生物源保鮮劑枯草芽孢桿菌對錦橙貯藏病菌敏感性和保鮮效果

劉浩強，李鴻筠，向可海，冉　春，胡軍華，姚廷山，向　琴，楊　華，陳洪明

（1.西南大學柑桔研究所/中國農業(yè)科學院柑桔研究所，重慶400712；2.國家柑橘工程技術研究中心，重慶400712；3.重慶開縣南門鎮(zhèn)人民政府，重慶405403；4.重慶萬州三峽職業(yè)技術學院，重慶405403；5.遼寧省果樹科學研究所，遼寧營口115009）

生物源保鮮劑枯草芽孢桿菌對錦橙貯藏病菌敏感性和保鮮效果

劉浩強1，2，李鴻筠1，向可海3，冉春1，胡軍華1，姚廷山1，向琴4，楊華5，陳洪明1

（1.西南大學柑桔研究所/中國農業(yè)科學院柑桔研究所，重慶400712；2.國家柑橘工程技術研究中心，重慶400712；3.重慶開縣南門鎮(zhèn)人民政府，重慶405403；4.重慶萬州三峽職業(yè)技術學院，重慶405403；5.遼寧省果樹科學研究所，遼寧營口115009）

研究了生物源保鮮劑枯草芽孢桿菌對錦橙采后主要病菌的毒性及對錦橙果實的貯藏保鮮效果。結果表明：枯草芽孢桿菌可濕性粉劑對青霉菌和綠霉病的毒性較大，EC50值分別為7.4970μg/mL和8.8832μg/mL。保鮮結果表明：枯草芽孢桿菌可濕性粉劑2000倍液對青霉病、綠霉病、炭疽病等總病害均有較好的防治效果，比對照藥劑250g/L咪鮮胺乳油667倍液效果好。在15～45d時，枯草芽孢桿菌可濕性粉劑各處理對錦橙的失重率沒有影響；貯藏到60d后，對失重率有一定的影響，枯草芽孢桿菌2000倍液對果實品質的影響和清水對照比較沒有差異性，并且對外觀色澤和口感沒有負面影響?？偟膩碚f：枯草芽孢桿菌可濕性粉劑2000倍液對錦橙儲藏保鮮效果較好。

生物源保鮮劑，敏感性，錦橙，致病菌，保鮮效果

柑橘是世界上最重要的水果之一，全球有多個國家和地區(qū)種植柑橘，但主要分布在南北緯度40°區(qū)域內具有適宜土壤和氣候條件的熱帶和亞熱帶地區(qū)。在我國南方，柑橘是最廣泛種植的水果品種之一。近年柑橘產業(yè)發(fā)展勢頭迅猛，產量顯著提高，已經成為柑橘主產區(qū)農業(yè)經濟的支柱產業(yè)之一[1-3]，為促進農村經濟社會發(fā)展、有效改善生態(tài)環(huán)境做出了積極貢獻，尤其對我國三峽庫區(qū)生態(tài)建設起到了不可磨滅的作用。但柑橘果實在運輸、貯藏過程中容易受到青霉、綠霉和炭疽菌等傳染性病害的侵染而造成腐爛損失達10%～30%，嚴重時高達50%以上[4-7]，通過柑橘采后貯藏保鮮技術來延長果品供應的時間，增加銷售期，錯開銷售高峰，可以更好地減輕集中上市所帶來的壓力，提高農業(yè)經濟收益[8-10]。

目前控制柑橘采后病害的主要手段是使用化學保鮮劑，但在我國廣大柑橘產區(qū)，長期單一使用一種單劑，并且連續(xù)多年使用，病菌已經對其產生了抗藥性，防治效果大幅下降，并且存在農殘問題，對人類健康有潛在危險，現在陸續(xù)已被禁止使用，如雙胍鹽、多菌靈等保鮮劑[11]。為了減輕柑橘在貯藏運輸過程中由病害造成的損失，迫切需要研究者們不斷尋求一些低毒、高效以及低殘留的生物源防腐保鮮新藥劑，以取代高毒的、已有抗藥性的化學保鮮劑[11-17]。本實驗選用1種低毒高效的生物源保鮮劑對柑桔不同貯藏病菌的敏感性以及保鮮效果進行綜合評價，進而為其實際應用提供科學依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

