芹菜素對甲狀腺癌BCPAP細(xì)胞生長及細(xì)胞周期的影響

孫 震 鄭 婕 張 莉 趙俊杰 俞惠新

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所衛(wèi)生部核醫(yī)學(xué)重點實驗室，江蘇 無錫 214063；3.總后勤部軍需物資油料部軍需軍事代表局，北京 100071）

甲狀腺癌通常被認(rèn)為是惡性程度較低的癌癥，但近年來其發(fā)病率逐年走高［1］，特別是乳頭狀細(xì)胞癌（PTC）。2006年，美國癌癥學(xué)會聲明甲狀腺癌已經(jīng)成為第六大女性最常被診斷出的癌癥，而且其名次還在逐漸上升，雖然這與近年來的關(guān)注度增加有關(guān)，但也說明甲狀腺癌這個一度被人們所輕視的癌癥，其發(fā)生的普遍性是不容忽視的。雖然大多數(shù)的甲狀腺癌是良性的，但仍有5%～20%的甲狀腺癌是惡性的。甲狀腺癌的高發(fā)情況也在1985年芬蘭的連續(xù)常規(guī)尸檢結(jié)果［2］中得到了印證：1/3的死于非甲狀腺相關(guān)情形的逝者被檢查出患有甲狀腺癌，這種生前未被發(fā)現(xiàn)的甲狀腺癌病情并沒有直接導(dǎo)致他們的死亡，也說明低風(fēng)險的甲狀腺癌的發(fā)生率遠(yuǎn)比人們想象的要普遍得多。Londero等［3］對1996～2008年丹麥的乳頭狀甲狀腺癌（PTC）發(fā)病率的調(diào)查中，也發(fā)現(xiàn)發(fā)病率的不斷走高。在甲狀腺癌中，乳頭狀甲狀腺癌（papillary thyroid carcinomas，PTC）是最常見的類型［4］，占比60%～80%；濾泡狀甲狀腺癌（follicular thyroid carcinomas，F(xiàn)TC）占比15%～25%；未分化甲狀腺癌（anaplastic thyroid carcinomas，ATC）和髓樣甲狀腺癌（medullary thyroid cancers，MTC）共占比2%～5%。其中，PTC病人20年內(nèi)的存活率高達(dá)99%，因此PTC通常被認(rèn)為是一種低風(fēng)險癌癥［5］。

針對PTC常見的治療方法通常是手術(shù)結(jié)合放射碘治療［6］和（或）甲狀腺激素抑制治療，但是這些方法存在易產(chǎn)生并發(fā)癥和抗性的問題。因此低毒性藥物輔助化療及攝碘被認(rèn)為是有潛力的解決手段之一。目前，芹菜素被認(rèn)為是極有潛力的一種低毒性藥物［7］，并因來源廣、價格低等特點而備受關(guān)注。

芹菜素具有C6—C3—C6的類黃酮物質(zhì)典型結(jié)構(gòu)（見圖1），廣泛存在于常見的水果（如柑橘類、蘋果、櫻桃、葡萄等）、蔬菜（如洋蔥、荷蘭芹、綠花椰菜、甜椒、旱芹、大麥、番茄等）和飲品（茶、紅酒）中［8，9］。芹菜素是以水果和蔬菜為主的膳食模式（如地中海飲食）的主要有效成分之一，這些有效成分被認(rèn)為與此膳食模式群體中高血壓、心血管疾病、肥胖、糖尿病及癌癥的低發(fā)生率相關(guān)，其他黃酮類物質(zhì)也有類似的研究結(jié)論［10］。除了抗 腫 瘤 作 用［11］外，芹 菜 素 還 具 有 抗 氧 化［12］、抗炎癥、抗菌、抗誘變及抗病毒等功效，因其低毒性而被格外關(guān)注。體外研究［13］表明，芹菜素可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，影響細(xì)胞周期分布。但目前尚無關(guān)于芹菜素對乳頭狀甲狀腺癌BCPAP細(xì)胞的研究。

圖1 芹菜素的化學(xué)結(jié)構(gòu)Figure 1 The chemical structure of apigenin

本研究擬從芹菜素對乳頭狀甲狀腺癌BCPAP細(xì)胞系的細(xì)胞毒性、生長抑制作用及其對細(xì)胞周期和凋亡的影響進(jìn)行研究，并初步探討其抗腫瘤作用機制。

