石墨烯作為新型固相萃取填料結(jié)合UPLC-MS/MS測定黑魚中13種磺胺類藥殘

鄭婷璐，戴志遠，方旭波，陳小娥

（1.浙江海洋學(xué)院食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江舟山316022；2.浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江杭州310035）

石墨烯作為新型固相萃取填料結(jié)合UPLC-MS/MS測定黑魚中13種磺胺類藥殘

鄭婷璐1，戴志遠2，方旭波1，陳小娥1

（1.浙江海洋學(xué)院食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江舟山316022；2.浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江杭州310035）

建立了以石墨烯為固相萃取填料，結(jié)合高效液相色譜-電噴霧離子阱質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定黑魚中磺胺類獸藥殘留的檢測方法。采用甲醇作為提取溶劑，經(jīng)石墨烯固相萃取柱凈化富集，質(zhì)譜采用電噴霧正離子源，多反應(yīng)監(jiān)測模式。方法的線性良好，相關(guān)系數(shù)大于0.998，檢出限范圍0.048～0.288μg/kg，定量限為0.160～0.960μg/kg，線性范圍內(nèi)的加標(biāo)回收率為70.6%～93.8%。本方法靈敏、可靠、穩(wěn)定，滿足復(fù)雜水產(chǎn)品基質(zhì)中磺胺類藥殘檢測的需要。

石墨烯，黑魚，磺胺類藥殘，固相萃取，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用

磺胺類藥物是具有對氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的一類藥物的總稱，它具有效價高、抗菌譜廣、性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點。但是由于不合理的使用會容易引起其耐藥菌的增加，而且動物性食品中殘留的磺胺也會對人體健康造成潛在危害。為了保證食品安全，歐盟對食品中的磺胺類獸藥制定了最高允許量，單個磺胺類藥物的濃度不得超過25μg/kg，磺胺類獸藥總量不得超過100μg/kg[1]。因此，建立一種快速有效的磺胺檢測方法非常重要。

在殘留分析中，固相萃取由于其回收高、萃取時間短、溶劑用量少等特點成為一種有著廣泛應(yīng)用前景的前處理技術(shù)。然而，常用的固相萃取吸附劑，如C18、硅膠等往往只適用于數(shù)量有限的樣品。因此，開發(fā)一種新型的固相萃取吸附劑具有較高價值。

石墨烯是近年來發(fā)現(xiàn)的一種二維碳原子晶體[2-3]，是已知最薄的材料之一。研究發(fā)現(xiàn)石墨烯在機械性能、導(dǎo)電能力、熱力學(xué)等性質(zhì)上均能表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景[4-6]。除此之外，石墨烯具有巨大的比表面積和二維平面結(jié)構(gòu)[7]，為吸附提供了可能，因此石墨烯作為一種吸附劑成為近幾年的研究熱點。其中已經(jīng)有研究成功利用石墨烯作為分散劑[8]、固相微萃取填料[9-10]和固相萃取填料[11-13]對各類目標(biāo)化合物進行吸附萃取，表明石墨烯可以作為一種吸附性良好的萃取劑對樣品進行前處理。

目前，國內(nèi)外關(guān)于液相色譜法或液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測磺胺殘留的報道文獻很多，比如國內(nèi)有研究采用固相微萃取劑[14]、液相微萃取[15]、基質(zhì)固相分散[16-17]等測定磺胺類藥殘；國外有研究利用商業(yè)化的HLB固相萃取小柱對多種樣品凈化富集后測定磺胺類藥殘[18]，但是由于磺胺類藥物種類較多，前處理時間長，有機試劑使用量大而且成本高（商業(yè)固相萃取柱多為一次性），而且以石墨烯作為固相萃取填料檢測水產(chǎn)品中磺胺的研究報道很少。本實驗是在此基礎(chǔ)上研究建立一種以石墨烯為固相萃取填料同時檢測水產(chǎn)品中多種磺胺類藥殘的方法，以期為生產(chǎn)實踐提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

