以線蟲為模型評(píng)價(jià)唾液乳桿菌延長(zhǎng)壽命及對(duì)相關(guān)生理活動(dòng)的影響

范金波，侯　宇，蔡茜彤，周素珍，馮敘橋

（渤海大學(xué)食品科學(xué)研究院遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧錦州121013）

以線蟲為模型評(píng)價(jià)唾液乳桿菌延長(zhǎng)壽命及對(duì)相關(guān)生理活動(dòng)的影響

范金波，侯宇，蔡茜彤，周素珍，馮敘橋

（渤海大學(xué)食品科學(xué)研究院遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧錦州121013）

利用秀麗隱桿線蟲，評(píng)價(jià)了三株唾液乳桿菌對(duì)線蟲壽命及生理功能的影響。結(jié)果表明唾液乳桿菌可以顯著延長(zhǎng)秀麗線蟲壽命，壽命延長(zhǎng)率為11.9%（p＜0.05），且延緩衰老作用不是由于唾液乳桿菌菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸桿菌OP50革蘭氏分類的差異，并且與菌株的生長(zhǎng)氧需求和對(duì)宿主的毒性無(wú)關(guān)。此外，飼喂唾液乳桿菌在延長(zhǎng)線蟲壽命的同時(shí)顯著影響線蟲的攝食及生長(zhǎng)情況，顯著提高線蟲的呼吸強(qiáng)度及體內(nèi)SOD活性（p＜0.05），表明唾液乳桿菌的抗衰老活性可能是通過(guò)能量限制效應(yīng)而達(dá)到的。研究結(jié)果為唾液乳桿菌抗衰老研究提供了新的證據(jù)，為抗衰老益生菌產(chǎn)品的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

唾液乳桿菌，秀麗隱桿線蟲，衰老，能量限制

衰老是機(jī)體組織器官功能隨年齡增長(zhǎng)而發(fā)生的退行性變化[1]，是機(jī)體各種生化反應(yīng)的綜合表現(xiàn)。越來(lái)越多的研究專注于尋找具有抗衰老作用的物質(zhì)。益生菌安全性高，分離純化成本低，如果能夠明確抗衰老功能，其作為抗衰老產(chǎn)品的前景將十分廣闊。已有國(guó)內(nèi)外的學(xué)者對(duì)益生菌這方面的功能開展研究，Kimoto-Nira等對(duì)SAMP6早衰小鼠進(jìn)行連續(xù)11個(gè)月飼喂Lactococcus lactis G50熱致死菌體，結(jié)果表明能夠改善衰老所致的體重降低[2]；Kaburagi等對(duì)C57BL6/n衰老小鼠飼喂Lactobacillus johnsonii La1 14d，結(jié)果表明能增強(qiáng)小鼠T細(xì)胞免疫功能[3]。綜上所述已有研究表明飼喂益生菌具有降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)氧化水平，增強(qiáng)免疫功能，延緩與衰老相關(guān)的生理表征等作用。然而目前益生菌抗衰老功能研究尚存在以下不足：研究多是利用老齡動(dòng)物，或是利用基因手段構(gòu)建的早衰動(dòng)物為模型，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不是處于正常的生理狀態(tài)下，而且也沒(méi)有進(jìn)行益生菌全程飼喂干預(yù)，缺少直接的壽命數(shù)據(jù)；因此，需要利用一種新型的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ烷_展研究。

秀麗隱桿線蟲，學(xué)名Caenorhabditis elegans，簡(jiǎn)稱C.elegans[4-5]。將線蟲應(yīng)用于益生菌抗衰老功能研究主要有以下幾方面優(yōu)勢(shì)：線蟲以細(xì)菌為食，適合進(jìn)行益生菌抗衰老功能研究；線蟲壽命短，平均壽命為20d左右，能夠進(jìn)行全程飼喂益生菌，得到直接的壽命數(shù)據(jù)。因此，針對(duì)唾液乳桿菌延長(zhǎng)壽命及調(diào)節(jié)生理功能尚不明確這一問(wèn)題，本研究以秀麗隱桿線蟲為模型，評(píng)價(jià)唾液乳桿菌對(duì)線蟲壽命的影響，同時(shí)評(píng)價(jià)了對(duì)線蟲相關(guān)生理活動(dòng)的影響，為唾液乳桿菌抗衰老功能提供新證據(jù)。

