短短芽孢桿菌幾丁質(zhì)酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)

蘇明慧，胡雪芹，顧東華，張洪斌，褚小龍

（合肥工業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，安徽 合肥 230009）

短短芽孢桿菌幾丁質(zhì)酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)

蘇明慧，胡雪芹*，顧東華，張洪斌，褚小龍

（合肥工業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，安徽 合肥 230009）

探討來源于短短芽孢桿菌FM4B的幾丁質(zhì)酶（chitinase）分離純化過程及其性質(zhì)。菌株FM4B搖瓶發(fā)酵液經(jīng)過離心、乙醇分級沉淀及葡聚糖凝膠G-100層析純化，用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳確定其分子質(zhì)量。結(jié)果獲得幾丁質(zhì)酶純品，酶的純化倍數(shù)為7.19，酶活回收率為30.6%，分子質(zhì)量為66 kD；酶活力在pH 5.0～9.0和80 ℃以下穩(wěn)定，最適pH值為6.0，最適溫度為50 ℃；Cu2+、Hg2+、Pb2+、Co2+以及Zn2+對該酶有強烈的抑制作用，Mg2+和Ca2+對該酶的活力具有一定的促進(jìn)作用；該幾丁質(zhì)酶對多種霉菌有顯著的抑菌效果。菌株FM4B分泌的幾丁質(zhì)酶穩(wěn)定性好，且對多種霉菌抑制效果明顯，具有較高的潛在利用價值。

短短芽孢桿菌；幾丁質(zhì)酶；純化；性質(zhì)；抑菌

幾丁質(zhì)（chitin）是由N-乙酰-D-氨基葡萄糖通過β-1,4糖苷鍵聚合而成的直鏈型大分子多糖，廣泛存在于自然界中，其含量僅次于纖維素，它還是地球上除蛋白質(zhì)外數(shù)量最大的天然含氮有機化合物[1-2]，降解幾丁質(zhì)獲得的多種生理活性的幾丁寡糖，已被應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)、環(huán)保和保健等領(lǐng)域[3-7]；大多數(shù)真菌和許多昆蟲含有幾丁質(zhì)，而高等動植物不含幾丁質(zhì)，幾丁質(zhì)還可以作為選擇性高的殺菌殺蟲劑作用靶點，但幾丁質(zhì)難以降解，酶法是目前降解幾丁質(zhì)最環(huán)保高效、最有前途的方法。自1905年Benecke首次發(fā)現(xiàn)能夠降解幾丁質(zhì)的貝內(nèi)克氏菌（Beneckea chitinovora）后[8],人們相繼發(fā)現(xiàn)許多細(xì)菌、放線菌、真菌都可以產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶，在病毒、植物、動物中也發(fā)現(xiàn)了幾丁質(zhì)酶[9]，其中芽孢桿菌是一類重要的幾丁質(zhì)酶制劑生產(chǎn)菌。幾丁質(zhì)酶（chitinase，EC3.3.1.14）[10]是一種專一性降解幾丁質(zhì)的酶類，可將幾丁質(zhì)完全水解為幾丁單糖或幾丁寡糖，應(yīng)用前景十分廣泛。

在前期的研究中，筆者分離得到一株高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的菌株，經(jīng)鑒定為短短芽孢桿菌[11]，本實驗對該菌產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶進(jìn)行分離純化以及酶學(xué)性質(zhì)研究，為其在食品和醫(yī)藥生產(chǎn)上的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

短短芽孢桿菌FM4B，由本實驗室篩選所得[12]。種子培養(yǎng)基：牛肉膏0.5 g、蛋白胨1.0 g、NaCl 0.5 g，蒸餾水100 mL，pH 7.2。發(fā)酵培養(yǎng)基[13]：葡萄糖6.1 g/L、蔗糖31.3 g/L、蛋白胨23.1 g/L、K2HPO40.825 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L。

1%膠體幾丁質(zhì)、1%殼聚糖、5×蛋白電泳緩沖液、2×Loading Buffer、考馬斯亮藍(lán)染色液/脫色液（醋酸-乙醇脫色液）、丙烯酰胺貯液（丙烯酰胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%，N,N-亞甲雙丙烯酰胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%）、濃縮膠緩沖液（1 mol/L Tris-HCl，pH 6.8）和分離膠緩沖液（1.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.8） 合肥工業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)工程實驗室配制；標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Marker SM0661 生工生物工程（上海）股份有限公司；無水乙醇為分析純、葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉為生化試劑 中國醫(yī)藥集團（上海）化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