黑魚購于杭州物美超市；甲醇、乙腈和甲酸色譜級，德國Merck公司；13種磺胺類標(biāo)準品購自Sigma-Aldrich公司，純度≥99%，分別為磺胺氯達嗪 （Sulfachloropyridazine，SCP）、磺胺甲惡唑（Sulfamethoxazole，SMX）、磺胺甲嘧啶（Sulfamerazine，SMR）、磺胺異惡唑（Sulfisoxazole，SIZ）、磺胺嘧啶（Sulfadiazine，SDZ）、磺胺二甲嘧啶（Sulfamethazine，SMZ）、磺胺對甲氧嘧啶（Sulfameter，SME）、磺胺多辛（Sulfadoxin，SDX）、磺胺喹惡啉（Sulfaquinoxaline，SQX）、磺胺噻唑（Sulfathiazole，STZ）、磺胺間甲氧嘧啶（Sulfamonomethoxine，SMM）、磺胺二甲氧噠嗪（Sulfadimethoxin，SDM）和 磺 胺 甲 氧 噠 嗪（Sulfamethoxypyridazine，SMP）；石墨純度≥98%，F(xiàn)isher Scientific公司；3mL固相萃取柱上海安譜公司。

S-4700型掃描電鏡日本日立公司；高速冷凍離心機德國Thermo公司；Milli-Q超純水凈化系統(tǒng)美國Millipore公司；固相萃取儀美國Supelco公司；Acquity UPLC液相色譜美國Waters公司；4000QTrap三重四級桿質(zhì)譜儀美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

1.2實驗方法

1.2.1石墨烯的制備采用Hummers方法[19]制備氧化石墨烯（GO），然后將100mg氧化石墨烯分散于100mL水溶液中，超聲1h后移入燒瓶中，加入2mL水合肼于95℃水浴中冷凝回流24h[20]，抽濾得到的黑色粉末分別用甲醇和水清洗多次，最后冷凍干燥得到石墨烯保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2樣品提取與固相萃取?。?.00±0.05）g樣品于50mL離心管中，加入10mL甲醇后超聲提取10min，12000r/min下離心10min，將上清液轉(zhuǎn)移至梨形瓶中，于45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干[21]。加1mL甲醇-超純水（v/v 2/3）溶解，將溶液轉(zhuǎn)移至2mL離心管中，加入1mL正己烷，渦旋振蕩2min，12000r/min下離心10min，去除上層正己烷層，取下清液過固相萃取柱。固相萃取采用自制的石墨烯填料固相萃取柱（15mg，3mL），使用前用甲醇活化。樣品溶液以1～2mL/min的速度過固相萃取柱，用1mL 5%甲醇水溶液淋洗，減壓抽干后用適當(dāng)?shù)挠袡C試劑洗脫磺胺類化合物，洗脫液在45℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。最后用1mL初始流動相溶解，0.22μm濾膜過濾以供進樣。

1.2.3標(biāo)準曲線磺胺標(biāo)準儲備液（100μg/mL）保存于4℃條件下，再依次用黑魚空白樣品基質(zhì)提取液（按照1.2.2處理）稀釋成1、5、10、25、50、100μg/kg濃度的標(biāo)準溶液。平行3次測定，以標(biāo)準溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準曲線。

1.2.4回收率與精密度實驗加標(biāo)回收率采用三個濃度添加水平下（分別為10、25、50μg/kg）測得，日內(nèi)精密度重復(fù)實驗六次測定得到，日間精密度連續(xù)六天重復(fù)進樣測得。

1.3液質(zhì)條件

1.3.1液相條件采用Acquity UPLC BEH C8柱（50mm×2.1mm，1.7μm）；流動相：A為0.1%甲酸，B為乙腈。梯度洗脫程序如表1所示，流速為0.4mL/min，進樣體積為2μL。

表1　磺胺類化合物液相色譜梯度洗脫程序Table.1　Gradient elution program of thirteen SAs

1.3.2質(zhì)譜條件以100ng/mL磺胺標(biāo)準溶液針泵進樣，在全掃描模式（Full-Scan）下確定被測化合物的母離子，然后通過子離子掃描模式（Product Ion-Scan）下確定兩對定性與定量的子離子，并且對離子源參數(shù)以及去簇電壓、碰撞電壓和碰撞室出入口電壓等質(zhì)譜參數(shù)進行了優(yōu)化。最終確定質(zhì)譜條件：ESI+離子源；多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）；離子源溫度500℃；噴霧電壓4500V；氣簾氣241kPa；霧化氣241kPa；加熱氣414kPa，13種磺胺類化合物定量以及輔助定性離子對參數(shù)見表2。

1.4數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采集與處理通過儀器配套的Analyst 1.5.1軟件進行分析。

2　結(jié)果與分析

2.1石墨烯的表征-掃描電鏡分析

石墨烯采用Hummers方法制備，通過水合肼還原后的石墨烯得率較高（達到70%以上）。圖1為石墨烯的掃描電鏡圖。從圖1中可以看出，在放大50000倍數(shù)下，實驗合成的石墨烯非常薄，表面較平整，具有較大的比表面積，為吸附提供了可能性。但是從圖中發(fā)現(xiàn)仍然存在不少褶皺和重疊之處，這可能是在合成過程中部分石墨烯發(fā)生團聚造成。