1　材料與方法

1.1確材料與儀器

瓊脂粉日本協(xié)和株式會(huì)社；Bacto Peptone細(xì)菌蛋白胨美國(guó)BD公司；5-FUdR 5-氟-2’-脫氧尿苷美國(guó)Sigma-Aldrich公司；SOD測(cè)定試劑盒南京建成生物技術(shù)公司；厭氧液體培養(yǎng)基（AB）、MRS培養(yǎng)基北京陸橋公司；秀麗隱桿線蟲蟲株野生型Caenorhabditis elegans N2，北京生命科學(xué)研究所惠贈(zèng)；菌種線蟲標(biāo)準(zhǔn)食物E.coli OP50，北京生命科學(xué)研究所惠贈(zèng)；實(shí)驗(yàn)菌株Lactobacillus salivarius subsp. salivarius FDB89、FDB86、FDB81由實(shí)驗(yàn)室自行分離（保藏號(hào)CGMCC 2263、3606），凍干后保存于-80℃；為了排除唾液乳桿菌與標(biāo)準(zhǔn)食物大腸桿菌革蘭氏分類及生長(zhǎng)氧需求的差異，用實(shí)驗(yàn)室保存的革蘭氏陽(yáng)性厭氧菌Clostridium perfringens C01（CLP）作為對(duì)照菌。

ZSA301體視顯微鏡重慶光學(xué)儀器廠；TL-16G臺(tái)式高速離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠；THZ-C電熱恒溫培養(yǎng)箱江蘇太倉(cāng)實(shí)驗(yàn)儀器廠；SCIENTZ-IID超聲波細(xì)胞破碎儀寧波新芝生物科技公司；DK-98-II2KW潔凈工作臺(tái)天津泰斯特儀器公司；UV-2102PC紫外可見分光光度計(jì)上海UNICO公司；Model-680酶標(biāo)儀美國(guó)BIO-RAD公司；ZDX35BI高壓蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1唾液乳桿菌對(duì)線蟲衰老影響首先對(duì)線蟲進(jìn)行同期化處理。向平板中加入2mL M9緩沖液（3g KH2PO4，15.12g Na2HPO4·12H2O，5g NaCl，加蒸餾水定容至1L，121℃滅菌15min，冷卻至室溫后無(wú)菌加入1mL 1mol/L MgSO4，混勻），用無(wú)菌吸管吹打，盡量沖下平板上的蟲體，將蟲體轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管，800×g離心1min，棄上清收集蟲體。加入1mL新鮮的線蟲裂解液（1mL 8mol/L NaOH，0.6mL 9%次氯酸鈉溶液，3.4mL無(wú)菌水，混勻），立刻漩渦振蕩10s，800×g離心1min，移液器吸走上清，重復(fù)2次，最后管內(nèi)剩余約100μL卵/M9懸濁液。使用無(wú)菌吸管將蟲卵滴加于涂布OP50的NGM平板，25℃培養(yǎng)，約12h之后于體視顯微鏡下可見大量L1期幼蟲活動(dòng)，證實(shí)同期化成功。

同期化48h后的線蟲，置于體視顯微鏡觀察，使用鉑金鏟挑取生殖口為透明半月形的L4期雌雄同體蟲于涂布不同受試菌的mNGM平板，每塊平板挑取10只，每個(gè)受試菌挑取6塊平板，平板置于25℃培養(yǎng)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)壽命實(shí)驗(yàn)。每天觀察線蟲生存狀況，如蟲體對(duì)鉑金鏟輕觸沒(méi)有活動(dòng)反應(yīng)則認(rèn)為蟲體死亡，將其挑除平板并進(jìn)行記錄死亡數(shù)目。排除失蹤、體內(nèi)孵化及非自然死亡線蟲。全部線蟲死亡則實(shí)驗(yàn)結(jié)束。壽命延長(zhǎng)率是相對(duì)對(duì)照組OP50組壽命而計(jì)算出的相對(duì)延長(zhǎng)率，具體計(jì)算方法如下：

壽命延長(zhǎng)率（%）=（實(shí)驗(yàn)組的線蟲壽命-OP50組線蟲壽命）/OP50組線蟲壽命×100

1.2.2唾液乳桿菌對(duì)線蟲生理活動(dòng)的影響線蟲蟲體大小的測(cè)定。使用鉑金鏟挑取同期化后L4期雌雄同體線蟲于涂布不同菌的mNGM平板，每板挑取1只，每種菌挑10塊平板，25℃培養(yǎng)。將挑蟲當(dāng)天記為0d，在0～6d每天將平板置于生物顯微鏡下，放大40倍，以數(shù)碼相機(jī)拍攝每條線蟲圖片，同時(shí)拍攝同等放大倍率下的標(biāo)尺用于定義單位長(zhǎng)度。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，使用Image J軟件，按照軟件說(shuō)明，分析圖片中線蟲輪廓，計(jì)算線蟲的投影面積，用以表示線蟲蟲體大小。

