脂肪酸對釀酒酵母酒精耐性的影響

王 川，羅惠波，黃 丹

（四川理工學院生物工程學院，四川 自貢 643000）

脂肪酸對釀酒酵母酒精耐性的影響

王 川，羅惠波，黃 丹

（四川理工學院生物工程學院，四川 自貢 643000）

研究幾種不同脂肪酸對釀酒酵母在存活率、生長速率和發(fā)酵方面的酒精耐性的影響。結(jié)果表明：培養(yǎng)基中添加兩種不飽和脂肪酸（棕櫚油酸和油酸）能顯著增加酵母菌在酒精沖擊下的存活率，其中棕櫚油酸的效應更強。同時這些存活的酵母菌在含酒精培養(yǎng)基上的生長速率也比普通酵母菌更快，而兩種飽和脂肪酸（棕櫚酸和硬脂酸）在提高酵母菌存活率和生長速率方面幾乎無貢獻。同時在添加相同濃度不飽和脂肪酸的條件下，培養(yǎng)至穩(wěn)定期的酵母菌比對數(shù)期酵母菌具有更高的存活率和更好的生長速率。但在發(fā)酵方面，添加短鏈脂肪酸（棕櫚油酸和棕櫚酸）能夠使酵母菌發(fā)酵達到較高的酒精體積分數(shù)，這個結(jié)果與酵母菌生長耐酒精性的結(jié)果不一致，表明酵母菌生長和發(fā)酵的酒精耐性機制是不同的。

釀酒酵母；脂肪酸；耐酒精性；生長；發(fā)酵

利用發(fā)酵法生產(chǎn)酒精，獲得高酒精含量一直是生產(chǎn)所追求的目標，但是當酒精在培養(yǎng)基中累積到一定濃度時，會對酵母菌細胞產(chǎn)生有毒效應，從而影響發(fā)酵。酵母菌耐酒精的生化機理十分復雜，有多種基因控制著酵母菌耐酒精的特性[1]，而細胞中的許多組分也與酵母菌耐酒精能力有密切的關系，如麥角固醇、脂肪酸、質(zhì)膜ATP酶、沖擊蛋白和海藻糖[2-5]等，對這些影響因素的生化機理方面的研究目前還有許多未知之處。研究表明，細胞膜是酒精對酵母菌毒害作用的一個主要目標，酒精能使酵母菌細胞膜流動性改變，并導致膜完整性的下降[6]，而酵母菌細胞膜的流動性主要與體內(nèi)的脂肪酸密切相關[7]，已有報道表明調(diào)節(jié)脂肪酸的種類、含量和比例能提高酵母菌在酒精沖擊下的存活率[8-11]，在此基礎上，本實驗通過在培養(yǎng)基中加入酵母菌中存在的幾種主要脂肪酸，研究酵母菌在存活率、生長和發(fā)酵方面的酒精耐性，探討脂肪酸對酵母菌耐酒精能力的影響機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）SCLG091由釀酒生物技術(shù)及應用四川省重點實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基（g/L）：酵母提取物10、蛋白胨20、葡萄糖20；生長培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖30、蛋白胨3、酵母提取物10；發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖250、酵母抽提物3、蛋白胨3、(NH4)2SO41、KH2PO40.5、MgSO40.36、CaCl20.28。

1.1.3 試劑

棕櫚油酸、油酸、棕櫚酸、硬脂酸，均為國產(chǎn)分析純，并按文獻[10]方法溶解于培養(yǎng)基；0.1 g/100 mL堿性美藍染色液：0.1 g亞甲基藍，溶于100 mL蒸餾水。

1.2 方法

1.2.1 酒精耐受性實驗

將釀酒酵母接于YPD斜面培養(yǎng)基活化48 h，然后接種在含50 mL YPD液體培養(yǎng)基的250 mL燒瓶中，每個燒瓶中分別加入不同濃度（0.1、0.5、1.0、3.0、5.0、10.0 mmol/L）的幾種脂肪酸（棕櫚油酸、油酸、棕櫚酸、硬脂酸），以30 ℃、150 r/min培養(yǎng)，分別取培養(yǎng)至指數(shù)期和穩(wěn)定期的酵母菌細胞離心后以無菌水洗滌兩次，重懸于含有14%乙醇的YPD培養(yǎng)基中，以不加脂肪酸的酵母菌培養(yǎng)液作為對照，30 ℃、100 r/min培養(yǎng)2 h，從培養(yǎng)液中取樣，涂布YPD平板，于30 ℃培養(yǎng)72 h后以美藍染色法計數(shù)，計算實驗組酵母菌存活率與對照組酵母菌存活率之差并作圖。

