海洋骨膠原低聚肽鈣配合物的穩(wěn)定性

劉文穎，谷瑞增，林　峰，魯　軍，蔡木易

（中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心，北京100015）

海洋骨膠原低聚肽鈣配合物的穩(wěn)定性

劉文穎，谷瑞增，林峰，魯軍*，蔡木易*

（中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心，北京100015）

以三文魚骨為原料制備海洋骨膠原低聚肽鈣配合物，以分子量分布和鈣含量為指標(biāo)，研究了熱處理、pH和體外胃腸道模擬消化對海洋骨膠原低聚肽鈣配合物穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明：海洋骨膠原低聚肽鈣配合物具有較好的熱穩(wěn)定性，各個分子量區(qū)間的比例變化不超過2%，配合物的鈣含量無顯著性差異；海洋骨膠原低聚肽鈣配合物在酸性和堿性條件下，分子量小于1000u的總含量略有升高，但升高不到8%，鈣含量有所降低，但在廣泛的pH范圍內(nèi)仍然有65%以上的鈣含量；海洋骨膠原低聚肽鈣配合物經(jīng)過蛋白酶消化后，分子量小于1000u的總含量略有升高，但升高不到6%，經(jīng)過胃蛋白酶消化和胰蛋白酶共同消化后，仍然有40.5%的鈣含量。這說明海洋骨膠原低聚肽鈣配合物具有一定的熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性以及消化穩(wěn)定性，是一種具有潛力的肽鈣補(bǔ)充劑產(chǎn)品。

海洋骨膠原低聚肽，肽鈣配合物，熱處理，pH，消化模式，穩(wěn)定性

海洋骨膠原低聚肽是以三文魚骨為原料，通過酶解、分離、純化、噴霧干燥等制成的寡肽混合物。魚骨中90%的蛋白質(zhì)為膠原、骨膠原及軟骨素，然而作為水產(chǎn)品加工中的副產(chǎn)物，三文魚骨主要用于生產(chǎn)魚粉、直接作飼料和肥料或丟棄，造成很大的資源浪費。通過生物酶解法制得骨膠原低聚肽，可以回收利用魚骨中的膠原蛋白[1-2]，并且具有溶解性好，無副作用，安全性高等優(yōu)點[3-4]，鈣是人體必需的常量元素，對維持人體骨骼、呼吸、神經(jīng)、免疫等系統(tǒng)正常的生理功能具有重要的作用。人類缺鈣是全球性的營養(yǎng)問題，高效補(bǔ)鈣制劑的研發(fā)成為當(dāng)今社會急需解決的問題[5]。

小肽能與鈣離子形成配合物，完整地被轉(zhuǎn)運吸收，需要時又能有效地將鈣離子釋放出來。與其他補(bǔ)鈣劑相比，吸收速度快，補(bǔ)鈣效果好[6]。通過將肽鈣配合物加工成補(bǔ)鈣產(chǎn)品，能夠有效解決人體對鈣的需求問題。但海洋骨膠原低聚肽鈣配合物作為食品原料，加工條件是否影響其穩(wěn)定性目前尚不明確。因此，本文以三文魚骨為原料制備海洋骨膠原低聚肽鈣配合物，以分子量分布和鈣含量為指標(biāo)，研究溫度、pH和蛋白酶消化對海洋骨膠原低聚肽鈣配合物穩(wěn)定性的影響，以期為其在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

三文魚骨北京中食海氏生物技術(shù)有限公司提供；無水氯化鈣、無水乙醇、氨水、氯化銨、鉻黑T、硫酸鎂、三乙醇胺、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）、鹽酸、氫氧化鈉北京化學(xué)試劑公司，分析純；堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶諾維信生物技術(shù)有限公司；乙腈美國Fisher公司，色譜純；三氟乙酸英國Alfa Aesar公司，分析純。

HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋普瑞斯機(jī)械有限公司；YG30型噴霧干燥機(jī)無錫市陽光干燥設(shè)備廠；SHZ-3循環(huán)水多用真空泵鄭州朋來儀器有限公司；FE20K型pH計瑞士梅特勒-托利多公司；LC-20AD型高效液相色譜儀、凝膠色譜柱（TSKgel G2000SWXL 300mm×7.8mm） 日本島津公司。