1 材料和方法

1.1 試劑與藥品

芹菜素：純度≥97%，美國Sigma公司。芹菜素溶解于適量的二甲亞砜（DMSO），終濃度為100mmol/L，過濾除菌，－2℃冰箱密封避光保存；

二甲亞砜（DMSO）：美國Sigma公司；

MTT（四氮唑噻唑蘭，四甲基偶氮唑鹽）、TUNEL試劑盒：碧云天公司；

BSA：上海生物工程公司；

RPMI 1640培養(yǎng)基：美國Gibco公司；

新生小牛血清（FBS）：杭州四季青生物工程材料有限公司。

1.2 儀器與器材

細(xì)胞培養(yǎng)板：6/96孔，美國Corning公司；

酶標(biāo)儀：μQuant型，美國Bio-Tek公司；

蛋白電泳儀：POWERPAC3000型，美國BIO-RAD公司；

倒置相差顯微鏡：TH4-200型，日本Olympus公司；

細(xì)胞培養(yǎng)箱：HEPA Class100型，美國Thermo公司；

雙人單面凈化工作臺：SW-CT-2FD型，蘇州凈化設(shè)備有限公司；

高速冷凍離心機：Centrifuge 5415R型，德國Eppendorf公司；

流式細(xì)胞儀：FACSCanto型，美國BD公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 細(xì)胞株與細(xì)胞培養(yǎng) 人甲狀腺癌細(xì)胞株BCPAP由江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所提供。BCPAP細(xì)胞接種于含10%（V/V）FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱溫度為37℃，CO2含量5%，飽和濕度下培養(yǎng)，BCPAP細(xì)胞為圓形，呈貼壁生長，孵育1～2d后用0.25%胰蛋白酶消化液消化傳代，選對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行試驗。

1.3.2 MTT法檢測芹菜素對BCPAP細(xì)胞增殖的抑制作用

取對數(shù)生長期的BCPAP細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液后進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，在96孔板的每孔種入7 500個BCPAP細(xì)胞后，溶劑對照組培養(yǎng)于等體積的100 μmol/L DMSO完全培養(yǎng)基溶液中；給藥組分別在不同濃度的芹菜素完全培養(yǎng)基中孵育24h，其濃度依次為12.5，25.0，50.0，100.0μmol/L，每個濃度設(shè)6個復(fù)孔。24h作用結(jié)束后，加入40μL濃度為2mg/mL的MTT，在37℃下作用4 h顯色，去除上清液后每孔加100μL的DMSO，微量振蕩器震蕩5min，使結(jié)晶完全溶解，通過酶標(biāo)儀在550nm波長下檢測得吸光值數(shù)據(jù)，試驗重復(fù)3次。另外，細(xì)胞中加入相同濃度（50μmol/L）芹菜素，分別培養(yǎng)24，48，72h后，按照上述方法測得芹菜素對BCPAP細(xì)胞作用不同時間下的吸光值。按式（1）計算細(xì)胞增殖抑制率，擬合后求IC50值。

1.3.3 PI單染法檢測芹菜素對BCPAP細(xì)胞周期的影響

取對數(shù)生長期的BCPAP細(xì)胞，以3×105mL－1的密度接種于6孔板中，細(xì)胞貼壁后棄去完全培養(yǎng)基，用PBS輕輕地蕩洗1次，換為無血清的RPMI 1640培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h。藥物作用組芹菜素的給藥濃度分別為12.5，25.0，50.0μg/mL，溶劑對照組給予等體積的50μg/mL二甲亞砜（DMSO）。培養(yǎng)24h后，胰蛋白酶消化，1 000r/min離心5 min，用70%的預(yù)冷乙醇使細(xì)胞懸浮固定，置4℃存放15 min，再次離心收集細(xì)胞，加入500μL含50μg/mL溴化乙錠（PI）、50μg/mL RNase A、0.1%Triton X-100的 PBS，常溫避光孵育15min；直接用流式細(xì)胞儀以標(biāo)準(zhǔn)程序檢測分析，每組試驗重復(fù)3次，結(jié)果用ModFit軟件分析。

1.3.4 Western blot法檢測芹菜素對BCPAP細(xì)胞周期Cdc25蛋白表達(dá)的影響 取對數(shù)期的BCPAP細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化，重懸后接種到6孔板中，3×105個/孔，37℃培養(yǎng)過夜。不同濃度芹菜素（12.5，25.0，50.0μmol/L）刺激，同時設(shè)置50μmol/L的DMSO溶劑對照組。24h后，收集細(xì)胞，8 000 r/min離心4min，棄上清，加入適宜體積的細(xì)胞裂解緩沖液［150mmol/L NaCl，1%NP-40，0.02%NaN3，10μg/mL PMSF，50mmol/L Tris—HCl（pH 8.0）］，同時加蛋白酶和磷脂酶抑制劑各0.5mL/tube，吹散均勻，置于－70℃冰箱反復(fù)凍融3次，12 000r/min離心5min，取上清。BCA法測定蛋白濃度。將定量好的蛋白液按適宜濃度分裝入PCR管，按1︰5（V︰V）加入6×上樣緩沖液，沸水煮5min。將準(zhǔn)備好的樣品按預(yù)期順序加入到膠板孔道中，經(jīng)10%SDS—PAGE凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)膜，硝酸纖維素膜室溫下置于含5%脫脂牛奶的TBST緩沖液中封閉1h，孵育適宜濃度的指定抗體，4℃搖床過夜，次日用TBST緩沖液清洗3次，每次5min，再在室溫下孵育HRP標(biāo)記的指定二抗1h，Ecl法化學(xué)發(fā)光后在成像儀中拍照記錄結(jié)果，并對條帶的灰度值進(jìn)行比較分析。

