Box-behnken設(shè)計優(yōu)化玉米須黃酮純化工藝研究

郭志紅，周鴻立，郭向明

（1.吉林大學(xué)化學(xué)學(xué)院，吉林長春130012；2.吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林吉林132022）

Box-behnken設(shè)計優(yōu)化玉米須黃酮純化工藝研究

郭志紅1，2，周鴻立2，*，郭向明2

（1.吉林大學(xué)化學(xué)學(xué)院，吉林長春130012；2.吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林吉林132022）

以玉米須總黃酮回收率作為考察指標(biāo)，用AB-8大孔樹脂進行純化，在單因素實驗基礎(chǔ)上，采用Box-behnken設(shè)計優(yōu)化洗脫條件，確定最佳純化條件為：上樣濃度為2mg/mL，上樣速度為1mL/min，上樣量為55mL，吸附時間2h，用乙醇濃度70%，乙醇體積4BV，洗脫速率為1.8mL/min，在最佳工藝條件下玉米須總黃酮回收率可達(dá)80.68%，玉米須粗提物中總黃酮含量由純化前的4.15%提高到25.68%。實驗說明，該法操作簡單、方便、便于工業(yè)化生產(chǎn)。

玉米須黃酮，AB-8大孔樹脂，Box-behnken設(shè)計，回收率

玉米須（Zea mays L.）為禾本科玉蜀黍?qū)僦参镉衩椎幕ㄖ椭^，含有黃酮類、多糖類、皂甙、生物堿、單寧酸、綠原酸、蛋白質(zhì)、揮發(fā)性油和類固醇[1-2]等多種生物活性成分。黃酮類成分有降壓、降血脂、增加冠脈流量、強心、抗心律不齊等藥理作用[3]。因此對玉米須黃酮純化研究很有必要。

大孔吸附樹脂是近年來發(fā)展起來的一類有機高分子聚合物吸附劑，其具有物理化學(xué)穩(wěn)定性好、工藝簡單、吸附容量大、速度快、再生簡便、使用周期長、機械強度高等諸多優(yōu)點[4]，廣泛用于天然產(chǎn)物的純化。Box-behnken設(shè)計——響應(yīng)曲面法（response surface methodology，RSM）是一種應(yīng)用較廣的實驗優(yōu)化方法，由于采用了更為合理的實驗設(shè)計，通過多項式模型有效快速地確定多因子系統(tǒng)的最佳條件[5]。目前響應(yīng)面法已廣泛用于天然產(chǎn)物的提取過程，有關(guān)應(yīng)用于黃酮類純化的報道較少，目前筆者只見響應(yīng)面法純化刺山柑葉黃酮[6]、枳實總黃酮[7]、苦蕎黃酮[8]的相關(guān)報道，未見應(yīng)用于大孔樹脂純化玉米須黃酮的工藝。本文中用AB-8大孔樹脂純化玉米須粗黃酮，采用Box-Behnken設(shè)計方法，探索研究最佳的洗脫工藝，為玉米須黃酮的精制提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

玉米須玉米須藥材2012采自吉林省吉林市郊區(qū)，由吉林大學(xué)王廣樹教授鑒定為甜粘1號；蘆丁對照品0080-9705，純度＞98%，中國藥品生物制品檢定所；AB-8大孔樹脂天津南開大學(xué)化工廠；實驗用水為蒸餾水；無水乙醇、濃鹽酸、氫氧化鈉、濃硫酸、苯酚、無水三氯化鋁均為分析純。

752紫外可見分光光度計上海菁華科技儀器有限公司；FA1004電子天平上海菁海儀器有限公司；層析柱（18mm×200mm） 上海天玻儀器；GZXGW·2-BS高溫干燥箱上海博泰實驗設(shè)備有限公司；PHS-3C數(shù)字式酸度計上海理達(dá)儀器廠；SHB-ⅢA循環(huán)水式多用真空泵鄭州長城科工貿(mào)有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器廠；KQ2500B超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋國華電器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1樣品的處理與制備玉米須清洗去塵，晾干，粉碎，過篩（60目）后，稱取300g玉米須粉末，放入大燒瓶中，按料液比1∶25的比例加入60%的乙醇，80℃下提取2h，重復(fù)兩次，過濾，合并濾液，濃縮，用60%的乙醇定容到1000mL容量瓶，備用。