供試錦橙品種錦橙采摘自中國農業(yè)科學院錦橙研究所實驗果園；供試菌種青霉菌（Penicillium italicumWehmer）、綠霉菌（Penicilliumdigitatum Saccardo）、炭疽桿菌（Colletotrichum gloeosporiorides Penz）、酸腐?。∣ospora citriaurantii ex Persoon）；供試混配保鮮劑1×1011活芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑（WP）（2000倍液、3000倍液和4000倍液），德強生物股份有限公司；對照藥劑250g/L咪鮮胺乳油Prochloraz667倍液（使用劑量375μg/mL），江蘇省揚州市蘇靈農藥化工有限公司；無水乙醇、氫氧化鈉、氯化鋇、葸酮、L-甲硫氨酸、抗壞血酸、鄰苯二甲酸氫鉀、四氮唑藍、冰乙酸（均為分析純） 上海試劑廠。

FA2004電子天平上海方瑞儀器有限公司；UV1800PC分光光度計上海奧析儀器有限公司。PYX-DHS隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱上海躍進醫(yī)療器械廠；GL-10高速冷凍離心機上海安亭科學儀器廠；S212攪拌器上海予華儀器；MLR-351H智能人工氣候箱日本三洋公司；DK-S26電熱恒溫水浴鍋上海一科儀器公司。

1.2實驗方法

1.2.1室內毒力測定方法采用菌絲生長速率測定法[18-19]。在預實驗的基礎上，將各藥劑分別設置為5個質量濃度梯度，先將保鮮劑分別制成有效成分含量為1、5、10、50、100μg/mL（其中炭疽桿菌酸腐病菌濃度分別為5、10、50、100、200μg/mL）的系列質量濃度馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基[potato dextrose agar（medium），PDA]平面，每個處理的保鮮劑的每個質量濃度均設3次重復。另設加入無菌水的PDA培養(yǎng)基平板作對照。然后用直徑6mm的打孔器在病原菌菌落邊緣切取生長力一致的菌塊，分別移植于各含藥PDA培養(yǎng)基平板中央，然后置于（26±0.5）℃恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。培養(yǎng)一定時間后，用游標卡尺測量菌落直徑（以十字交叉法測量），由菌落直徑平均值計算菌絲生長抑制率。用質量濃度對數值（X）與抑制百分率的機率值（Y）進行直線回歸分析，檢驗相關系數的顯著性，并求出直線回歸方程Y＝a＋bX。根據回歸方程求出藥劑的半數有效量（median effective concentration，EC50）值及相關系數R。比較1×1011活芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑對幾種柑桔貯藏病原菌的毒力大小。

1.2.2貯藏保鮮效果的研究實驗在重慶市北碚區(qū)中國農業(yè)科學院柑桔研究所自然通風貯藏庫內進行，實驗前進行消毒。實驗錦橙轉熟期間尚未噴過任何殺菌劑。庫房內的溫度為自然室溫，適當利用開關通風窗的自然換氣方法來調節(jié)室溫。各處理的貯藏條件保持一致。實驗期間，貯藏庫內的平均溫度為15℃，極端最高溫度為22℃，極端最低溫度為11.0℃，平均相對濕度為81.3%。每處理4次重復（小區(qū)），每小區(qū)用果100個，每處理共用果400個，使用浸漬法。將不同處理分別完全浸漬于該藥液1min撈起晾干，對照用清水浸漬。處理完畢，待藥液瀝干后將各個小區(qū)的果實裝進一個塑料果箱，置于通風貯藏庫內的鐵架上，完全隨機排列，2～3d后用聚乙烯薄膜果袋單果套袋，同時記錄病果，統(tǒng)計時加以校正。