1.2.2 酒精發(fā)酵實驗

選取經(jīng)14%酒精沖擊后生長良好的酵母菌轉(zhuǎn)移至生長培養(yǎng)基中，28 ℃、100 r/min培養(yǎng)24 h。然后以體積分數(shù)10%接種量將種子接入含4%酒精的200 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于30 ℃搖床中發(fā)酵72 h，每隔一定時間取樣，測定在560 nm波長處的OD值和發(fā)酵液的酒精體積分數(shù)，以不加脂肪酸的酵母菌為對照，繪制細胞生長曲線。酒精體積分數(shù)測定方法參照文獻[12]進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒酵母的酒精耐受性

將酵母菌在加入不同濃度的幾種脂肪酸的培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)至指數(shù)期和穩(wěn)定期后以14%酒精沖擊，結(jié)果如圖1所示，加入不飽和脂肪酸（棕櫚油酸和油酸）的指數(shù)期酵母菌能顯著提高酵母菌在酒精存在下的存活率，并且棕櫚油酸的效果優(yōu)于油酸。而加入飽和脂肪酸對酵母菌的耐酒精性提高有限（硬脂酸）或基本無影響（棕櫚酸）（圖1a）。酵母菌的耐酒精能力與不飽和脂肪酸的濃度成正相關，其中酵母菌在酒精沖擊下的存活率隨不飽和脂肪酸濃度的增加而增加，在濃度達到3 mmol/L時呈現(xiàn)飽和現(xiàn)象。

相比于指數(shù)期酵母菌，加入不飽和脂肪酸的穩(wěn)定期酵母菌能更好地提高酵母菌的存活率（圖1b），相同濃度下棕櫚油酸對酵母菌的酒精耐性效果優(yōu)于油酸，同時酵母菌酒精耐性隨兩種不飽和脂肪酸的濃度增加而增強，達到5 mmol/L時出現(xiàn)飽和現(xiàn)象，飽和濃度大于指數(shù)期酵母菌。穩(wěn)定期酵母菌的酒精耐性比指數(shù)期酵母菌強，表明在穩(wěn)定期的細胞的存活率可能還受別的因素影響，可能與穩(wěn)定期的細胞內(nèi)容物有關，例如熱休克蛋白的合成等[5]。

圖1 脂肪酸對指數(shù)期（a）和穩(wěn)定期（b）酵母菌酒精耐受性的影響Fig.1 Effect of fatty aids on ethanol tolerance of S. cerevisiae in exponential phase (a) and stationary phase (b)

2.2 酒精發(fā)酵實驗結(jié)果

按照1.2.1節(jié)實驗結(jié)果，選取分別接種自指數(shù)期和穩(wěn)定期（在含1 mmol/L脂肪酸培養(yǎng)基中培養(yǎng)的），經(jīng)酒精沖擊后生長良好的酵母菌在含4%酒精的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，測定其生長曲線和酒精體積分數(shù)，結(jié)果見圖2和圖3。

圖2 在含4%酒精發(fā)酵培養(yǎng)基中不同酵母菌的生長曲線Fig.2 The growth curves of different S. cerevisiae strains cultured in the presence of 4% alcohol

由圖2可知，培養(yǎng)基中的乙醇會使對照組酵母菌生長的延遲期增加（約16 h），表明乙醇對酵母菌的生長具有抑制作用，與對照組酵母菌相比，經(jīng)脂肪酸培養(yǎng)的酵母菌能不同程度地縮短酵母菌的延遲期，其中經(jīng)不飽和脂肪酸培養(yǎng)的酵母菌能將延遲期縮短至6 h（加棕櫚油酸）和7 h（加油酸），而經(jīng)飽和脂肪酸培養(yǎng)的酵母菌對延遲期的縮短并不明顯（棕櫚酸為14 h、硬脂酸為16 h）。這表明在含有乙醇的培養(yǎng)基中，經(jīng)不飽和脂肪酸培養(yǎng)的酵母菌比經(jīng)飽和脂肪酸培養(yǎng)的酵母菌生長得更好，這與前述耐酒精實驗的結(jié)果相一致。而對比接種自不同生長時期酵母菌的生長曲線，結(jié)果顯示接種自穩(wěn)定期的酵母菌比指數(shù)期酵母菌能更顯著地縮短酵母菌的延遲期（4～5 h），這表明接種自穩(wěn)定期的酵母菌在酒精存在條件下的生長能力強于指數(shù)期酵母菌，這個結(jié)果也與耐酒精實驗結(jié)果一致。