1.2.2黃酮的含量測定以蘆丁為對照品，采用三氯化鋁顯色法測定玉米須黃酮[9]。得回歸方程為：y=24.834x+0.0071，r2=0.9995，黃酮質(zhì)量濃度在10～30μg/mL呈良好的線性關(guān)系。

1.2.3單因素實驗

1.2.3.1上樣液pH對吸附性能的影響將玉米須總黃酮濃度為1.2mg/mL的玉米須黃酮上樣液用5%鹽酸和2%的NaOH溶液調(diào)成pH=3、4、5（原液5.4）、6、7、8、9，分別取20mL于250mL的裝有2g預(yù)處理后樹脂的三角燒瓶中，封口，置于恒溫水浴搖床中振搖24h，充分吸附后，靜止2h，過濾，測定濾液的濃度，計算吸附率。吸附率Q=（C0－Ct）Vy/C0Vy

式中，C0為樣液的初始質(zhì)量濃度，Ct為吸附后樣液質(zhì)量濃度，Vy為樣液體積。

1.2.3.2上樣濃度對總黃酮回收率的影響以篩選出的AB-8型大孔樹脂為玉米須總黃酮的純化載體，采用濕法裝柱。裝柱高度為10cm，即1BV（柱床體積）約為20mL。取總黃酮濃度為0.52、1.03、1.58、2.04、2.81mg/mL的樣液各40mL，以1.5mL/min的流速，分別加入5根同樣的樹脂柱中。吸附完全后，用去離子水沖至流出液無色，再用濃度70%乙醇洗脫，乙醇用量為4BV，測定回收率，選擇最適上樣濃度。

回收率（%）=乙醇洗脫所得總黃酮的質(zhì)量/上樣前總黃酮的質(zhì)量×100

1.2.3.3上樣量的確定將提取液總黃酮稀釋為濃度2.07mg/mL的樣液若干，量取10mL已處理好的樹脂裝于層析柱（1.8mm×200mm）中，以1mL/min的速度上樣，每5mL為一個收集段，檢測每段收集液中總黃酮濃度。當(dāng)流出液的濃度達(dá)到初始濃度的1/10時，即可認(rèn)為樹脂已吸附飽和。

1.2.3.4上樣速率對總黃酮回收率的影響取總黃酮濃度為2mg/mL的樣液5份，每份40mL。分別以0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL/min的流速加入到5根同樣的樹脂柱中。吸附完全后（大約2h），用去離子水沖洗至流出液無色，再用濃度70%乙醇洗脫，乙醇用量為4BV，測定回收率，選擇最適合上樣速率。

1.2.3.5吸附時間對總黃酮回收率的影響取5根相同的玻璃層析柱（18mm×200mm），5份相同體積的已處理好的樹脂20mL，濕法裝柱，總黃酮濃度為2.0mg/mL的溶液5份，每份40mL，上樣，上樣速度1mL/min，上樣后分別吸附1、2、3、4、5h后，水洗至流出液無明顯顏色，分別加入70%的乙醇80mL，洗脫速度為1.5mL/min，測洗脫液濃度，計算回收率。

1.2.3.6乙醇洗脫濃度對總黃酮回收率的影響取20mL飽和吸附的AB-8樹脂五份，裝入相同型號的五根層析柱，先用去離子水沖洗至流出液無色，再分別用濃度40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液進行洗脫，洗脫速率為2mL/min，乙醇用量為4BV，測定其回收率，選擇最適洗脫濃度。

1.2.3.7洗脫速率對總黃酮回收率的影響取20mL飽和吸附的AB-8樹脂五份，裝入相同型號的五根層析柱，先用去離子水沖洗至流出液無色，然后用濃度70%的乙醇溶液分別以1、2、3、4mL/min的速率進行洗脫，乙醇用量為4BV，測定其回收率，選擇最適洗脫速率。

1.2.3.8洗脫劑體積的考察取按上述條件吸附后的AB-8大孔樹脂20mL，用純化水洗脫至無明顯顏色，再用70%乙醇洗脫，流速為2mL/min，每5mL收集一次洗脫液，檢測洗脫液中玉米須總黃酮濃度。