處理后15d進行第1次調查，以后每15d調查1次，前后共調查4次，即貯藏15、30、45、60d。調查時各處理果實自上而下逐果翻檢，將病果取出，然后果蒂朝上放好。每次每小區(qū)分別調查記載錦橙青霉病、綠霉病、炭疽病、酸腐病和其他病果數，并將病果取出，然后分別計算病果率和保鮮效果。同時肉眼觀察每個處理的果實外觀，最后對各處理已編號的果實進行單果稱重，并從已編號的果實中選出10個好果的前后單果重來計算失重率。

1.2.3失重的稱量處理前每個重復稱10kg果，并統(tǒng)計個數，處理前從每個重復中隨機取出20個果實進行編號，分別用電子天平稱量單果重量。同時肉眼觀察每個處理的處理后果實外觀，對各處理已編號的果實進行單果稱重，并從已編號的果實中選出10個好果的前后單果重來計算失重率（以平均值為準）。

1.2.4枯草芽孢桿菌可濕性粉劑處理后各生理指標變化可溶性固型物：用手持折光儀進行測定；總糖：用葸酮比色法測定[20]；有機酸含量：酸堿滴定法測定[20]；維生素含量：依照GB/T 8210-2011《錦橙鮮果檢驗方法》中的2，6-二氯酚靛酚法測定[20]。所有實驗重復3次，在實驗后15、30、45、60d分別抽樣測定。

1.2.5數據處理實驗數據采用Excel 2000軟件進行統(tǒng)計，應用DPS軟件進行方差分析[21]。顯著性測定采用鄧肯氏新復極差（DMRT）法。

2　結果與分析

2.1枯草芽孢桿菌可濕性粉劑對錦橙貯藏病菌的敏感性

經DPS數據處理系統(tǒng)分析得到濃度對數值（X）與抑制百分率值（Y）的毒力回歸方程、EC50值、相關系數，如表1所示。結果表明，枯草芽孢桿菌WP對青霉菌、綠霉菌、炭疽病菌和酸腐病菌都有一定的抑菌效果，尤其對青霉菌的抑制效果最好，EC50值為7.4970μg/mL，對綠霉菌效果次之，EC50值為8.8832μg/mL，對酸腐病菌的抑制效果最差，EC50值為57.5406μg/mL。

表1　1×1011活芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑對錦橙貯藏病菌的毒力回歸分析Table.1　Regression analysis for the toxicity of preservation effect of 100 billion/brevibacterium WP on Penicillium italicum Wehmer

2.2枯草芽孢桿菌可濕性粉劑對錦橙貯藏保鮮的整體效果

通過在自然通風貯藏庫內用1×1011活芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑對錦橙貯藏期間病害的防治效果實驗研究，結果表明1×1011活芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑2000～4000倍液對錦橙防腐保鮮均有一定的效果，見表2。貯藏15d時各處理的防治效果均較好，在63.48%～93.50%之間，此后各處理的防治效果均隨著貯藏時間的延長而逐漸下降。貯藏30d時除枯草芽孢桿菌可濕性粉劑4000倍液為62.06%以外，其余各處理防治效果均在70%以上。然而，貯藏45d以后除枯草芽孢桿菌可濕性粉劑2000倍液保鮮效果在70%以上，3000倍液和4000倍液處理均在60%以下。根據方差分析結果表明，貯藏15d時，各個處理間不存在顯著性差異；30d時，枯草芽孢桿菌可濕性粉劑2000倍液顯著優(yōu)于其他處理；貯藏到45d和60d時，枯草芽孢桿菌可濕性粉劑2000倍液極顯著優(yōu)于3000倍液和4000倍液；枯草芽孢桿菌可濕性粉劑2000倍液與對照藥劑相比較，效果好于對照藥劑，綜上結果，對錦橙的貯藏保鮮整體效果，以枯草芽孢桿菌可濕性粉劑2000倍液最佳，延長貯藏防腐保鮮的時間最久。

表2　1×1011活芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑對錦橙貯藏保鮮總病害的防治效果（%）Table.2　The control effect of preservation effect of 100 billion/brevibacterium WP against citrus storage total diseases（%）