線蟲咽泵頻率的測(cè)定。使用鉑金鏟挑取同期化后L4期雌雄同體線蟲于涂布不同菌的mNGM平板，每板挑取1只，每種菌挑10塊板。25℃培養(yǎng)24h之后，將平板置于生物顯微鏡，放大100倍，使用數(shù)碼攝像機(jī)跟蹤拍攝每只線蟲1min內(nèi)的咽泵活動(dòng)情況短片，每只線蟲獨(dú)立拍攝3次。將短片導(dǎo)入電腦，使用視頻播放軟件以0.25×播放速率播放短片，記錄1min內(nèi)線蟲咽泵活動(dòng)次數(shù)，作為咽泵頻率。

1.2.3唾液乳桿菌對(duì)線蟲代謝活動(dòng)的影響線蟲呼吸作用強(qiáng)度的監(jiān)測(cè)（XTT法）。使用水溶性四氮唑鹽XTT（2，3-雙（2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基）-2H-四唑-5-甲酰胺內(nèi)鹽），按照Braeckman等[6]方法，監(jiān)測(cè)線蟲線粒體琥珀酸脫氫酶活性，以此評(píng)價(jià)飼喂不同菌株對(duì)線蟲呼吸作用強(qiáng)度的影響。在96孔酶標(biāo)板中依次加入95μL H2O、5μL線蟲裂解物、50μL NADH和NADPH混合溶液（濃度均為2mmol/L，溶解于0.1% NaHCO3溶液）、100μL 0.5mg/mL XTT溶液，置于微量振蕩器混勻后，保鮮膜覆蓋，置于25℃孵育1h，于酶標(biāo)儀測(cè)定490nm吸光值。根據(jù)XTT摩爾吸光系數(shù)[7]，計(jì)算蟲體裂解物中每毫克蛋白每小時(shí)XTT的摩爾還原能力，用以表征線蟲呼吸作用強(qiáng)度。從第0～8d，隔天測(cè)定1次，每樣品做3次平行。

線蟲體內(nèi)SOD活性測(cè)定。使用SOD試劑盒，按照說(shuō)明書測(cè)定線蟲裂解物SOD活性，結(jié)果表示為每毫克蛋白SOD活力單位。從第0～8d，隔天測(cè)定1次，每樣品做3次平行。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 16.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用ANOVA結(jié)合Duncan’s Test比較分析飼喂不同菌線蟲較咽泵頻率的差異；比較各時(shí)間點(diǎn)線蟲蟲體大小、呼吸作用強(qiáng)度、SOD活性的差異，p＜0.05認(rèn)為具有顯著性差異。

2　結(jié)果與分析

2.1唾液乳桿菌對(duì)線蟲衰老影響

標(biāo)準(zhǔn)壽命實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，飼喂不同菌株菌體對(duì)線蟲壽命的影響不同。如圖1和表1所示。飼喂唾液乳桿菌FDB89可以顯著延長(zhǎng)線蟲壽命，壽命延長(zhǎng)率為11.9%；飼喂FDB81對(duì)線蟲壽命有一定的延長(zhǎng)作用，但是與線蟲標(biāo)準(zhǔn)食物OP50相比差異不顯著；飼喂FDB86使線蟲壽命明顯縮短。這一結(jié)果與Ikeda等的報(bào)道相似[8]，在其研究中報(bào)道了3株乳桿菌及2株長(zhǎng)雙歧桿菌菌株均可以延緩線蟲衰老，且菌株之間壽命延長(zhǎng)率有差異，其壽命延長(zhǎng)率在17%～33%之間。