1.2實驗方法

1.2.1海洋骨膠原低聚肽鈣配合物的制備將三文魚骨用粉碎機(jī)粉成魚骨粉，稱取60g溶于1000mL蒸餾水中，90℃處理10min，降溫至50℃，調(diào)節(jié)蛋白溶液的pH至8.5，以每克蛋白質(zhì)2000單位的酶量加入堿性蛋白酶，酶解3h，然后pH為7，溫度調(diào)至60℃，以每克蛋白質(zhì)3000單位的酶量加入木瓜蛋白酶，酶解2h。酶解結(jié)束后，100℃滅酶10min。冷卻后，10000×g離心30min，取上清液。用截留分子量為1000u的超濾膜超濾，得到分子量小于1000u的濾過液，利用噴霧干燥器進(jìn)行噴霧干燥，得到海洋骨膠原低聚肽干粉。

稱取3g海洋骨膠原低聚肽和1g無水氯化鈣，置入500mL錐形瓶中，加入100mL蒸餾水使其全部溶解，在50℃下水浴反應(yīng)60min，冷卻至室溫。調(diào)節(jié)pH為5，之后加入4倍體積的乙醇，室溫放置1h。抽濾收集沉淀，干燥后制得海洋膠原低聚肽鈣配合物樣品，置于干燥器中保存[7]。

1.2.2熱穩(wěn)定性實驗將樣品配制成濃度為2mg/mL的溶液，分裝至50mL離心管中，置于水浴鍋中，分別在20、40、60、80℃下水浴，2h后冷卻至室溫，分別檢測其分子量分布和鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)[8-9]。

1.2.3酸堿穩(wěn)定性實驗將樣品配制成濃度為2mg/mL的溶液，分裝至50mL離心管中，分別用1mol/L HCl和1mol/L NaOH調(diào)節(jié)各管pH為3、5、7、9，在37℃的水浴鍋中放置2h，冷卻至室溫后分別檢測其分子量分布和鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)[8-9]。

1.2.4體外模擬胃腸道消化實驗

1.2.4.1胃蛋白酶消化實驗將樣品配制成濃度為2mg/mL的溶液，將40mL溶液置于50mL離心管中，用1mol/L HCl調(diào)節(jié)pH為2，在37℃的水浴鍋中預(yù)熱片刻，加入3%（E/S）胃蛋白酶，混勻后迅速取出樣品20mL于另外1支50mL離心管，沸水中滅酶活10min，以此作為樣品消化前對照。取出后，將剩余20mL樣品置于37℃水浴鍋中消化3h，沸水中滅酶活10min，冷卻至室溫后分別檢測消化前后的樣品的分子量分布和鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)[8-9]。

1.2.4.2胰蛋白酶消化實驗將樣品配制成濃度為2mg/mL的溶液，將40mL溶液置于50mL離心管中，用1mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH為6.8，在37℃的水浴鍋中預(yù)熱片刻，加入3%（E/S）胰蛋白酶，混勻后迅速取出樣品20mL于另外1支50mL離心管，沸水中滅酶活10min，以此作為樣品消化前對照。取出后，將剩余20mL樣品置于37℃水浴鍋中消化3h，沸水中滅酶活10min，冷卻至室溫后分別檢測消化前后的樣品的分子量分布和鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)[8-9]。

1.2.4.3胃蛋白酶消化后再胰蛋白酶消化實驗按照1.2.4.1的方法進(jìn)行胃蛋白酶消化后，用1mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH為6.8，在37℃的水浴鍋中預(yù)熱片刻，加入3%（E/S）胰蛋白酶，混勻后迅速取出樣品20mL于另外1支50mL離心管，沸水中滅酶活10min，以此作為樣品消化前對照。取出后，將剩余20mL樣品置于37℃水浴鍋中消化3h于沸水中滅酶活10min，冷卻至室溫后分別檢測消化前后的樣品的分子量分布和鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)[8-9]。

1.2.5肽鈣配合物的分子量分布測定將樣品經(jīng)孔徑0.2μm聚四氟乙烯過濾膜過濾后，用高效液相色譜儀進(jìn)行凝膠過濾。流動相：乙腈∶水∶三氟乙酸，45∶55∶0.1（v/v/v）；檢測波長：220nm；進(jìn)樣體積：10μL；流速：0.5mL/min；柱溫：30℃，利用紫外檢測器檢測，使用GPC軟件處理數(shù)據(jù)。乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（分子量189u）、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（分子量451u）、桿菌酶（分子量1450u）、細(xì)胞色素C（分子量12500u）作為肽標(biāo)準(zhǔn)品，配制成0.1%（M/V）溶液，過膜后進(jìn)樣，制作相對分子質(zhì)量校正曲線[10]。