表3　1×1011活芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑對錦橙青、綠霉病的防治效果（%）Table.3　The control effect of preservation effect of 100 billion/brevibacterium WP against Peniciuuium and green mold（%）

2.3枯草芽孢桿菌可濕性粉劑對青霉病、綠霉病的防治效果

結果見表3。通過在貯藏庫內用1×1011活芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑對錦橙貯藏期間進行青霉病、綠霉病防治貯藏實驗，結果表明，1×1011活芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑對錦橙貯藏期間發(fā)生的青霉病、綠霉病均有較好的防治效果?？莶菅挎邨U菌可濕性粉劑2000～4000倍液在15～30d均具有較好的防治效果，效果在68.67%以上，高的可達100%；45d后只枯草芽孢桿菌可濕性粉劑4000倍液表現略差些（為41.67%），其余各處理的防治效果均較為理想，在68.87%～81.14%之間；貯藏到60d后，只有對照藥劑250g/L咪鮮胺667倍液防治效果在70%以上，其余各處理效果較差（60%以下），尤其是枯草芽孢桿菌可濕性粉劑4000倍液僅11.73%。但枯草芽孢桿菌可濕性粉劑2000倍液對青霉病、綠霉病均有一定的防治效果，雖然防治效果隨著貯藏時間的延長而逐漸下降，但下降程度最慢，結果表明，枯草芽孢桿菌可濕性粉劑對錦橙青霉病、綠霉病的各個處理中，防治效果最好的是枯草芽孢桿菌可濕性粉劑2000倍液，防治效果最差的為4000倍液。

2.4枯草芽孢桿菌可濕性粉劑對炭疽病的防治效果

結果見表4。通過在貯藏庫內用1×1011活芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑對錦橙貯藏期間進行炭疽病防治貯藏實驗，結果表明，1×1011活芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑對貯藏期間發(fā)生的炭疽病具有一定的防治效果。貯藏15d時枯草芽孢桿菌可濕性粉劑2000倍液和3000倍液效果在70%以上，特別是枯草芽孢桿菌可濕性粉劑2000倍液在貯藏15～60d時，效果均在69%以上，總體好于對照藥劑250g/L咪鮮胺667×（375μg/mL）。但枯草芽孢桿菌可濕性粉劑3000～4000倍液處理效果相對較差，貯藏30d以后均在50%以下。

表4　1×1011活芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑對錦橙炭疽病的防治效果（%）Table.4　The control effect of preservation effect of 100 billion/brevibacterium WP against anthracnose（%）

2.5枯草芽孢桿菌可濕性粉劑對酸腐病的防治效果

結果見表5。通過在貯藏庫內用1×1011活芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑對錦橙貯藏期間進行酸腐病防治貯藏實驗，結果表明，1×1011活芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑2000倍液，在貯藏15～30d時，效果較好，達70%以上；45d以后，效果在50%以下。然而，枯草芽孢桿菌可濕性粉劑3000～4000倍液，在30d以后，防治效果在30%以下，防治效果較差。

表5　1×1011活芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑對錦橙酸腐病的防治效果（%）Table.5　The control effect of preservation effect of 100 billion/brevibacterium WP against sour disease（%）

2.6枯草芽孢桿菌可濕性粉劑對錦橙失重率的影響

結果見表6。據浸藥處理前和貯藏不同時間后各次的調查結果，藥后15、30、45d，不同藥劑處理后錦橙的失重率各有不同，與清水對照比較，不存在顯著性差異；貯藏到60d時，枯草芽孢桿菌3000倍液和4000倍液的失重率在5%的水平上顯著高于清水對照。結果表明貯藏15～45d，3種倍數處理對錦橙的失重率沒有影響；貯藏到60d后，枯草芽孢桿菌3000倍液和4000倍液對錦橙果實的失重率有一定的影響。

表6　1×1011活芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑對錦橙失重率的影響（%）Table.6　The effect of the 100 billion/brevibacterium WP on dehydration rate of the Glorious orange（%）