HQ45B恒溫?fù)u床 中國科學(xué)院武漢科學(xué)儀器廠；LDZM立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；HC-3018R高速冷凍離心機 科大創(chuàng)新有限責(zé)任公司；HH-1恒溫水浴鍋 江蘇金壇晶玻實驗儀器廠；T6紫外分光光度計 新世紀(jì)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；W-1調(diào)節(jié)萬用電爐 南通市長江光學(xué)儀器有限公司；CA-920-2超凈工作臺 上海凈化設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 幾丁質(zhì)酶粗酶液的制備

將短短芽孢桿菌FM4B菌株，按照50 mL培養(yǎng)基6%的接種量，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)21 h制備種子液，種子液以5%的接種量接入50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)15 h，將發(fā)酵液在4 ℃、8 000 r/min的條件下離心15 min，收集上清液，即為粗酶液。

1.3.2 幾丁質(zhì)酶的純化

將粗酶液在4 ℃條件下分級醇沉，加入乙醇，使乙醇的終體積分?jǐn)?shù)達(dá)到45%，4 ℃冰箱靜置過夜，第2天取出，0.45 μm微孔濾膜過濾3 遍，去沉淀留上清，上清加入乙醇，使乙醇的終體積分?jǐn)?shù)達(dá)到65%，攪拌2 h，6 000 r/min離心10 min，沉淀用水溶解上葡聚糖G-100凝膠柱，以蒸餾水進(jìn)行洗脫，流速0.5 mL/min，洗脫4 個體積，檢測并收集有酶活性的餾分。

1.3.3 幾丁質(zhì)酶酶活力的測定

參考Dai Dehui等[14]的方法測定酶活力，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行相應(yīng)合理的修改：取1 mL處理后的發(fā)酵液與1 mL 1%的膠體幾丁質(zhì)-磷酸緩沖液于45 ℃水浴1 h，然后沸水浴煮沸40 min，終止反應(yīng)后，加入2 mL 3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS），煮沸10 min，定容到10 mL，離心，上清液于540 nm波長處測定OD值。酶促反應(yīng)的產(chǎn)物幾丁質(zhì)寡糖會和DNS發(fā)生氧化還原反應(yīng)，在煮沸情況下顯棕紅色，在波長540 nm波長處檢測酶活力[15]。在上述條件下，每分鐘催化生成1 μg氨基葡萄糖時所用酶量定義為1 個酶活力單位（U）。酶活回收率是純酶活力與總酶活力的相對百分比。

1.3.4 幾丁質(zhì)酶分子質(zhì)量的測定

用聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量。濃縮膠為6%，分離膠為12%，電泳后用考馬斯亮藍(lán)R-250染色。

1.3.5 最適pH值和酸堿穩(wěn)定性的分析

在50 ℃條件下測定幾丁質(zhì)純酶在pH 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0時的酶活性，確定幾丁質(zhì)酶的最適pH值。將酶液用0.2 mol/L的不同pH值（2.0～12.0）的緩沖溶液（醋酸-醋酸鈉緩沖液pH 2.0～6.0，磷酸鹽緩沖液pH 7.0～8.0，甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液pH 9.0～12.0）進(jìn)行適當(dāng)稀釋，30 ℃處理1 h后，在50 ℃、pH 6.0條件下測定剩余酶活力，考察酶的酸堿穩(wěn)定性。

1.3.6 最適溫度和熱穩(wěn)定性的分析

在pH 6.0條件下測定20～100 ℃的酶活力，確定酶的最適溫度。將適當(dāng)稀釋的酶液在不同溫度（20、30、40、50、60、70、80、90、100 ℃）條件下分別處理30 min和1 h后，在50 ℃、pH 6.0條件下測定剩余酶活力，考察酶的熱穩(wěn)定性。

1.3.7 部分金屬離子對幾丁質(zhì)酶酶活性的影響

在反應(yīng)體系中分別加入濃度均為1.0 mmol/L的金屬離子（Co2+、Ca2+、Zn2+、Mg2+、Pb2+、Cu2+、Hg2+）測定酶活力，以未加入金屬離子的酶液做對照，觀察金屬離子對酶活力的影響。