圖3 不同來源酵母菌的發(fā)酵能力Fig.3 The fermentation capacity of different S. cerevisiae strains

在發(fā)酵能力方面，由圖3可知，接種自指數(shù)期和穩(wěn)定期的以短鏈脂肪酸培養(yǎng)的酵母菌發(fā)酵后的酒精體積分數(shù)（棕櫚油酸為11.6%，棕櫚酸為11.2%）明顯比對照組的酒精體積分數(shù)（9.2%）更高，而且達到最大酒精體積分數(shù)時所需發(fā)酵時間更短，分別為33 h（棕櫚油酸）和48 h（棕櫚酸），顯示出較好的發(fā)酵酒精耐性。而以長鏈脂肪酸培養(yǎng)的酵母菌發(fā)酵酒精體積分數(shù)（油酸為9.3%，硬脂酸為9.4%）和發(fā)酵時間（油酸為56 h，硬脂酸為55 h）都接近于對照組酵母菌，沒有顯示出發(fā)酵的酒精耐性。這個結(jié)果與脂肪酸對酵母菌在存活率和生長速率方面的酒精耐性影響不一致，表明酵母菌生長和發(fā)酵過程的酒精耐性機制可能有所不同。

3 討 論

在評價酵母菌酒精耐受性中，主要有存活率、生長速率、發(fā)酵性能3 個指標，本研究選取了酵母菌中主要存在的幾種脂肪酸：棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸和油酸[8]，從以上3 個指標方面研究脂肪酸對酵母菌酒精耐性的影響。對脂肪酸在酵母菌酒精耐性中的影響，已有的研究多集中在乙醇脅迫時酵母菌的細胞脂質(zhì)構(gòu)成的改變，并報道了一些互不相同的結(jié)論[8-11,13-17]，多數(shù)報道認為在酒精存在下生長的酵母菌提高了細胞中單不飽和脂肪酸的含量和不飽和脂肪酸/飽和脂肪酸的比例[9,11,15-16]，但仍未建立一個完整的因果聯(lián)系。本研究發(fā)現(xiàn)在添加了兩種不飽和脂肪酸培養(yǎng)基中生長的酵母菌能夠顯著提高在酒精沖擊下的存活率，而飽和脂肪酸對提高存活率幾乎無貢獻，這個結(jié)論與多數(shù)報道中不飽和脂肪酸對酒精耐性的作用相一致，不同之處在于棕櫚油酸對酒精耐性的貢獻作用大于油酸。這些在乙醇沖擊下存活的酵母菌在隨后的生長實驗中也大致體現(xiàn)出了相同的趨勢，即用不飽和脂肪酸培養(yǎng)的酵母菌在含酒精培養(yǎng)基中生長得更好，延遲期更短、生長速率更快。但這些酵母菌在發(fā)酵過程中的酒精耐性則有所不同，其中以短鏈脂肪酸（棕櫚油酸和棕櫚酸）培養(yǎng)后存活的酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生了較高的酒精體積分數(shù)，體現(xiàn)出了相應的高酒精耐性，但以長鏈脂肪酸（硬脂酸和油酸）培養(yǎng)后存活的酵母菌并沒有發(fā)酵產(chǎn)生更高的酒精體積分數(shù)。這個結(jié)果與存活率和生長實驗的結(jié)果不一致。已有報道在生長時酒精耐性高的酵母菌株比耐性低的細胞內(nèi)含有更多的短鏈脂肪酸（C16、C16∶1）[17]，本研究從發(fā)酵耐酒精性方面證實了這一結(jié)論。

