNF表達(dá)顯著高于B組(P＜0.001)。見(jiàn)表6、圖2。

表6 兩組大鼠脊髓組織BDNF比較(IOD)

圖1 兩組大鼠脊髓組織GFAP的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，400×)

圖2 兩組大鼠脊髓組織BDNF的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，400×)

3 討論

脊髓損傷是一種嚴(yán)重的致殘性疾病，常引起多種并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的身心健康和生存質(zhì)量，甚至危及生命。脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能的缺失及恢復(fù)程度不僅與脊髓組織遭受機(jī)械性外力所致的原發(fā)損傷有關(guān)，還與原發(fā)性損傷引起的一系列病理生理反應(yīng)所致的繼發(fā)性損傷有關(guān)。后者常是進(jìn)行性、自毀性的破壞過(guò)程，對(duì)組織的破壞程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)原發(fā)性損傷。故臨床治療的關(guān)鍵是盡量預(yù)防和治療繼發(fā)性損傷，從而降低病死率和神經(jīng)功能的喪失，促進(jìn)功能恢復(fù)。

原花青素是一類在植物界中廣泛存在的多酚化合物，它主要存在于植物的果實(shí)、種子、花和皮中，具有極強(qiáng)的抗氧化、消除自由基的作用，可有效消除超氧陰離子自由基和羥基自由基，也參與磷酸、花生四烯酸的代謝和蛋白質(zhì)磷酸化，保護(hù)脂質(zhì)不發(fā)生過(guò)氧化損傷[8-10]。國(guó)內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，原花青素能有效抑制脊髓損傷后脂質(zhì)過(guò)氧化和清除體內(nèi)過(guò)多的自由基[11]，抑制NF-кB、IL-6、TNF-α的表達(dá)[12-13]，有效控制脊髓損傷后的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)大鼠運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。國(guó)外有文獻(xiàn)報(bào)道，花青素可以增強(qiáng)神經(jīng)系統(tǒng)的穩(wěn)定性，減少缺血-再灌注所造成的腦損傷[14]，對(duì)局灶性腦缺血大鼠大腦皮質(zhì)抑凋亡基因蛋白Bcl-2和促凋亡基因蛋白Bax的表達(dá)有十分重要的影響[15]。

本研究發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷術(shù)后1～7 d A組和B組的運(yùn)動(dòng)功能均表現(xiàn)出一致的增長(zhǎng)趨勢(shì)。與B組相比，術(shù)后3 d、7 d，A組大鼠BBB評(píng)分和斜板試驗(yàn)成績(jī)均優(yōu)于B組(P＜0.05)；術(shù)后1 d、3 d及7 d，A組大鼠血清SOD活性和MDA含量?jī)?yōu)于B組(P＜0.05)。說(shuō)明原花青素可有效抑制脊髓損傷后脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，清除自由基，促進(jìn)神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。

GFAP是星型膠質(zhì)細(xì)胞的一種標(biāo)志蛋白，為其主要細(xì)胞骨架成分，相對(duì)分子質(zhì)量為50～52 kDa，存在于正常星形膠質(zhì)細(xì)胞和反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞中，它在神經(jīng)元內(nèi)環(huán)境的維持和血腦屏障中起重要作用，其表達(dá)的高低可反映星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能狀態(tài)，如星型膠質(zhì)細(xì)胞增殖和肥大的程度[16]。當(dāng)神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷時(shí)，星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)性增生，出現(xiàn)GFAP表達(dá)上調(diào)。

脊髓損傷后膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生具有雙重作用[17-18]。損傷早期，膠質(zhì)細(xì)胞分泌的層粘蛋白、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve grow th factor,NGF)和BDNF等可以誘導(dǎo)神經(jīng)纖維的生長(zhǎng)，有利于神經(jīng)元的再生[19]；但是在損傷后期，由于層粘蛋白聚集成基板，釋放一系列的細(xì)胞因子作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞使其多度增生形成膠質(zhì)瘢痕[20]，阻礙軸突的再生，也阻礙神經(jīng)元的修復(fù)，成為脊髓功能恢復(fù)的關(guān)鍵問(wèn)題之一[21]。所以抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度反應(yīng)性增生，從而抑制膠質(zhì)瘢痕的形成，將為神經(jīng)元軸突再生和功能的修復(fù)提供較好的微環(huán)境。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也提示，脊髓損傷后1～7 d內(nèi)GFAP表達(dá)呈進(jìn)行性增高趨勢(shì)，且各時(shí)間點(diǎn)A組與B組有顯著性差異(P＜0.05)，提示原花青素能抑制GFAP的表達(dá)，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度反應(yīng)性增生，從而可能創(chuàng)造有利于神經(jīng)再生的微環(huán)境，減少膠質(zhì)瘢痕的形成。