1.2.3.9響應(yīng)面實驗設(shè)計根據(jù)Box-Behnken實驗設(shè)計原理，在單因素實驗基礎(chǔ)上，共設(shè)計17個實驗點，12個分析點，5個零點以估計誤差，每次精密量取20mL吸附飽和的大孔樹脂進行實驗，選用對解析率影響較大洗脫劑濃度X1、洗脫速率X2和洗脫劑用量X3為變量，以玉米須總黃酮回收率為響應(yīng)值（R），進行響應(yīng)面分析實驗。實驗設(shè)計表1。

表1　響應(yīng)面實驗因素水平表Table.1　Factors and levels of RSM

1.3數(shù)據(jù)處理

按照表1的設(shè)計方案，利用Design-Expertv8.0.5軟件，采用Box-Behnken設(shè)計、二項式模型進行回歸分析。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素實驗

2.1.1上樣液pH對吸附性能的影響當(dāng)pH=3、4時，溶液中出現(xiàn)磚紅色沉淀，可能是黃酮類物質(zhì)生成烊鹽，導(dǎo)致吸附效果變差。當(dāng)pH=9時，溶液部分變綠色，導(dǎo)致黃酮類物質(zhì)變質(zhì)，影響吸附效果，在pH5.0時，黃酮類化合物最適宜被該樹脂吸附。這可能是由于在此條件下，黃酮類物質(zhì)呈分子狀態(tài)，不生成烊鹽，以氫鍵方式被吸附[7]，因而樹脂吸附量大，吸附率也高。因此，原液（pH=5.3）不需要調(diào)節(jié)pH，可直接使用。

圖1　pH對總黃酮吸附率影響Fig.1　Effect of pH values on the adsorption efficiency

2.1.2上樣濃度對總黃酮回收率的影響從圖2可以看出，當(dāng)上樣液濃度為0.5mg/mL時，樹脂對黃酮液的吸附率達(dá)到最大，此時上樣量較少，絕大部分黃酮都被吸附，樹脂未飽和，當(dāng)用蒸餾水洗樹脂時，只有少數(shù)黃酮洗出，損失量少，回收率大，隨濃度的增加上樣量增加吸附量逐漸增大，當(dāng)樹脂完全飽和時，吸附量不再變化，相應(yīng)的黃酮就有損失，上樣量越大水洗時損失越大，在2mg/mL左右時回收率達(dá)到最大，為了充分利用樹脂，將濃度為2mg/mL的溶液作為上樣液的最佳濃度。

圖2　上樣濃度對回收率的影響Fig.2　Effect of sample concentration on recovery efficiency

2.1.3上樣量的確定實驗以流出黃酮濃度為上樣液的10%時為泄露點，根據(jù)圖3可知當(dāng)上樣55mL時達(dá)到泄露點，吸附量為105mg，當(dāng)上樣為160mL時接近上樣液濃度，上樣量為此時可確定為上樣體積為55mL，約為3BV。

圖3　上樣量對吸附效果的影響Fig.3　Effect of sample loading amount on the recovery efficiency

2.1.4上樣速率對總黃酮回收率的影響從圖4可知，當(dāng)上樣速度為0.5mL/min時黃酮的回收率最大，隨著上樣速度的增大，回收率逐漸減小，原因可能是樹脂的內(nèi)擴散速率與上樣液流速的反比關(guān)系[10]。上樣液流速過快，總黃酮未進行徹底吸附就已經(jīng)發(fā)生泄漏。但當(dāng)速度為1mL/min時，回收率與最大值相差不大，為了節(jié)省時間，選擇1mL/min作為最佳的上樣速度。

2.1.5吸附時間的對總黃酮回收率的影響從圖5中可以看出，在2h內(nèi)由于吸附時間短，黃酮分子未與樹脂完全吸附，水洗時會帶走一部分未被吸附的黃酮，回收率較低，隨著時間的增加，黃酮分子逐漸被吸附完全，2h時達(dá)到最大值，吸附時間超過2h后，由于吸附時間過長會有一部分雜質(zhì)也被吸附，黃酮分子與樹脂間形成死吸附，回收率逐漸下降，因此最佳吸附時間為2h。

2.1.6乙醇洗脫濃度對總黃酮回收率的影響從圖6中可知看出，總黃酮的回收率隨著乙醇濃度的增大而呈上升趨勢，體積分?jǐn)?shù)在70.0%時達(dá)到最大，之后略顯下降。不同濃度的乙醇的極性不同，隨著乙醇濃度的增大極性逐漸減小，在40%的乙醇洗脫時包括多糖類的大分子物質(zhì)組分先流出，雜質(zhì)較多，在70%時黃酮類物質(zhì)基本被洗脫，90%時極性小，洗脫物質(zhì)大多為苷元類物質(zhì)，因此選擇70%的乙醇為洗脫溶劑。