已有研究表明，線蟲標(biāo)準(zhǔn)食物的OP50對(duì)線蟲有輕微毒性，尤其在線蟲處于老齡階段時(shí)，免疫系統(tǒng)功能下降，OP50菌體在線蟲體內(nèi)繁殖會(huì)加速線蟲衰老死亡過(guò)程，將OP50熱致死處理之后，菌株及毒性產(chǎn)物失活，線蟲壽命會(huì)顯著延長(zhǎng)[8]。本研究中所用唾液乳桿菌FDB89及OP50均經(jīng)熱滅活處理，唾液乳桿菌FDB89在此條件下仍可以顯著延長(zhǎng)線蟲壽命，證實(shí)其延壽作用與其對(duì)宿主低毒力無(wú)關(guān)。研究中設(shè)置的另一個(gè)對(duì)照菌株梭狀芽胞桿菌CLP是革蘭氏陽(yáng)性厭氧菌，然而飼喂該菌的線蟲并沒(méi)有表現(xiàn)出延壽表型，證實(shí)唾液乳桿菌FDB89的延壽作用與菌株革蘭氏分類及生長(zhǎng)氧需求情況無(wú)關(guān)。

圖1　飼喂不同菌株的線蟲生長(zhǎng)曲線Fig.1　Survival curve of C.elegans fed by different bacteria

表1　飼喂不同菌株線蟲平均壽命Table.1　The mean lifespan of C.elegans fed by different bacteria

2.2唾液乳桿菌對(duì)線蟲生理活動(dòng)的影響

2.2.1唾液乳桿菌對(duì)線蟲生長(zhǎng)情況的影響從成蟲第0d開始，連續(xù)監(jiān)測(cè)線蟲蟲體大小，用以評(píng)價(jià)唾液乳桿菌對(duì)線蟲生長(zhǎng)情況的影響。如圖2所示，在實(shí)驗(yàn)第0～6d間，線蟲蟲體逐漸長(zhǎng)大。通過(guò)比較不同時(shí)間點(diǎn)蟲體大小結(jié)果，證實(shí)飼喂FDB81、FDB86、FDB89的線蟲在所有時(shí)間點(diǎn)蟲體大小與OP50比較均顯著降低（p＜0.05），表明飼喂FDB81、FDB86、FDB89影響了線蟲生長(zhǎng)，飼喂對(duì)照菌株CLP不影響線蟲生長(zhǎng)。

2.2.2唾液乳桿菌對(duì)線蟲攝食活動(dòng)的影響通過(guò)記錄線蟲咽泵頻率，評(píng)價(jià)飼喂唾液乳桿菌對(duì)線蟲攝食活動(dòng)的影響。如圖3所示，飼喂不同菌株線蟲的咽泵頻率皆在200次/min左右，與文獻(xiàn)報(bào)道正常線蟲頻率吻合[9-10]。方差分析表明飼喂FDB89、FDB81、FDB86都顯著降低線蟲咽泵頻率（p＜0.05），飼喂CLP對(duì)線蟲咽泵頻率影響不顯著。此結(jié)果一方面說(shuō)明，線蟲對(duì)本研究中不同菌株攝入存在偏好，攝入量存在差異；另一方面，唾液乳桿菌攝入速率與OP50有顯著差異證實(shí)唾液乳桿菌飼喂線蟲可能存在攝食限制情況。

圖2　飼喂不同菌株線蟲蟲體大小變化Fig.2　Changes of body size of C.elegans fed by different bacteria

能量限制（CR）是一種有效延緩生物體衰老的方法，其延壽效應(yīng)在酵母、線蟲、果蠅直到高等的嚙齒類、靈長(zhǎng)類動(dòng)物都有直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)證明[11]。能量限制在延緩動(dòng)物衰老、延長(zhǎng)壽命的同時(shí)，一般會(huì)造成生長(zhǎng)停滯、動(dòng)物體重降低、生殖能力下降等效應(yīng)[12-13]。目前認(rèn)為產(chǎn)生能量限制效應(yīng)有兩種產(chǎn)生方式：減少能量攝入和攝入CR模擬物。減少能量攝入可以在不產(chǎn)生嚴(yán)重饑餓的情況下，通過(guò)降低動(dòng)物食物攝入量（一般降為正常攝入量的60%～80%）或降低攝入食物總能量水平實(shí)現(xiàn)。而CR模擬物是一類不需要限制能量攝入即可激活體內(nèi)CR相關(guān)響應(yīng)靶點(diǎn)，使機(jī)體出現(xiàn)能量限制延壽表型的物質(zhì)。本研究證實(shí)飼喂唾液乳桿菌的線蟲咽泵頻率明顯減低，蟲體生長(zhǎng)緩慢，我們推斷，唾液乳桿菌可能通過(guò)能量限制延緩線蟲的衰老。

