傳統(tǒng)發(fā)酵香腸中菌種的分子生物學(xué)鑒定

李丙超 胡衛(wèi)東 唐文才 李興玲

鐘 強(qiáng) 李再新 張 智

（四川理工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，四川 自貢 643000）

發(fā)酵香腸亦稱生香腸，是利用自然界有益微生物發(fā)酵生產(chǎn)和保存的一種肉食制品。發(fā)酵香腸的制作是將切成小塊豬、牛和羊等瘦肉和部分肥肉與鹽、糖和香辛料等混合，灌入腸衣，經(jīng)微生物發(fā)酵、風(fēng)干而制成具有特殊發(fā)酵香味的肉制品［1，2］，或者采用人工添加微生物發(fā)酵劑進(jìn)行制品發(fā)酵，調(diào)節(jié)微生物發(fā)酵群落變化，形成特殊風(fēng)味。人工添加微生物制劑可以縮短發(fā)酵時(shí)間，改善香腸的色澤和風(fēng)味，抑制有害雜菌生長(zhǎng)［3］，并延長(zhǎng)香腸的保存期［4］。

中國(guó)發(fā)酵香腸歷史悠久，類型眾多，主要分為川味香腸和廣味香腸。其主要區(qū)別為廣味甜，川味辣。在發(fā)酵過程中，適合在香腸中生長(zhǎng)的微生物種類較多，但有益于香腸發(fā)酵形成特殊風(fēng)味口感的微生物并不是很多［5］。為篩選和鑒定香腸發(fā)酵的有益微生物，克服傳統(tǒng)微生物物種鑒定的不足，本研究擬通過從傳統(tǒng)優(yōu)良發(fā)酵香腸中分離、篩選菌株，其后通過真菌ITS以及細(xì)菌16SrDNA分子鑒定，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［6］，確定其屬種，以期將獲得的優(yōu)良肉制品菌種發(fā)酵劑應(yīng)用于發(fā)酵肉和發(fā)酵香腸的生產(chǎn)中，進(jìn)一步提高發(fā)酵肉制品品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株

菌株：從四川簡(jiǎn)陽(yáng)某肉制品市場(chǎng)的傳統(tǒng)羊肉香腸中采集。

1.1.2 試劑

蛋白胨、牛肉膏、酵母浸膏、瓊脂：分析純，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；

蛋白酶K：30U/mg，德國(guó) Merck公司；

SDS：分析純，德國(guó)Sigma公司；

PCR所用試劑：Taq酶2.5U/μL、dNTPs 2.5mmol/L、10×PCR buffer等，大連寶生物工程有限公司。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備

電子分析天平：SA5103N型，梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司；

生化培養(yǎng)箱：SHP-100型，金壇市晶玻實(shí)驗(yàn)儀器廠；

凝膠成像儀：TS2-310型，美國(guó)UVP LLC公司；

Eppendorf PCR儀：Mastrcycler nexus gradient型，美國(guó)Eppendorf公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種的分離 無菌條件下取25g香腸于225mL無菌生理鹽水中，充分振蕩，即為10－1樣品稀釋液，用生理鹽水按10倍稀釋比稀釋至10－6。分別取10－4，10－5，10－6樣品稀釋液涂布于MRS（蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸膏5g，K2HPO42g，檸檬酸二銨2g，乙酸鈉5g，葡萄糖20g，吐溫80mL，MgSO4·7H2O 0.5g，MnSO40.25g，蒸餾水1 000 mL，pH值6.2～6.4，121℃滅菌20min）固體平板，33℃培養(yǎng)48h。根據(jù)培養(yǎng)皿上菌落的顏色、表面光滑度、干濕度以及邊緣形態(tài)將菌落進(jìn)行初篩。采用反復(fù)劃線分離單菌落的方法，將初篩的菌株進(jìn)一步分離，選擇沒有蔓延且單獨(dú)的菌落，并鏡檢分析。

1.2.2 生化試驗(yàn)檢測(cè) 將分離培養(yǎng)的疑似酵母菌接種于YPD、TTC顯色平板，30℃培養(yǎng)24h，觀察顯色結(jié)果。將分離的疑似葡萄球菌和疑似乳酸菌分別接種到滅菌脫脂牛奶（含石蕊25g/L），37℃培養(yǎng)24～36h，另將此兩種菌進(jìn)行過氧化氫觸酶試驗(yàn)即將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌挑取到潔凈玻片上，并立即滴加新鮮的3%過氧化氫，立即觀察有無氣泡。