1.2.6肽鈣配合物中鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定取5mL經(jīng)過不同溫度、pH和消化方式處理后的肽鈣配合物，轉(zhuǎn)移至透析袋（分子量8000～14000u）中透析48h后，采用EDTA絡(luò)合滴定法測定肽鈣配合物的鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)[7]。將15mL氨-氯化銨緩沖液（pH11）置于100mL錐形瓶中，加入2滴鉻黑T指示劑和2滴硫酸鎂溶液，搖勻后溶液呈酒紅色，然后用0.05mol/L EDTA-2Na滴定，直到溶液呈藍(lán)色為止。將透析后的透析液溶解于20mL蒸餾水中，移入到100mL錐形瓶中，再加入5滴三乙醇胺，之后將滴定呈藍(lán)色的緩沖液倒入樣品溶液中，用EDTA-2Na滴定至樣品溶液由酒紅色變?yōu)樗{(lán)色。每毫升EDTA-2Na滴定液相當(dāng)于2.0039mg鈣。肽鈣配合物中鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)的計算公式為：

肽鈣配合物中鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）=m1/m0×100

式中，m1：肽鈣配合物中鈣的質(zhì)量，mg；m0：肽鈣配合物的質(zhì)量，mg。

1.2.7統(tǒng)計學(xué)處理實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理，組間比較采用t檢驗，若p＜0.05，兩者有顯著性差異。

2　結(jié)果與討論

2.1相對分子質(zhì)量校正曲線及方程

由4種已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)品配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液后進(jìn)樣，通過凝膠滲透色譜圖得出4種標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間，以相對分子質(zhì)量的對數(shù)（lgMW）對保留時間（t）作圖得到相對分子質(zhì)量校正曲線（見圖1）。其方程為：lgMW=6.7895-0.1984t，R2=0.9982。再將經(jīng)過不同方式處理后的肽鈣配合物樣品進(jìn)樣以后，用液相數(shù)據(jù)處理軟件（GPC軟件）將樣品的凝膠色譜數(shù)據(jù)代入校正曲線方程中進(jìn)行計算，即可得到樣品的分子量及其分布范圍。

圖1　相對分子質(zhì)量校正曲線圖Fig.1　Molecular weight calibration curve

2.2海洋骨膠原低聚肽鈣配合物的熱穩(wěn)定性

海洋骨膠原低聚肽鈣配合物經(jīng)過不同的溫度處理后，其分子量分布凝膠色譜圖如圖2所示，利用GPC軟件處理后，分子量分布數(shù)據(jù)如表1所示。由圖2和表1可知，海洋骨膠原低聚肽鈣配合物分別在20、40、60、80℃水浴2h之后，分子量分布凝膠色譜圖基本沒有變化。各個分子量區(qū)間的比例變化不超過2%，分子量小于1000u的總含量均在72%左右。

圖2　不同溫度下海洋骨膠原低聚肽鈣配合物的分子量分布凝膠色譜圖Fig.2　Gel chromatogram of molecular weight distribution of MBCP-Ca treated by different temperatures

表1　不同溫度下海洋骨膠原低聚肽鈣配合物的分子量分布Table.1　Molecular weight distribution of MBCP-Ca treated by different temperatures

不同溫度處理后，用透析的方法測定海洋骨膠原低聚肽鈣配合物的鈣含量，結(jié)果如圖3所示。與對照相比，海洋骨膠原低聚肽鈣配合物的鈣含量無顯著性差異（p＞0.05），表明海洋骨膠原低聚肽鈣配合物具有較好的熱穩(wěn)定性，在加工過程中，溫度的變化對海洋骨膠原低聚肽鈣配合物的影響很小。包小蘭[9]對大豆肽鈣復(fù)合物在不同溫度條件下的熱穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，與本研究結(jié)果一致，大豆肽鈣復(fù)合物對高溫加熱具有較好的穩(wěn)定性。

2.3海洋骨膠原低聚肽鈣配合物的酸堿穩(wěn)定性

海洋骨膠原低聚肽鈣配合物經(jīng)過不同的pH處理后，其分子量分布凝膠色譜圖如圖4所示，利用GPC軟件處理后，分子量分布數(shù)據(jù)如表2所示。由圖4可知，海洋骨膠原低聚肽鈣配合物在pH分別為3、5、7、9的條件下水浴2h之后，分子量分布凝膠色譜圖變化不大。由表2可見，海洋骨膠原低聚肽鈣配合物在pH7的條件下，分子量小于1000u的總含量為71.82%，在酸性條件和堿性條件下，分子量小于1000u的總含量略有升高，有可能是肽與鈣形成的大分子環(huán)裝結(jié)構(gòu)在強(qiáng)酸或強(qiáng)堿的作用下斷裂，形成小分子的結(jié)構(gòu)。但分子量小于1000u的總含量升高不到8%，這表明海洋骨膠原低聚肽鈣配合物在廣泛的pH范圍內(nèi)具有一定的穩(wěn)定性。