1.3.5 統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均來自于3次以上獨立試驗結(jié)果的平均值，計量數(shù)據(jù)以Mean±SEM表示。使用Student’t-test比較兩組間差異，＊P＜0.05代表差異具有顯著性，＊＊P＜0.01代表差異具有高度顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 芹菜素對BCPAP細(xì)胞生長的影響

2.1.1 芹菜素濃度對BCPAP細(xì)胞生長的影響 BCPAP細(xì)胞經(jīng)12.5，25.0，50.0，100.0μmol/L的芹菜素作用24h后，用MTT法檢測細(xì)胞的生長活力，結(jié)果見圖2。由圖2可知，在濃度較低的情況下，芹菜素對BCPAP細(xì)胞增殖抑制作用較弱，在12.5μmol/L濃度下，其細(xì)胞存活率仍保持85.15%；隨芹菜素劑量的增高，BCPAP細(xì)胞的存活率呈明顯下降趨勢。

圖2 MTT法檢測不同濃度的芹菜素對BCPAP細(xì)胞的生長抑制作用Figure 2 Different concentration of apigenin inhibits BCPAP cell viability by MTT assay

MTT法是基于活細(xì)胞線粒體中存在的琥珀酸脫氫酶能使MTT還原為不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（formazan）的原理。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT吸光值與細(xì)胞數(shù)成正比，以溶劑對照組的吸光值為空白值進(jìn)行計算與分析。MTT法檢測不同濃度的芹菜素給藥24h后，對BCPAP細(xì)胞的生長呈明顯抑制作用，藥物作用24h的IC50值為40.65μmol/L。

2.1.2 芹菜素作用時間對BCPAP細(xì)胞生長的影響 采用MTT法檢測濃度分別為12.5，25.0，50.0μmol/L的芹菜素給藥24，48，72h后BCPAP細(xì)胞的生長狀態(tài)，結(jié)果見圖3。

圖3 MTT法檢測不同作用時間下芹菜素對BCPAP細(xì)胞的生長抑制作用Figure 3 Apigenin inhibits BCPAP cell viability for different time by MTT assay

由圖3可知，隨著芹菜素作用時間的延長，BCPAP細(xì)胞的生長均有不同程度的抑制。其中，50μmol/L的芹菜素對BCPAP細(xì)胞作用24，48，72h后，其細(xì)胞存活率分別為41.2% ，38.56%，13.99%。

MTT檢測結(jié)果表明，BCPAP細(xì)胞增殖的抑制率與芹菜素濃度及作用時間密切相關(guān)，且不同藥物濃度與對照組間細(xì)胞抑制率有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01）。

2.2 芹菜素作用BCPAP細(xì)胞后的形態(tài)學(xué)變化

不同濃度芹菜素與BCPAP細(xì)胞共培養(yǎng)24h后，在明場下用相差顯微鏡觀察，對BCPAP細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變進(jìn)行觀察、記錄并分析，其形態(tài)學(xué)變化見圖4。

由圖4可知，與對照組相比，藥物作用組的細(xì)胞形態(tài)有明顯差異。芹菜素對BCPAP細(xì)胞作用之后，BCPAP細(xì)胞數(shù)目不斷減少，細(xì)胞皺縮程度不斷加深，貼壁性變差。

2.3 芹菜素對BCPAP細(xì)胞周期的影響

經(jīng)不同濃度芹菜素處理的BCPAP細(xì)胞，在PI染色后使用流式細(xì)胞儀進(jìn)一步檢測分析，以探討芹菜素對BCPAP細(xì)胞生長抑制的機理，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，雖然在DNA組直方圖上沒有出現(xiàn)典型的凋亡細(xì)胞峰（亞G1峰，圖5），結(jié)合圖6細(xì)胞周期所占百分比來看，經(jīng)芹菜素給藥后，BCPAP細(xì)胞G2/M期所占比例隨給藥濃度的增加不斷增大，G0/G1期所占比例則不斷減少，可據(jù)此推測細(xì)胞周期停滯在G2/M期而無法順利進(jìn)行，從而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡并最終死亡。