1.2.3 菌株基因組DNA提取 取2.0mL發(fā)酵液于離心管中，12 000×g離心1min，棄上清，收集菌體。采用SDS—酶法［7－10］，其步驟如下：2mL過夜發(fā)酵液于12 000×g離心1min，收集菌體，再加入500μL Tris緩沖液（pH 8.0）和300 μL 10%SDS充分混勻后65℃水浴1h，立即置于－80℃放置15min再65℃水浴15min，如此反復(fù)凍融3次，再4℃6 000×g離心10min，取上清加入等體積的酚—氯仿—異戊醇（25∶24∶1，V∶V∶V），漩渦震蕩5min，室溫靜置10min后1 3000×g離心20min，取上清加入0.6倍體積異戊醇，室溫沉淀1.5h，13 000×g離心20min，去上清，用1mL 70%乙醇洗沉淀一次，室溫?fù)]發(fā)10min，加入50μL滅菌水并于65℃水浴1h后－20℃保存，作為PCR模板。

1.2.4 菌株16SrDNA和ITS序列分析 以30ng提取的基因組DNA為模板，采用Taq酶和引物（細(xì)菌16SrDNA引物：1492R：5’-GTA TTA CCG CGG CTG CTG G-3’，8F：5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’；真菌ITS引物序列：ITS1：5′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3′，ITS4：5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′）對(duì)細(xì)菌16SrDNA和真菌ITS進(jìn)行PCR擴(kuò)增。細(xì)菌的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：滅菌水33μL；10×PCR buffer 5μL；dNTPs（2.5mmol/L）4 μL；MgCl2（25mmol/L）3μL；1492R（20mmol/L）1μL；8F（20mmol/L）1μL；Taq酶（2.5U/μL）1.5μL；模板（10 ng/μL）3μL；真菌的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：滅菌水30.5μL；10×PCR buffer 5μL；dNTPs（2.5mmol/L）4μL；MgCl2（25mmol/L）3μL；ITS1（20mmol/L）2μL；ITS4（20 mmol/L）2μL；Taq酶（2.5U/μL）1.5μL；模板（10ng/μL）3μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性50s，94℃變性30 s，55℃退火25s，72℃延伸1min，共25個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min，4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)?；厥贞?yáng)性PCR產(chǎn)物，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果輸入GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，與數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的16SrDNA和ITS序列比對(duì)，得到與分離菌序列相似的菌種16SrDNA和ITS基因序列，用MegAlign軟件得到系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的分離結(jié)果

經(jīng)過MRS培養(yǎng)基分離與鏡檢，得到3種優(yōu)勢(shì)菌，它們的主要形態(tài)特征為：A菌菌落較大且表面干燥，突起，邊緣圓滑較濕潤(rùn)，呈乳白色，不透明，鏡檢顯示菌體個(gè)體形態(tài)較大，呈卵球形；B菌菌落較小，表面扁平且較濕潤(rùn)，邊緣光滑，呈淡乳白色，不透明，革蘭氏染色鏡檢顯示個(gè)體形態(tài)呈鏈狀或者線狀，部分呈“X”形、“Y”形的革蘭氏染色陽(yáng)性菌；C菌菌落較小，表面扁平、平滑、較干燥，呈黃色，不透明，革蘭氏染色鏡檢顯示為陽(yáng)性菌，且個(gè)體形態(tài)較小，呈典型的球狀，無鏈接狀。初步將此3種菌分為：A疑似酵母菌、B疑似乳酸菌、C疑似葡萄球菌。

2.2 生化分析

將疑似酵母菌直接點(diǎn)樣接種于YPD平板上培養(yǎng)24h后，再在上層倒入TTC培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)平板上顯示紅色菌落（圖1A），初步判定為酵母菌。石蕊牛奶試驗(yàn)結(jié)果顯示疑似葡萄球菌和疑似乳酸菌都能使石蕊牛奶變紅（圖1B和1C），過氧化氫觸酶試驗(yàn)顯示疑似乳酸菌不產(chǎn)生氣泡為陰性，疑似葡萄球菌產(chǎn)生大量氣泡為陽(yáng)性。