圖3　不同溫度下海洋骨膠原低聚肽鈣配合物的鈣含量Fig.3　Calcium content of MBCP-Ca treated by different temperatures

圖4　不同pH下海洋骨膠原低聚肽鈣配合物的分子量分布凝膠色譜圖Fig.4　Gel chromatogram of molecular weight distribution of MBCP-Ca treated by different pH values

表2　不同pH下海洋骨膠原低聚肽鈣配合物的分子量分布Table.2　Molecular weight distribution of MBCP-Ca treated by different pH values

不同pH處理后，用透析的方法測定海洋骨膠原低聚肽鈣配合物的鈣含量，結(jié)果如圖5所示。與對照相比，海洋骨膠原低聚肽鈣配合物的鈣含量均降低，其中在pH3、5、9條件下，其鈣含量變化有顯著性差異（p＜0.05），降低了18.7%～34.4%。在pH7條件下，鈣含量降低了11.7%，表明海洋骨膠原低聚肽鈣配合物在中性條件下，鈣含量降低較少，而在強(qiáng)酸強(qiáng)堿條件下，鈣含量降低較多。從圖5可以看出，海洋骨膠原低聚肽鈣配合物在廣泛的pH范圍內(nèi)仍然有65%以上的鈣含量，這表明海洋骨膠原低聚肽鈣配合物中肽與鈣的結(jié)合具有一定的穩(wěn)定性。這可能由于海洋骨膠原低聚肽僅具有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的一級結(jié)構(gòu)，與高級結(jié)構(gòu)相比比較穩(wěn)定，因此對溫度、酸堿作用的耐受能力強(qiáng)一些[9]。

圖5　不同pH下海洋骨膠原低聚肽鈣配合物的鈣含量Fig.5　Calcium content of MBCP-Ca treated by different pH values

2.4海洋骨膠原低聚肽鈣配合物的體外消化穩(wěn)定性

海洋骨膠原低聚肽鈣配合物分別經(jīng)胃蛋白酶、胰蛋白酶、先胃蛋白酶后胰蛋白酶消化后，其分子量分布凝膠色譜圖如圖6所示，利用GPC軟件處理后，分子量分布數(shù)據(jù)如表3所示。由圖6和表3可知，經(jīng)過不同的消化模式，海洋骨膠原低聚肽鈣配合物分子量分布凝膠色譜圖變化不大。經(jīng)過蛋白酶消化后，海洋骨膠原低聚肽鈣配合物的組分中分子量小于1000u的總含量略有升高，但升高不到6%，分子量小于1000u的總含量在72%～79%之間。與未消化對照組相比，經(jīng)過消化后，大于1000u和500～1000u的組分所占比例略有降低，140～500u和小于140u的組分所占比例略有升高。這表明分子量相對較大的肽段經(jīng)過消化后分解成小分子量的肽段或氨基酸。包小蘭[9]考察了大豆肽鈣復(fù)合物的消化穩(wěn)定性，結(jié)果與本文一致，經(jīng)過胃蛋白酶和胰蛋白酶消化作用后，大豆肽鈣復(fù)合物中大分子量組分含量減少，小分子量組分含量增加，但變化不明顯，對消化酶的降解具有一定的抗性。

圖6　不同消化方式下海洋骨膠原低聚肽鈣配合物的分子量分布凝膠色譜圖Fig.6　Gel chromatogram of molecular weight distribution of MBCP-Ca treated by different digestion modes

表3　不同消化方式下海洋骨膠原低聚肽鈣配合物的分子量分布Table.3　Molecular weight distribution of MBCP-Ca treated by different digestion modes

圖7　不同消化方式下海洋骨膠原低聚肽鈣配合物的鈣含量Fig.7　Calcium content of MBCP-Ca treated by different digestion modes