本研究也對在脂肪酸培養(yǎng)基中生長至不同時期的酵母菌進行了酒精耐性實驗，結(jié)果顯示在添加相同濃度不飽和脂肪酸的條件下，培養(yǎng)至穩(wěn)定期的酵母菌比對數(shù)期酵母菌具有更高的存活率和更好的生長速率，但在發(fā)酵實驗中同樣顯示出不一致的結(jié)果：短鏈脂肪酸對發(fā)酵酒精耐性影響更大。已有報道表明穩(wěn)定期酵母菌具有更好的抗脅迫能力，如溫度、氧化劑、滲透壓、乙醇[18]等，這與穩(wěn)定期表達的熱休克蛋白Hsp104[5]和MnSOD[19]有關，其中MnSOD在穩(wěn)定期酵母菌的酒精耐性中發(fā)揮重要的作用，本研究進一步表明穩(wěn)定期酵母菌在生長和發(fā)酵方面能顯示出更強的酒精耐受性。

酒精作為親脂溶劑，可溶解細胞膜中的脂質(zhì)，會降低細胞膜的完整性，導致細胞膜通透性增加，引起細胞內(nèi)物質(zhì)的泄漏[6]。酵母菌細胞在乙醇脅迫時可通過不飽和脂肪酸以及固醇含量的增加來引起細胞膜的整體流動性增加，從而增加了酵母菌的酒精耐性[1,9-10]。細胞膜的流動性與脂肪酸的不飽和度和分子大小有關，因此本研究中在短鏈不飽和脂肪酸（棕櫚油酸）中培養(yǎng)的酵母菌在存活率和生長速率方面展示了最強的酒精耐受性。酵母菌在酒精發(fā)酵過程中，由于缺氧和發(fā)酵溫度的升高，不飽和脂肪酸合成受到抑制，膜流動性下降時，飽和脂肪酸可以提高膜的流動性，增強細胞膜滲透屏障，來提高酵母菌的耐乙醇能力，這也是酵母菌的耐性機制之一[8]。這可以解釋本研究中在短鏈脂肪酸（C16）中培養(yǎng)的酵母菌在發(fā)酵過程中的酒精耐性更強，使得發(fā)酵后的酒精體積分數(shù)較高。不同脂肪酸對酵母菌生長和發(fā)酵的酒精耐受性的不同影響也表明在生長和發(fā)酵的不同條件下，酵母菌的耐酒精機制是不同的。對酵母菌耐酒精機制的了解還應結(jié)合基因工程和代謝工程，從分子水平加以闡釋，為酵母菌的高體積分數(shù)酒精發(fā)酵提供理論基礎。

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Effects of Fatty Acids on the Ethanol Tolerance of Saccharomyces cerevisiae

WANG Chuan, LUO Huibo, HUANG Dan
(College of Bioengineering, Sichuan University of Science and Engineering, Zigong 643000, China)

In the present study, the effects of several fatty acids on the ethanol tolerance of Saccharomyces cerevisiae were evaluated by cell survival rate, growth rate and fermentation ability. The results showed that the survival rate of S. ce revisiae under alcohol shock was signifi cantly increased by the addition of two unsaturated fatty acids (palmitoleic acid and oleic acid) in the culture medium, while p almitoleic acid was more effective than oleic acid. The surv ival yeasts also grew fas ter in the medium conta ining alcohol. The two saturated fatty acids palmitic acid and stearic acid made no contribution t o promoting the survival rate and growth rate of S. cerevisiae. On the other hand, w ith the same concentration of unsaturated fatty acids, yeasts cultured to the stationary phase displayed higher survival rate and faster growth rate compared with the exponential phase. However, yeasts cultured with short-chain fatty acids (palmitoleic acid a nd palmitic acid) achieved high alcohol content. The ethanol tolerance results during fermentation were inconsistent with the growth results. Thus the mechanism of ethanol tolerance of S. cerevisiae is different from that of cell growth during fermentation.

Saccharomyces cerevisiae; fatty acids; ethanol tolerance; growth; fermentation

TS201.3

A

1002-6630（2015）19-0190-04

10.7506/spkx1002-6630-20 1519034

2014-10-31

釀酒生物技術(shù)及應用四川省重點實驗室開放基金項目（NJ2009-11）

王川（1970-），男，副教授，博士，研究方向為微生物及生物產(chǎn)品分離。E-mail：watpc57944@163.com