表2　優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)Table.2　Optimized MS/MS parameters

圖1　石墨烯掃描電鏡圖（50000×）Fig.1　The SEM image of graphene（50000×）

2.2固相萃取條件的優(yōu)化

通過實驗發(fā)現(xiàn)，13種磺胺類化合物的回收率變化趨勢基本一致，所以本實驗以磺胺氯噠嗪、磺胺對甲氧噠嗪和磺胺甲氧噠嗪的回收率為例（下同）進行分析討論。

2.2.1洗脫溶劑的選擇洗脫液的選擇直接關(guān)系到樣品最終的回收率，由圖2可知，相較于其他洗脫溶劑，丙酮的洗脫能力更勝一籌，但是仍未達到理想的回收效果，經(jīng)多次實驗發(fā)現(xiàn)，在丙酮中添加少量氨水具有更好的洗脫效果，這可能是因為磺胺類化合物在堿性條件下，仲氨基N的H+解離能力增加[22]，添加氨水后呈堿性更容易被洗脫下來。因此，本實驗采用含氨的丙酮作為洗脫溶劑。

圖2　洗脫溶劑對磺胺回收率的影響Fig.2　The effect of the eluent type on the recovery of SAs

2.2.2洗脫體積的選擇在選擇相同洗脫溶液的條件下，由于磺胺類化合物在石墨烯填料上的吸附能力不同，因此所需的洗脫液洗脫體積不同，洗脫體積過少導(dǎo)致化合物不能完全被洗脫下來，體積過多不僅浪費試劑，且可能將一些強保留的化合物洗脫下來[23]。由圖3可知，隨著洗脫體積的增加，磺胺類化合物的回收率也隨之增加，當(dāng)洗脫液體積達到3mL以后對磺胺化合物的回收率變化不明顯，表明此時大部分磺胺類化合物已經(jīng)被完全洗脫下來。因此，本實驗選擇使用3mL作為最佳洗脫液體積。

圖3　洗脫體積對磺胺回收率的影響Fig.3　The effect of the eluent volumn on the recovery of SAs

2.2.3石墨烯填料質(zhì)量的選擇在進行固相萃取的過程中，使用不同質(zhì)量的石墨烯填料對于目標(biāo)化合物的回收率有比較大的影響。往往填料太多會造成吸附力過強而不容易洗脫，太少則會使目標(biāo)物在上樣過程中直接損失。由圖4可知，當(dāng)石墨烯的質(zhì)量達到15mg時，能達到比較理想的回收效果，而當(dāng)質(zhì)量增加至15mg以后對磺胺類化合物的回收率變化影響不大。因此，本實驗選擇15mg的石墨烯作為最佳填充質(zhì)量。

圖4　石墨烯質(zhì)量對磺胺回收率的影響Fig.4　The effect of the amount of graphene on the recovery of SAs

2.3液質(zhì)條件的優(yōu)化

在13種磺胺類化合物中，磺胺多辛（SDX）和磺胺二甲氧噠嗪（SDM）、磺胺間甲氧嘧啶（SMM）和磺胺甲氧噠嗪（SMP）具有相同的分子量，分別為311和281，通過二級質(zhì)譜能得到不同的離子對，從而將不同的目標(biāo)化合物分離，每個目標(biāo)化合物選取2對離子對，其中響應(yīng)較強的為定量離子對，響應(yīng)較弱的為定性離子對。在選擇電壓時，如果電壓太小則不能產(chǎn)生有效子離子，若電壓過大則會造成碎片離子過多而找不到目標(biāo)子離子[1]，因此對質(zhì)譜電壓等條件進行優(yōu)化非常有必要。優(yōu)化后磺胺類化合物的質(zhì)譜采集電壓等參數(shù)見表2，其中優(yōu)化后液質(zhì)的多反應(yīng)監(jiān)測圖見圖5，如圖所示，磺胺類化合物的的峰型和分離度都較好，基質(zhì)干擾較小，分離時間僅需12min，其中磺胺二甲氧嘧啶離子對（SDM）的響應(yīng)最強，磺胺氯噠嗪離子對（SCP）的響應(yīng)相對最弱。

圖5　磺胺標(biāo)準液的多離子反應(yīng)監(jiān)測圖Fig.5　MRM chromatograms for the standards of SAs