BDNF是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族中的一個(gè)重要因子，在中樞和周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)中均具有廣泛作用[22]，它參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中神經(jīng)細(xì)胞的生存、分化與生長(zhǎng)，同時(shí)還能夠維持神經(jīng)細(xì)胞的正常生理功能。在成年大鼠脊髓腹角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中亦含有BDNF，產(chǎn)物表達(dá)主要定位于胞漿中，細(xì)胞核不著色。有研究發(fā)現(xiàn)，BDNF可減輕損傷脊髓的炎癥，保護(hù)損傷的神經(jīng)細(xì)胞，減少細(xì)胞的凋亡數(shù)量，促進(jìn)軸突大量再生[23-24]。BDNF除具有誘導(dǎo)神經(jīng)突起定向生長(zhǎng)、決定感覺(jué)和交感神經(jīng)纖維生長(zhǎng)方向等神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子所具有的效應(yīng)外，還具有運(yùn)動(dòng)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性，能保護(hù)脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元在脊髓損傷后免于死亡[25]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，BDNF表達(dá)在脊髓損傷后1～7 d逐漸持續(xù)增加，各時(shí)間點(diǎn)兩組均有顯著性差異(P＜0.05)，表明在急性脊髓損傷后早期，原花青素的應(yīng)用可以促進(jìn)BDNF表達(dá)，減輕神經(jīng)細(xì)胞病理變化，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，原花青素在脊髓損傷修復(fù)中既能在脊髓損傷后抑制GFAP的表達(dá)，又能明顯促進(jìn)損傷區(qū)BDNF的表達(dá)，從而減少受傷脊髓中神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的增生和膠質(zhì)瘢痕的形成，促進(jìn)軸突再生，促進(jìn)脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。本實(shí)驗(yàn)為原花青素在脊髓損傷修復(fù)中的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

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Effect of Proanthocyanidin on Expression of Glial Fibrillary Acidic Protein and Brain-derived Neurotrophic Factor in Ratsafter SpinalCord Injury

CHENChun-mei
Chongqing Three GorgesMedicalCollege,Chongqing 404120,China

Objective To observe the effect of proanthocyanidin on the expression of brain-derived neurotrophic factor(GFAP)and brain-derived neurotrophic factor(BDNF)in ratswith spinal cord injury(SCI).Methods 48 healthy adult Sprague-Daw ley ratswere random ly divided into proanthocyanidin treatmentgroup(group A,n=24)and controlgroup(group B,n=24).A llen'smethod was used to establish themodel of acute spinal cord injury in T9.1,3 and 7 days after operation,8 rats in each subgroup were assessed with Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)scale and Slanting Board Test,the serum malondialdehyde(MDA)and superoxide dismutase(SOD)were detected, and the expression of GFAPand BDNF of the spinal cord were detected with immunohistochem istry.Results The results of BBB scale and Slanting Board Testwere better in group A than in group B 3 and 7 days after SCI(P＜0.05).The levels of SOD and MDA were better in group A than in group B 1,3 and 7 days after SCI(P＜0.05).The expression of GFAPwas lower,and the expression of BDNFwas higher in group A than in group B all the time points after SCI(P＜0.01).Conclusion Proanthocyanidin can inhibit the lipid peroxidation and the expression of GFAPin spinal cord after SCI,stimulate the synthesisof endogenous BDNF,and improve themotor function in ratsafter SCI.

spinalcord injury;proanthocyanidin;glial fibrillary acidic protein;nerve grow th factor;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.08.003

R651.2

A

1006-9771(2015)08-0883-06

2015-06-03

2015-07-07)

重慶三峽醫(yī)藥高等專科學(xué)校，重慶市404120。作者簡(jiǎn)介：陳春梅(1976-)，女，漢族，四川岳池縣人，講師，主要從事中醫(yī)治療方面研究。