2.7枯草芽孢桿菌可濕性粉劑對錦橙果實外觀色澤和口感的影響

藥劑處理后貯藏到60d后錦橙果實外觀色澤有一定變化，各個處理均由橙黃色逐漸變成橙紅色，果實飽滿，與清水對照無明顯差異。4個處理后果蒂多數保持綠色，清水對照果蒂則已經枯萎?？诟薪Y果：枯草芽孢桿菌可濕性粉劑處理的和清水對照比較，風味基本一致，屬正常，咪鮮胺略有枯水，風味有所下降。

2.8枯草芽孢桿菌可濕性粉劑對錦橙果實品質的影響

枯草芽孢桿菌可濕性粉劑處理后對錦橙果實品質的影響，見表7。結果表明：錦橙果實的可溶性固形物在15～30d均略有上升，4個藥劑處理與清水對照之間不存在顯著性差異，貯藏到60d時下降，只枯草芽孢桿菌可濕性粉劑4000倍液顯著低于清水對照。4個藥劑處理后總糖、有機酸和維生素C的含量均隨著貯藏時間的延長而逐漸下降，下降速度較為緩慢，15～45d時4個處理與清水對照相比，總糖含量無差異顯著性，60d時枯草芽孢桿菌可濕性粉劑4000倍液顯著低于清水對照；藥劑處理后的有機酸均在15～30d時與清水對照無差異，45d時，枯草芽孢桿菌可濕性粉劑3000倍液顯著低于清水對照，60d時，枯草芽孢桿菌可濕性粉劑3000～4000倍液處理的顯著低于清水對照；藥劑處理后的維生素C含量，15～30d時4個處理與清水對照相比，維生素C含量無差異顯著性，45d時，枯草芽孢桿菌可濕性粉劑4000倍液顯著低于清水對照，60d時，枯草芽孢桿菌可濕性粉劑3000～4000倍液處理顯著低于清水對照，根據以上結果枯草芽孢桿菌2000倍液處理對錦橙的生理指標和清水對照相比，幾乎沒有影響，枯草芽孢桿菌可濕性粉劑3000～4000倍液對錦橙果實的品質有一定的影響。

表7　1×1011活芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑劑處理后對錦橙生理指標的影響Table.7　Physiological indexes influence of the 100 billion/brevibacterium WP of preservatives on Glorious orange

3　討論

柑橘果實在貯藏運輸期間容易發(fā)生各種儲藏病害[7]。為了減輕貯藏病害所造成的損失，采果后需用保鮮劑處理以防腐保鮮，生產上常用多菌靈、甲基硫菌靈等防治田間病害和貯藏病害，病菌對這些常規(guī)殺菌劑已經產生一定程度的抗藥性，因此需篩選低毒的化學保鮮劑或者生物源保鮮劑用來防治貯藏病害。生物源保鮮劑作為一種新型保鮮劑現在已廣泛應用于柑桔儲藏保鮮，生物源保鮮劑枯草芽孢桿菌菌體在生長過程中可產生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短桿菌肽等活性物質，這些活性物質對致病菌有明顯的抑制作用，并且枯草芽孢桿菌菌體自身合成α-淀粉劑酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶等酶類，與果實體內的消化酶類一同發(fā)揮作用，低毒、高效、環(huán)境相溶性好，在本實驗中取得了較好的實驗結果。

保鮮劑對柑橘貯藏病害的保鮮效果不能單一從某一方面來評價，保鮮效果是保鮮劑、果實和環(huán)境三者綜合作用的結果，應該從貯藏保鮮效果、外觀色澤、口感、生理生化營養(yǎng)指標等多方面來評價。水分是影響果實新鮮度、脆度和口感的關鍵因子，但果實采后水分容易散失。果實在貯藏過程中，隨著時間的延長柑橘各個品種的失重率逐漸增加，藥劑處理雖不會導致失重率增加，但也不會降低果實的失重率，因此常溫貯藏時間不宜過長，以免造成果實失重過多、果皮皺縮，風味變淡而失去商品經濟價值。