圖1 疑似菌生化結(jié)果Figure 1 The result of biochemical experiment

2.3 PCR擴(kuò)增16S和ITS序列結(jié)果

以分離菌基因組DNA為模板，利用16SrDNA和ITS引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別得到了約630bp（a泳道）、1 410bp（b泳道）和1 480bp（c泳道）的目的條帶（見圖2），結(jié)果與預(yù)期相符。

圖2 細(xì)菌16SrDNA和真菌ITS序列PCR擴(kuò)增Figure 2 Electrophoresis of PCR products

2.4 測(cè)序及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

2.4.1 酵母菌ITS序列分析結(jié)果 PCR擴(kuò)增酵母菌ITS序列，測(cè)序分析結(jié)果表明該序列大小為636bp，將該基因與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。BLAST比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)該序列與德巴利酵母 ATCCMYA-4749（HQ999977.1）的ITS序列相似度達(dá)到99%，利用MegAlign軟件構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖3），結(jié)果表明二者處在同一分支上，進(jìn)化距離近，最終判斷該酵母菌為德氏酵母。

圖3 系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 3 System growth trees

2.4.2 葡萄球菌16SrDNA結(jié)果 測(cè)序結(jié)果表明PCR擴(kuò)增的16SrDNA序列大小為1 411bp，將該序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。BLAST比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)該序列與腐生葡萄球菌YSY1-6株（GU197535.1）的16SrDNA 序列相似度 達(dá)到100%，利用MegAlign軟件構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖4）表明二者處在同一分支上，進(jìn)化距離近，最終判斷為YSY1-6腐生葡萄球菌。

2.4.3 乳酸菌16SrDNA結(jié)果 測(cè)序結(jié)果表明PCR擴(kuò)增的16SrDNA序列大小為1 489bp，將該序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。BLAST比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)該序列與德式乳桿菌NBRC3376株（AB680073.1）的16SrDNA序列相似度達(dá)到99%，利用MegAlign軟件構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖5）表明二者處在同一分支上，進(jìn)化距離近，最終判斷為德式乳桿菌。

圖4 系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 4 System growth trees

圖5 系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 5 System growth trees

3 結(jié)論

發(fā)酵香腸是中國(guó)人喜愛的食品，不同工藝和調(diào)味料配方，產(chǎn)生不同的風(fēng)味、香型。其制作過程中的微生物種類及數(shù)量變化對(duì)香腸品質(zhì)十分重要［11］。傳統(tǒng)微生物技術(shù)鑒定香腸中細(xì)菌和霉菌的方法主要是依據(jù)它們的形態(tài)特征和生理特征，但往往只能鑒定到屬水平，不能反映與其它物種之間的親緣關(guān)系，而且耗時(shí)、工作量大，不利于工業(yè)化生產(chǎn)的在線檢測(cè)［12］。隨著分子生物學(xué)、基因工程的發(fā)展，越來越多的技術(shù)被應(yīng)用于菌種的鑒定，在大大減少工作量的同時(shí)顯著提高了鑒定的準(zhǔn)確性。本研究利用微生物rRNA序列的保守性，從傳統(tǒng)羊肉香腸中分離酵母和細(xì)菌，以細(xì)菌16SrDNA和酵母ITS為指標(biāo)來鑒定香腸中的微生物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)香腸中德氏酵母、YSY1-6腐生葡萄球菌、德式乳酸乳桿菌亞種較豐富。目前工業(yè)上用于發(fā)酵香腸的發(fā)酵劑主要由乳酸菌、片球菌等混合而成［13］，本研究結(jié)論也證明了發(fā)酵香腸中的微生物主要組成。根據(jù)王永霞［14］的介紹這些細(xì)菌降低了香腸的pH且還原了亞硝酸鹽，對(duì)發(fā)酵香腸的質(zhì)地有明顯影響。傳統(tǒng)的自然發(fā)酵香腸風(fēng)味往往是乳酸菌、酵母等優(yōu)勢(shì)菌與其它雜菌競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果，受季節(jié)、地區(qū)等外界環(huán)境的影響不易大規(guī)模生產(chǎn)。通過生理生化與基因鑒定方法，可以得到自然發(fā)酵香腸中的優(yōu)勢(shì)菌，為模擬自然發(fā)酵的風(fēng)味提供了基礎(chǔ)。

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