2.4與其他填料比較

為了探究石墨烯的吸附性能，本實驗比較了石墨烯與C18、多壁碳納米管等其他常用填料對磺胺類化合物的吸附性（均在各自優(yōu)化條件下）。由圖6可知，石墨烯對磺胺類化合物的回收率最高（達到90%以上），C18次之（在80%～85%之間），而多壁碳納米管的回收率最低（在75%～80%之間），說明相較于其他兩種填料，石墨烯具有更強的吸附能力，同時所消耗的填料質(zhì)量與洗脫劑用量相較于其他兩種填料也是最少的。

圖6　石墨烯與其他填料的萃取效果比較Fig.6　Comparison of graphene-based SPE with other sorbents

表3　磺胺類化合物的線性方程、范圍及檢出限和定量限Table.3　Linear equation，LOD and LOQ of SAs

2.5方法學(xué)驗證

2.5.1線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限磺胺類化合物的線性方程及相關(guān)系數(shù)見表3，線性方程的相關(guān)系數(shù)R2均在0.998以上，線性范圍1～100μg/kg，13種磺胺類化合物的方法檢出限為0.048～0.288μg/kg，定量限為0.160～0.960μg/kg，可以滿足供試樣品定量分析的需要。

表4　磺胺類化合物三種濃度添加水平下回收率、日內(nèi)和日間精密度Table.4　The recovery，precision of intra-day and inter-day of SAs in three concentrations

2.5.2加標(biāo)回收率與精密度由表4可以看出，13種磺胺類化合物的回收率和精密度較好，回收率在70.6%～93.8%之間，日內(nèi)精密度和日間精密度分別不超過4.6%和6.7%，能夠滿足方法的要求。

2.6樣品檢測

采用1.2.2前處理方法，對從超市購買的十批次黑魚進行了檢測，檢測結(jié)果反映了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)對磺胺類藥物的使用狀況。在部分批次黑魚樣品中同時檢出磺胺甲嘧啶（≤0.12μg/kg）、磺胺嘧啶（≤0.15μg/kg）和磺胺二甲嘧啶（≤0.28μg/kg），但是含量檢出濃度小于定量限。這些藥物可能是由人類代謝物進入生態(tài)循環(huán)系統(tǒng)引起，也可能是養(yǎng)殖戶在養(yǎng)殖過程中投放使用導(dǎo)致。

3　結(jié)論

建立了以石墨烯為新型固相萃取填料，同時測定水產(chǎn)品中13種磺胺的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的分析方法。水產(chǎn)品通過石墨烯固相萃取柱的凈化富集后，采用液質(zhì)聯(lián)用方法進行分析，方法的線性良好，回收率較高，精密度以及檢出限、定量限均能達到方法檢測需要，與其他填料相比，采用石墨烯作為固相萃取填料對磺胺類藥殘進行吸附凈化具有更高的回收率，更少的溶劑用量，更小的基質(zhì)干擾（檢出限較低），適用于在復(fù)雜水產(chǎn)品基質(zhì)中的磺胺類藥物殘留的檢測分析。

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Graphene as a novel SPE adsorbent coupled with UPLC-MS/MS for the determination of sulfanilamide residues in black fish tissues

ZHENG Ting-lu1，DAI Zhi-yuan2，F(xiàn)ANG Xu-bo1，CHEN Xiao-e1
（1.College of Food and Pharmacy，Zhengjiang Ocean University，Zhoushan 316022，China；2.College of Food Science and Biotechnology，Zhejiang Gongshang University，Hangzhou 310035，China）

A rapid method for the simultaneous determination of thirteen sulfonamide（SAs）in black fish had been developed.The samples were extracted by MeOH and enriched by solid-phase extraction using a novel material-graphene as the sorbent.Chromatography separation was performed by UPLC and the detection was achieved by tandem mass spectrometry using ESI+and MRM mode.The method had a good linear range and the correlation coefficient was greater than 0.998.The limit of detection（LOD）ranging from 0.048 to 0.288μg/kg and the limit of quantization（LOQ）ranging from 0.160 to 0.960μg/kg were obtained.Average recoveries of individual sulfonamide were btween 70.6%and 93.8%.The proposed method was sensitive，effective and stable，which was satisfied with the need in application of detection of SAs residues in various aqutic matrixes aquatic products.

graphene；black fish；sulfonamide residues；solid-phase extraction；liquid chromatography-tandem mass spectrometry

TS201.1

A

1002-0306（2015）04-0071-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.006

2014－09－23

鄭婷璐（1987-），女，碩士研究生，助理實驗師，研究方向：水產(chǎn)品質(zhì)量與安全。