判斷果實營養(yǎng)品質，主要包含可溶性固形物、總糖、有機酸、維生素C等指標[22-25]，貯藏過程中應注意庫房通風透氣。最好是晴天采果，采果時應注重采果質量，輕拿輕放，采果前剪除手指甲，并戴手套，以免對果皮造成機械傷口，影響貯藏防腐保鮮效果[26]。本研究結果中上述指標與清水對照無差異，表明枯草芽孢桿菌處理對錦橙果實沒有負面影響。

4　結論

通過室內保鮮研究，結果表明，枯草芽孢桿菌可濕性粉劑對青霉菌和綠霉病毒性最大，EC50值分別為7.4970μg/mL和8.8832μg/mL；對酸腐爛病的毒性最小，半數有效質量濃度EC50值為57.5406μg/mL。根據保鮮效果來看：1×1011活芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑2000倍液對青霉病、綠霉病、炭疽病等總病害均有較好的保鮮效果，60d對總病害的保鮮效果在70%以上，比對照藥劑250g/L咪鮮胺乳油667倍液效果好?？莶菅挎邨U菌可濕性粉劑各處理對錦橙的失重率沒有影響，只隨著貯藏時間的延長，失重率均逐漸增加，貯藏到60d后各處理有一定差異?？莶菅挎邨U菌可濕性粉劑處理的和清水對照比較，風味基本一致，枯草芽孢桿菌可濕性粉劑處理對果蒂保持綠色有一定效果，對錦橙果實的內在品質、外觀色澤和口感沒有負面影響。根據實驗結果枯草芽孢桿菌可濕性粉劑2000倍液可在生產上大量使用。

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Biological preservative of 100 billion/brevibacterium wp on glorious orange storage pathogens sensitivity and preservation effect of fruit storage

LIU Hao-qiang1，2，LI Hong-jun1，XIANG Ke-hai3，RAN Chun1，HU Jun-hua1，YAO Ting-shan1，XIANG Qin4，YANG-Hua5，CHEN Hong-ming1
（1.Citrus Research Institute，Southwestern University/Citrus Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Chongqing 400712，China；2.National Citrus Engineering Research Center，Chongqing 400712，China；3.Nanmen Government of Chongqing Kaixian，Chongqing 405403，China；4.Chongqing Three Gorges Vocational College，Chongqing 405403，China；5.Liaoning Provincial Institute of Fruit Tree Science，Yingkou 115009，China）

In this study，the toxicity of the brevibacterium wettable powder（WP）on major postharvest pathogens of citrus and their efficacy in preserving the quality of glorious orange were investigated.The results showed that brevibacterium WP had the stronger toxic effects on Penicillium italicum Wehmer and Penicillium digitatum Saccardo，EC50value were 7.4970μg/mL and 8.8832μg/mL，according to preservation effect of view.The results showed that there were significant control effect of the brevibacterium WP 2000 times against Penicillium，green mold，anthracnose and total diseases，in 60 days.The brevibacterium WP had the better control effect than the control agent prochloraz EC at 667 times，comparison with water control.In 15 to 45 days the 100 billion/ brevibacterium WP dip drug treatment had no effect on the weight loss of Glorious orange.After 60 day the brevibacterium WP had some influence on fruit weight loss Glorious orange.The brevibacterium 2000 times and the water had no difference on fruit nutritional quality impact，but no negative impact on the appearance，color and taste of the Glorious orange fruit.Sum up：the brevibacterium WP 2000 times had better preservation effect of fruit storage to glorious orange.

antimicrobial；sensitivity；glorious orange；pathogens；preservation effect

TS255.3

A

1002-0306（2015）04-0315-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.060

2014－04－14

劉浩強（1978-），男，碩士研究生，助理研究員，主要從事柑橘貯藏病害方面的研究。

國家科技支撐計劃課題（2012BAD19B06）；國家星火計劃課題（2012GA811001）；公益性行業(yè)科研專項（201203034）；重慶市自然科學基金（cstc2011jjA80025）。