圖3　飼喂不同菌株線蟲的咽泵頻率Fig.3　Pharyngeal pumping rate of C.elegans fed by different bacteria

2.3唾液乳桿菌對(duì)線蟲代謝活動(dòng)的影響

2.3.1唾液乳桿菌對(duì)線蟲呼吸作用強(qiáng)度的影響從第0d開始，連續(xù)監(jiān)測(cè)線蟲XTT還原能力，用以評(píng)價(jià)唾液乳桿菌對(duì)線蟲呼吸作用的影響。如圖4所示，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，線蟲逐漸衰老，其體內(nèi)呼吸作用強(qiáng)度呈逐漸下降趨勢(shì)。飼喂不同菌株對(duì)線蟲呼吸作用強(qiáng)度有顯著影響，在成蟲第2、4d，與對(duì)照組相比，飼喂不同菌株均顯著提高線蟲呼吸強(qiáng)度（p＜0.05），但之后各組之間無(wú)顯著差異。表明不同菌株會(huì)影響線蟲體內(nèi)能量代謝水平，且不同菌株不同時(shí)間的效應(yīng)不同。

2.3.2唾液乳桿菌對(duì)線蟲體內(nèi)SOD活性的影響如圖5所示，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，線蟲體內(nèi)SOD活性呈逐漸上升趨勢(shì)。與OP50相比，飼喂4種菌株均顯著提高了線蟲體內(nèi)SOD活性（p＜0.05）。表明唾液乳桿菌可以提高線蟲體內(nèi)的抗氧化能力，激活線蟲體內(nèi)防御體系，高活性的SOD清除體內(nèi)的活性氧自由基，保護(hù)大分子不受損傷，從而延長(zhǎng)線蟲壽命。

圖4　飼喂不同菌株線蟲XTT還原能力的變化Fig.4　Changes of XTT reduction of C.elegans fed by different bacteria

圖5　飼喂不同菌株線蟲體內(nèi)SOD活性的變化Fig.5　Changes of SOD of C.elegans fed by different bacteria

3　結(jié)論

以秀麗隱桿線蟲為模型，在評(píng)價(jià)唾液乳桿菌對(duì)線蟲壽命影響的同時(shí)，首次研究了其對(duì)線蟲生長(zhǎng)、攝食、呼吸作用、體內(nèi)關(guān)鍵抗氧化酶活性等正常生理活動(dòng)的影響。結(jié)果表明，唾液乳桿菌具有延壽作用且FDB89延壽作用顯著強(qiáng)于FDB81、FDB86。同時(shí)，唾液乳桿菌能顯著影響線蟲正常生理功能，提高線蟲呼吸作用強(qiáng)度及體內(nèi)關(guān)鍵抗氧化酶SOD活性，證實(shí)了其延壽作用與菌株的革蘭氏分類、生長(zhǎng)氧需求及對(duì)宿主毒性無(wú)關(guān)，可能是通過(guò)能量限制延緩線蟲的衰老。這一結(jié)果為唾液乳桿菌抗衰老功能提供新的證據(jù)，為研究其抗衰老機(jī)制奠定了重要基礎(chǔ)。

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Extending life span effects of Lactobacillus saliva in Caenorhabditis elegans

FAN Jin-bo，HOU Yu，CAI Xi-tong，ZHOU Su-zhen，F(xiàn)ENG Xu-qiao
（Food Science Research Institute of Bohai University，F(xiàn)ood Safety Key Lab of Liaoning Province，Jinzhou 121013，China）

In this study，we studied anti-aging effects of Lactobacillus salivarius using C.elegans as model，and the anti-aging mechanism of Lactobacillus salivarius was also clarified.The results showed that feeding Lactobacillus salivarius significantly extended the mean life span of C.elegans by up to 11.9%（p＜0.05），compared to that of control nematodes.The reduced pharyngeal pumping rate，growth，and increased superoxide dismutase（SOD）activity and XTT reduction capacity were also observed in Lactobacillus salivarius feeding worms（p＜0.05），indicating that anti-aging activity of Lactobacillus salivarius may be associated with energy restriction.Our study provided the direct evidence for the anti-aging function of Lactobacillus salivarius，and formed the foundation for developing the anti-aging probiotics.

Lactobacillus salivarius；Caenorhabditis elegans；aging；caloric restriction

TS255.1

A

1002-0306（2015）04-0136-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.020

2014－05－23

范金波（1977-），男，博士，講師，主要從事食品生物化學(xué)方面的研究。