1.3.8 幾丁質(zhì)酶抗霉菌能力檢測

采用杯碟法，指示菌為霉菌（西瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌、黃瓜枯萎病菌、棘孢青霉及哈茨木霉、根霉和灰霉）。300 μL指示菌孢子懸液（105CFU/mL）與20 mL PDA培養(yǎng)基混合搖勻后制作混菌平板，在混菌平板上放置牛津杯并加入100 μL質(zhì)量濃度為200 μg/mL幾丁質(zhì)酶粗酶液，30 ℃培養(yǎng)，根據(jù)抑菌圈大小考察幾丁質(zhì)酶的抑菌能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 幾丁質(zhì)酶的分離純化

取2 L發(fā)酵液高速冷凍離心濃縮，取45%～65%醇沉物復(fù)溶后為3 mL，上Sephadex G-100的層析柱（1 cm×70 cm），洗脫曲線見圖1，蛋白質(zhì)含量和酶活性最高的部分均為5～13 管。純化前后電泳圖譜見圖2，純化后得到單一蛋白條帶，由標(biāo)準(zhǔn)蛋白可知該酶分子質(zhì)量約為66 kD。酶比活力由60.7 U/mg提高到436.8 U/mg，純化7.19 倍，酶活回收率30.6%（表1）。

圖1 幾丁質(zhì)酶的Sephadex G-100餾分色譜圖Fig.1 Sephadex G-100 gel-fi ltration chromatography of chitinase

圖2 幾丁質(zhì)酶的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of chitinase

表1 幾丁質(zhì)酶的純化結(jié)果Table 1 Purifi cation of chitinase from Brevibacillus breevviiss

2.2 pH值和溫度對幾丁質(zhì)酶酶活力的影響

圖3 幾丁質(zhì)酶的最適pH值（A）和pH值穩(wěn)定性（B）Fig.3 Optimal pH (A) and pH stability (B) of chitinase

pH值對幾丁質(zhì)酶酶活性的影響結(jié)果（圖3）表明，該酶在pH 6.0時活性最大；在pH 5.0～9.0之間較穩(wěn)定，催化活力無明顯變化，而幾丁質(zhì)酶在pH 4.0以下或pH 10.0以上，其穩(wěn)定性迅速下降。溫度對幾丁質(zhì)酶酶活性的影響結(jié)果（圖4）表明，該酶的最適溫度為50 ℃，在70 ℃以下，酶活力損失不明顯；在80 ℃條件下保溫1 h相對酶活力殘留50%，保溫0.5 h酶活力僅損失20%，高于80 ℃后酶穩(wěn)定性降低。

圖4 幾丁質(zhì)酶的最適溫度（A）和熱穩(wěn)定性（B）Fig.4 Optimal temperature (A) and thermostability (B) of chitinase

2.3 不同金屬離子對幾丁質(zhì)酶酶活力的影響

圖5 不同金屬離子對幾丁質(zhì)酶酶活力的影響Fig.5 Effects of different metal ions on the activity of chitinase

由圖5可知，Mg2+、Ca2+對短短芽孢桿菌FM4B分泌的幾丁質(zhì)酶酶活力有一定的促進(jìn)作用。而Cu2+、Zn2+、Co2+、Pb2+和Hg2+對其有較強的抑制作用，1.0 mmol/L的Cu2+、Zn2+、Co2+、Pb2+和Hg2+均使其相對酶活力降到40%以下。

2.4 幾丁質(zhì)酶抗霉菌檢測結(jié)果

從短短芽孢桿菌FM4B發(fā)酵液分離的幾丁質(zhì)酶對不同指示菌（西瓜枯萎病菌、黃瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌、棘孢青霉、哈茨木霉、根霉和灰霉）有明顯的抑菌作用（表2），且隨著酶液質(zhì)量濃度的增加，抑菌效果增大（以西瓜枯萎病菌為例，圖6）。該幾丁質(zhì)酶對作物的枯萎病病原菌以及引起果蔬采后貯藏腐爛的病原真菌抑制作用明顯，在生物殺菌和果蔬采后貯藏病害的生物防治中具有應(yīng)用開發(fā)前景[16-18]。

表2 幾丁質(zhì)酶對不同拮抗真菌的抑菌效果Table 2 Inhibitory effect of chitinase on different antagonistic fungi

圖6 不同質(zhì)量濃度的幾丁質(zhì)酶對西瓜枯萎病菌的抑菌效果Fig.6 Inhibitory effect of chitinase on fusarium wilt of watermelon