圖4　上樣速度對回收率的影響Fig.4　Effect of loading flow rate on the recovery efficiency

圖5　吸附時間對回收率的影響Fig.5　Effect of adsorption time on the recovery efficiency

圖6　乙醇濃度對回收率的影響Fig.6　Effect of different ethanol concentration on recovery efficiency

2.1.7洗脫速率對總黃酮回收率的影響從圖7中可以看出，隨著乙醇流速增大回收率降低，這是因為在乙醇體積相同的情況下，乙醇流速太大，洗脫劑還未充分洗脫樹脂上吸附的黃酮就已經(jīng)流出柱外，因此洗脫流速應(yīng)比較小，但流速過低將導(dǎo)致整個洗脫過程時間變長，生產(chǎn)周期延長。從圖7中可以看出，當(dāng)洗脫速率1.0mL/min時洗脫效果最好，而在洗脫流速1.0～2.0mL/min之間下降趨勢不明顯，綜合考慮解吸率及時間后洗脫流速應(yīng)選擇在1.0～2.0mL/min之間。

圖7　洗脫速率對回收率的影響Fig.7　Effect of different velocity of ethanol on recovery efficiency

2.1.8洗脫劑體積的考察從圖8中可以看出，洗脫液中總黃酮濃度隨洗脫液用量增大而升高，之后又隨之降低，大約在第15個組分時，黃酮的含量相對較少，因此3.5BV體積的洗脫液就可以基本將總黃酮洗脫干凈。

圖8　乙醇用量的考察Fig.8　Investigation on the amount of ethanol

2.2Box-Behnken實驗設(shè)計與結(jié)果

采用Design-expertv 8.0.5軟件進行實驗設(shè)計和結(jié)果分析，結(jié)果見表2。

表2　總黃酮解吸條件的優(yōu)化實驗設(shè)計及結(jié)果Table.2　Optimization of desorption conditions and results of experimental design

通過對實驗結(jié)果進行響應(yīng)面分析，經(jīng)過二次回歸擬合后，得出擬合方程式：

R1（%）=76.65-1.88X1-2.07X2+5.05X3+0.86X1X2-0.49X1X3-0.46X2X3-0.96X12-8.24X22-2.29X32

表3　方差分析表Table.3　ANOVA of regression analysis

表3中對回歸方程進行方差分析，可以看出模型的p＜0.001，證明實驗所選用的二次多項模型具有極顯著性，且失擬項的p＞0.05，表明失擬項不顯著；其校正系數(shù)R2=0.9584，表明模型充分?jǐn)M合實驗數(shù)據(jù)，因此可以用此模型來分析和預(yù)測純化黃酮的工藝[11]。在總的作用因素中，X3、X22、X32項的對響應(yīng)值Y影響是極顯著的（p＜0.01），X1、X2項的影響是顯著的（p＜0.05），而方程的交互項X1X2、X1X3、X2X3對Y影響不顯著（p＞0.05）。

2.3響應(yīng)面圖分析

結(jié)合Box-Behnken實驗設(shè)計方案，利用RSM研究各個因素之間對總黃酮回收率的影響，做出響應(yīng)面圖，以洗脫劑濃度、洗脫速率與洗脫劑用量的交互作用對總黃酮的回收率的影響，根據(jù)回歸方程得出不同因子的響應(yīng)面分析圖及相應(yīng)等值線圖結(jié)果見圖9。

圖9　兩因素交互作用對總黃酮得率的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.9　Response surface and contour plots for the effect of operating parameters on the recovery efficiency of total flavonoids

從響應(yīng)面分析圖上可較直觀地看出各因素交互作用對響應(yīng)值的影響。響應(yīng)面中，若響應(yīng)曲面很平滑，則交互作用對響應(yīng)值的影響不顯著，若曲面陡峭則交互作用影響顯著。等高線圖中，等高線的密度越大，表示條件的變化對響應(yīng)值的影響越顯著。等高線為橢圓形表示交互作用影響顯著，為圓形時影響則不顯著[12]，從圖9可知，三種因素的交互作用不顯著，表現(xiàn)為曲線平滑。