不同消化方式處理后，用透析的方法測定海洋骨膠原低聚肽鈣配合物的鈣含量，結(jié)果如圖7所示。與對照相比，海洋骨膠原低聚肽鈣配合物在胃蛋白酶、胰蛋白酶分別消化作用3h后，鈣含量分別為58.7%、53.4%，先經(jīng)過胃蛋白酶消化再經(jīng)過胰蛋白酶消化后，海洋骨膠原低聚肽鈣配合物仍然有40.5%的鈣含量。這說明海洋骨膠原低聚肽鈣配合物對消化酶的降解具有一定的耐受性。本實驗?zāi)M人體胃腸消化情況，表明海洋骨膠原低聚肽鈣配合物具有一定的耐受胃腸道中胃蛋白酶和胰蛋白酶的作用。聶瑞艷等[11]對羅非魚魚鱗肽鈣復(fù)合物進(jìn)行了抗消化實驗，結(jié)果表明肽鈣復(fù)合物經(jīng)過胃蛋白酶、胰蛋白酶共同作用后，鈣結(jié)合量降低32%，證明其具有一定的抗消化性。

海洋骨膠原低聚肽的結(jié)構(gòu)是影響海洋骨膠原低聚肽鈣配合物中鈣含量的重要因素。從消化穩(wěn)定性實驗結(jié)果可以看出，海洋骨膠原低聚肽鈣配合物的組分中分子量小于1000u的總含量增加不到6%，但其鈣含量降低了59.5%，分子量較小的變化導(dǎo)致鈣含量較大的變化。海洋骨膠原低聚肽鈣配合物的酸堿穩(wěn)定性實驗結(jié)果中也表明了這一點。

3　結(jié)論

以三文魚骨為原料制備出海洋骨膠原低聚肽鈣配合物，通過溫度、pH和體外模擬胃腸道消化實驗，對海洋骨膠原低聚肽鈣配合物的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，海洋骨膠原低聚肽鈣配合物具有較好的熱穩(wěn)定性，各個分子量區(qū)間的比例變化不超過2%，配合物的鈣含量無顯著性差異；海洋骨膠原低聚肽鈣配合物在酸性和堿性條件下，分子量小于1000u的總含量略有升高，但總含量升高不到8%，鈣含量有所降低，但在廣泛的pH范圍內(nèi)仍然有65%以上的鈣含量；海洋骨膠原低聚肽鈣配合物經(jīng)過蛋白酶消化后，分子量小于1000u的總含量略有升高，但升高不到6%，先經(jīng)過胃蛋白酶消化再經(jīng)過胰蛋白酶消化后，海洋骨膠原低聚肽鈣配合物仍然有40.5%的鈣含量。這說明海洋骨膠原低聚肽鈣配合物具有一定的熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性以及消化穩(wěn)定性，是一種具有潛力的肽鈣補(bǔ)充劑產(chǎn)品。

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Stability of calcium-chelating marine bone collagen oligopeptides

LIU Wen-ying，GU Rui-zeng，LIN Feng，LU Jun*，CAI Mu-yi*
（Beijing Engineering Research Center of Protein and Functional Peptides，China National Research Institute of Food and Fermentation Industries，Beijing 100015，China）

Calcium-chelating marine bone collagen oligopeptides（MBCP-Ca）were prepared by using salmon bone as raw material.Taking molecular weight distribution and calcium content as indicators，the effects of temperature，pH and in vitro simulated gastrointestinal digestion on the stability of MBCP-Ca were investigated. Results showed that：MBCP-Ca had good thermal stability.The change of the molecular weight distribution ranges did not exceed 2%and the calcium content of MBCP-Ca showed no significant difference.In the acidic and alkaline conditions，the molecular weights below 1000u of MBCP-Ca were slightly elevated，but the content did not exceed 8%.The calcium content of MBCP-Ca decreased，but was still higher than 65%.After digested by proteases，the molecular weights below 1000u of MBCP-Ca were slightly elevated，but the content did not exceed 6%.After digested by pepsin and trypsin together，the calcium content of MBCP-Ca were 40.5%.The results indicated that MBCP-Ca had good thermal stability，pH stability and digestion stability and it was a peptide-calcium supplement product with promise.

marine bone collagen oligopeptides；calcium-chelating peptides；heat treatment；pH；digestion mode；stability

TS201.1

A

1002-0306（2015）04-0111-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.015

2014－07－01

劉文穎（1984-），女，碩士研究生，工程師，研究方向：食源性低聚肽研究。

蔡木易（1962-），男，本科，教授級高工，研究方向：功能肽研究與產(chǎn)業(yè)化。

魯軍（1973-），男，博士，高級工程師，研究方向：食品營養(yǎng)與生物技術(shù)。

國家十二五科技支撐項目（2012BAD33B04-02）；國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）項目（2013AA102205-02）；北京市科委農(nóng)村中心國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技城成果惠民科技示范工程項目（Z131100003113010）；科技北京百名領(lǐng)軍人才培養(yǎng)工程項目（Z131110000513026）。