3 討 論

本實驗從短短芽孢桿菌FM4B發(fā)酵上清液中得到幾丁質(zhì)酶，分級醇沉后只經(jīng)過一步葡聚糖凝膠層析就可以達(dá)到電泳純，純化活力收率較高。文獻(xiàn)[19-21]報道中微生物來源的幾丁質(zhì)酶分子質(zhì)量差異很大，一般來說，放線菌幾丁質(zhì)酶分子質(zhì)量大多在30 kD左右、細(xì)菌幾丁質(zhì)酶多為60～110 kD、真菌所產(chǎn)酶分子質(zhì)量變化較大。本實驗純化得到的酶分子質(zhì)量為66 kD，與報道相符。

本實驗得到的幾丁質(zhì)酶純品的最適pH值為6.0，在pH 5.0～9.0之間都可以穩(wěn)定存在，由此可見該酶的pH值穩(wěn)定范圍較寬，酸堿耐受性很強，適于工業(yè)生產(chǎn)。該酶的最適溫度為50 ℃，在80 ℃保溫30 min仍有80%的相對酶活力，保溫1 h相對酶活力仍有50%。可見該酶的熱穩(wěn)定性良好，在工業(yè)中可以適用不同的滅菌條件，溫度高可防止雜菌的生長，因此該幾丁質(zhì)酶有很高的應(yīng)用價值。

Cu2+、Zn2+、Co2+、Pb2+和Hg2+對該酶有較強的抑制作用，Mg2+、Ca2+對該酶酶活力有一定的促進(jìn)作用，由此可見在催化水解幾丁質(zhì)時可以添加Mg2+、Ca2+來提高酶活力。在抗菌方面，雖然在理論上幾丁質(zhì)酶可作用于任意一類細(xì)胞壁含幾丁質(zhì)成分的真菌，但研究發(fā)現(xiàn)，不同來源的幾丁質(zhì)酶對不同真菌的抑制能力不同，幾丁質(zhì)酶抑菌作用具有選擇性。如真菌來源的幾丁質(zhì)酶一般不能抑制真菌的生長[19,22-23]，不同細(xì)菌來源的幾丁質(zhì)酶抑菌譜也有較大的區(qū)別，這種選擇機制目前尚不清楚，推測可能與幾丁質(zhì)酶類型、真菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、幾丁質(zhì)所占比例、幾丁質(zhì)暴露差異，或真菌體內(nèi)調(diào)節(jié)因子等特性有關(guān)。本實驗涉及的幾丁質(zhì)酶對多種霉菌有較強抑制效果，對作物的枯萎病病原菌以及引起果蔬采后貯藏腐爛的主要病原菌根霉菌和灰霉菌的抑制效果顯著。綜上所述，短短芽孢桿菌分泌的幾丁質(zhì)酶在作物枯萎病以及果蔬采后貯藏病害的生物防治中具有很大的應(yīng)用開發(fā)前景，為開發(fā)生物殺菌及新型果蔬采后貯藏病害的生物防治途徑提供參考，有進(jìn)一步研究的價值。

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Purification and Characterization of Chitinase from the Fermentation Broth of Brevibacillus brevis FM4B

SU Minghui, HU Xueqin*, GU Donghua, ZHANG Hongbin, CHU Xiaolong
(School of Medical Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

In the present study, the purification and characterization of a chitinase from the fermentation broth of Brevibacillus brevis FM4B was investigated by centrifugation, ethanol precipitation and Sephadex G-100 chromatography. Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) was used to determine its molecular weight. Purifi ed chitinase with a purifi cation factor of 7.19 and a recovery rate of 30.6% was obtained. The molecular weight of the purifi ed chitinase was approximately 66 kD. It had an optimum reaction temperature and pH of 50 ℃ and 6.0, respectively. The enzyme also showed good stability in the pH range of 5.0-9.0. Its activity could be inhibited by Cu2+, Hg2+, Pb2+, Co2+and Zn2+, but slightly activated by Mg2+and Ca2+. In addition, the chitinase had obvious inhibitory effect on different fungi. The chitinase, possessing high thermal stability, good pH adaptability and signifi cant antifungal effect, has great potential for practical applications.

Brevibacillus brevis; chitinase; purification; characterization; antibacterial activity

Q814

A

1002-6630（2015）19-0176-04

10.7506/spkx1002-6630-201519031

2014-10-31

安徽省自主創(chuàng)新專項（合肥工業(yè)大學(xué)2013秋實計劃）（2013AKKG0391）；省級大學(xué)生創(chuàng)新項目（2015cxcys094）

蘇明慧（1989-），女，碩士研究生，研究方向為生物制藥與酶工程。E-mail：790283130@qq.com

*通信作者：胡雪芹（1976-），女，副教授，碩士，研究方向為生物制藥與酶工程。E-mail：85365206@qq.com