圖9（a）中，洗脫劑體積對響應(yīng)值影響顯著，表現(xiàn)為曲線較陡。由交互作用的等高線可知，沿洗脫體積軸向等高線密集，而速度軸向等高線相對稀疏，說明洗脫體積對響應(yīng)值峰值的影響比速度大。曲面中心值并不是曲面最大值，隨著洗脫體積的增大而增大，在4BV時達(dá)到最大值，說明此時為最優(yōu)的工藝。圖9（b）中，洗脫劑濃度對響應(yīng)值影響不顯著，表現(xiàn)為曲面平緩，濃度軸線等高線稀疏，濃度軸向曲線變化不大，曲面最大值對應(yīng)的洗脫劑濃度在零水平處，可判斷此時為最佳洗脫劑濃度。圖9（c）中響應(yīng)值隨洗脫速度呈現(xiàn)由低到高再降低的趨勢，即響應(yīng)值在零水平處具有極大值。

可推斷對響應(yīng)值的影響順序為：洗脫劑體積＞洗脫速度＞洗脫劑濃度，這基本和方差分析結(jié)果一致。可通過軟件對模型極值求解和分析等高線得到最佳洗脫條件：洗脫劑濃度70%，洗脫速率1.79mL/min，洗脫劑體積4BV。

2.4驗證實驗

為檢驗RSM分析法的可靠性，采用上述最優(yōu)提取條件進行黃酮的分離純化實驗，同時考慮到實際操作的便利，將洗脫的最佳條件修正為：洗脫速率1.80mL/min，洗脫劑濃度為70%，洗脫劑用量為4BV，理論上總黃酮回收率值可達(dá)81.19%，實際得到大孔樹脂解析玉米須黃酮類化合物的平均回收率為80.68%，與理論值較為穩(wěn)合，粗黃酮的純度由原來的4.15%提高到25.68%，提高了6.12倍，表明優(yōu)選工藝提取效果較為理想性。

3　結(jié)論

3.1AB-8大孔吸附樹脂用于玉米須黃酮的分離純化，除去了大量色素、多糖、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，省去了傳統(tǒng)溶劑萃取法的繁瑣工藝，僅吸附-洗脫一步工藝即得到高含量的玉米須總黃酮，且收效高、成本低、操作簡便，適于工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。

3.2在單因素的基礎(chǔ)上用響應(yīng)面法優(yōu)化玉米須粗黃酮的純化工藝，采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過回歸方程得到最優(yōu)工藝：上樣濃度2mg/mL，上樣速度為1mL/min，上樣量為55mL，吸附時間2h，洗脫劑乙醇濃度70%，乙醇體積4BV，洗脫速率為1.80mL/min，在最佳工藝條件下玉米須總黃酮回收率可達(dá)80.68%，本研究為工業(yè)純化玉米須黃酮提供了依據(jù)。但本實驗僅對解析過程進行了優(yōu)化，吸附過程的優(yōu)化還需進一步探索。

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Study on purification of total flavonoids of corn silk with the Box-behnken design

GUO Zhi-hong1，2，ZHOU Hong-li2，*，GUO Xiang-ming2
（1.College of Chemistry，Jilin University，Changchun 130012，China；2.College of Chemical and Pharmaceutical Engineering，Jilin Institute of Chemical Technology，Jilin 132022，China）

To optimize the purification of total flavonoids of corn silk，AB-8 macroporous resin was carried out by response surface methodology in this study.Total flavonoids elution rate of corn silk as the indexes，on the basis of single-factor experiments，Box-behnken design was used to explore the optimal conditions.The optimal refined conditions were as follows：55mL sample volume，the velocity of sample solution 1mL/min，2mg/mL sample concentration，adsorption time 2h，4BV of 70%ethanol，elution velocity 1.8mL/min.The recovery efficiency of total flavonoids was up to 80.68%.The purity of total flavonoids increased from 4.15%to 25.68%.Results indicated that the method was simple，convenient，easy to industrial production.

flavonoids of corn silk；AB-8 macroporous resin；Box-behnken design；recovery efficiency

TS201.1

B

1002-0306（2015）04-0260-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.048

2014－07－03

郭志紅（1987-），女，在讀碩士研究生，研究方向：有機分析化學(xué)。

周鴻立（1967-），女，博士，教授，研究方向：天然產(chǎn)物的研究與開發(fā)。

吉林省科技廳科研項目（20130303050NY）；吉林省教育廳2013第319號。