細(xì)胞生長受到抑制常與細(xì)胞周期進(jìn)程的改變有關(guān)。已有一些研究［14］表明芹菜素在一些細(xì)胞系中可以誘導(dǎo)發(fā)生細(xì)胞周期阻滯。真核細(xì)胞中存在一些檢測點來調(diào)控細(xì)胞分裂周期，包括G1檢測點、G2檢測點和中期檢測點。G2檢測點位于G2期的最后，它關(guān)系著有絲分裂M期的觸發(fā)起點。

圖4 芹菜素濃度對BCPAP細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響（×200）Figure 4 The effects of different concentration of apigenin to BCPAP cells on morphology（×200）

圖5 芹菜素濃度對BCPAP細(xì)胞周期分布影響的流式直方圖Figure 5 Representative flow cytometry histograms of different concentration of apigenin BCPAP to cells on cell cycle

圖6 芹菜素濃度對BCPAP細(xì)胞周期分布影響的定量分析柱狀圖Figure 6 Bar graphs of quantitative analysis of different concentration of apigenin to BCPAP cells on cell cycle

2.4 芹菜素對BCPAP細(xì)胞Cdc25蛋白表達(dá)的影響

在細(xì)胞周期的調(diào)控中起核心作用的是Cdk/cyclin復(fù)合物，其活性受多種因子的調(diào)控，Cdc25等可以使Cdk/cyclin去磷酸化而活化，進(jìn)而利于細(xì)胞周期順利通過G2檢測點［15，16］。在細(xì)胞生長周期中G2/M期主要受CDK1激酶調(diào)控，CDK1激酶（即有活性的MPF）是由P34cdc2蛋白和細(xì)胞周期蛋白cyclin B組成［14］。CDK1蛋白本身不具有蛋白激酶的活性；當(dāng)cyclin A/B含量積累到一定值時，兩者相互結(jié)合成復(fù)合體，結(jié)合cyclin的CDK1被Wee1將Thr14和Tyr15磷酸化，并被CDK激活激酶將Thr161磷酸化。在M期，Wee1的活性下降，cdc25使CDK1的Thr14和Tyr15去磷酸化，其激酶活性才能表現(xiàn)出來［17］，Cdc2活性的缺失直接導(dǎo)致細(xì)胞周期無法順利進(jìn)行，因而出現(xiàn)G2/M期阻滯現(xiàn)象。而且Cdc25也參與DNA損傷所引起的檢測點應(yīng)答，故試驗結(jié)果中的阻滯有可能是芹菜素引發(fā)DNA損傷導(dǎo)致的結(jié)果，BCPAP細(xì)胞增殖受到明顯抑制可能是凋亡級聯(lián)反應(yīng)引起的。

Cdc25蛋白對控制細(xì)胞有絲分裂進(jìn)入M期和通過G 2/M期檢測點具有重要的作用［14］，研究證明Cdc25在多種癌癥中呈現(xiàn)出過表達(dá)狀態(tài)。圖7所示為不同濃度的芹菜素對BCPAP細(xì)胞中Cdc25蛋白表達(dá)的Western blot條帶和光密度值分析結(jié)果。由圖7可知，在芹菜素的作用下，BCPAP細(xì)胞中Cdc25蛋白的表達(dá)量隨藥物濃度的升高而明顯下降，表明細(xì)胞中Cdk/cyclin復(fù)合物活性降低，此現(xiàn)象是細(xì)胞G 2/M期阻滯的標(biāo)志，進(jìn)而使細(xì)胞增殖速度減慢。

圖7 Western blot法檢測不同濃度芹菜素對BCPAP細(xì)胞Cdc25蛋白表達(dá)的影響Figure 7 The effects of different concentration of apigenin to BCPAP cells on the expression of Cdc25

3 結(jié)論

本研究通過MTT法檢測顯示：芹菜素的濃度對BCPAP細(xì)胞毒性有明顯劑量和時間依賴性；明場圖片表明芹菜素給藥組對BCPAP細(xì)胞形態(tài)和數(shù)目的影響明顯強于對照組，對照組的細(xì)胞數(shù)目多且細(xì)胞圓潤飽滿，芹菜素給藥組的細(xì)胞數(shù)目少且皺縮漂浮，表明芹菜素對BCPAP細(xì)胞生長有抑制作用；流式細(xì)胞儀檢測表明芹菜素給藥后，BCPAP細(xì)胞的細(xì)胞周期有明顯影響，使細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，能加速誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生程序性死亡。

綜上所述，芹菜素能抑制甲狀腺癌細(xì)胞的增殖和生長，其抑制機制可能使BCPAP細(xì)胞生長停滯在G2/M期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其確切的抑癌機制還有待進(jìn)一步的研究證實。

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