HPLC法同時(shí)測(cè)定茶葉中兒茶素類和咖啡因的含量

張　琪，徐維玲，李翠芹，*

（1.教育部藥用資源與天然藥物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西北瀕危藥材資源開(kāi)發(fā)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安710062；2.西安鴻生生物技術(shù)有限公司，陜西西安710065）

ZHANG Qi1，XU Wei-ling2，LI Cui-qin1，*

（1.Key Laboratory of the Ministry of Education for Medicinal Resources and Natural Pharmaceutical Chemistry，National Engineering Laboratory for Resource Development of Endangered Crude Drugs in Northwest of China，Shaanxi Normal University，Xi’an 710062，China；2.Xi’an Honson Biotechnology Limited Company，Xi’an 710065，China）

HPLC法同時(shí)測(cè)定茶葉中兒茶素類和咖啡因的含量

張琪1，徐維玲2，李翠芹1，*

（1.教育部藥用資源與天然藥物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西北瀕危藥材資源開(kāi)發(fā)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安710062；2.西安鴻生生物技術(shù)有限公司，陜西西安710065）

為了建立了一種等度洗脫茶葉中6種兒茶素類沒(méi)食子兒茶素（GC）、表沒(méi)食子兒茶素（EGC）、兒茶素（C）、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）、表兒茶素沒(méi)食子酸酯（ECG）、表兒茶素（EC）及限量成分咖啡因（CAF）的高效液相色譜（HPLC）定量測(cè)定的方法，采用漢邦BenetnachTM C18（5μm×4.6mm×250mm）色譜柱，流動(dòng)相為甲醇∶水∶磷酸（28∶72∶0.1，v/v/v），流速為0.8mL·min-1，UV檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，柱溫為30℃。結(jié)果表明GC、EGC、C、EGCG、ECG、EC和CAF分別在0.10～1.00、0.16～1.00、0.10～1.00、0.05～0.50、0.10～1.50、0.10～2.00和0.02～1.00mg·mL-1內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)在0.9984～0.9999間；平均加樣回收率為100.89%（EGCG），99.07%（CAF）；樣品分析中，除GC的分離度RS＞1外，其他6個(gè)成分RS均＞2。該方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可用于兒茶素類和咖啡因的定量檢測(cè)。

兒茶素類，表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯，咖啡因，HPLC

ZHANG Qi1，XU Wei-ling2，LI Cui-qin1，*

（1.Key Laboratory of the Ministry of Education for Medicinal Resources and Natural Pharmaceutical Chemistry，National Engineering Laboratory for Resource Development of Endangered Crude Drugs in Northwest of China，Shaanxi Normal University，Xi’an 710062，China；2.Xi’an Honson Biotechnology Limited Company，Xi’an 710065，China）

茶多酚具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌、調(diào)血脂和降血糖等藥理作用，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥保健品、功能性飲料和化妝品中[1-3]。茶多酚產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用前景十分誘人，是近些年來(lái)研究的熱點(diǎn)。兒茶素類是茶多酚中的主成分，也是其主要的藥理活性物質(zhì)，占茶多酚含量的60%～80%[4]。其中幾種主要兒茶素表兒茶素（EC）、兒茶素（C）、表沒(méi)食子兒茶素（EGC）、沒(méi)食子兒茶素（GC）、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）和表兒茶素沒(méi)食子酸酯（ECG）是茶葉品質(zhì)和茶多酚產(chǎn)品質(zhì)量控制的重要指標(biāo)，尤其是含量最高活性最強(qiáng)的指標(biāo)性成分EGCG[1]。CAF是存在于茶葉中最主要的嘌呤類生物堿，過(guò)多攝入會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生諸多不利影響[5-6]，控制咖啡因的含量也是質(zhì)量控制重要指標(biāo)之一[7]?？焖儆行У臏y(cè)定兒茶素類和咖啡因的含量已成為茶葉品質(zhì)認(rèn)定和茶多酚產(chǎn)品質(zhì)量控制首當(dāng)其沖的問(wèn)題。關(guān)于HPLC法分析測(cè)定茶多酚中兒茶素類和咖啡因的含量已有很多文獻(xiàn)報(bào)道，大多采用梯度洗脫[8-17]，易出現(xiàn)基線不平、重復(fù)性差、分析時(shí)間較長(zhǎng)和檢測(cè)設(shè)備要求高[11，18-22]等問(wèn)題。

本研究以綠茶中EC、C、EGC、GC、EGCG、ECG和CAF為研究對(duì)象，采用等度洗脫同時(shí)測(cè)定綠茶中6種主要兒茶素類和咖啡因的含量，建立了一種快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好且成本低廉的HPLC法分析測(cè)定茶葉中兒茶素和咖啡因含量的方法，適合大批樣品分析，易于推廣使用，為茶多酚產(chǎn)品開(kāi)發(fā)利用和質(zhì)量控制提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

12種商品綠茶均購(gòu)自西安輕工茶葉批發(fā)市場(chǎng)，所有茶葉樣品經(jīng)陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物學(xué)教研組鑒定；對(duì)照品C、EC、GC、EGC、EGCG和ECG均購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司，批號(hào)依次為13050702、13022906、12101105、12092908、12052801、12091603，純度＞98%；對(duì)照品CAF購(gòu)自貴州迪大生物科技有限公司，批號(hào)58-08-2，純度≥99%；甲醇、磷酸均為色譜純，購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；超純水自制。

LC-2010A高效液相色譜儀、UV檢測(cè)器、日本島津液相工作站日本島津公司；Milli-Q Reference超純水儀美國(guó)Millipore公司；萬(wàn)分之一分析天平Sartorius科學(xué)儀器北京有限公司；恒溫水浴鍋金壇市杰瑞爾電器有限公司；TCX-600S型超聲波清洗機(jī)濟(jì)寧天宇超聲機(jī)械設(shè)備有限公司；注射器、0.22μm濾頭濾膜等。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1對(duì)照品的制備分別精密稱取對(duì)照品C、EC和GC各5.0mg，對(duì)照品EGC、EGCG、ECG和CAF各10.0mg，以甲醇為溶劑定容在5mL容量瓶中搖勻，分別制成1.0mg·mL-1和2.0mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別吸取C、EC、GC、EGC和CAF標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液400μL，ECG和EGCG標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液200μL用甲醇稀釋定容于5mL容量瓶中，制成混合對(duì)照品溶液。

1.2.2試樣的制備精密稱取1.00g綠茶粉末（過(guò)80目篩）置于錐形瓶中，各加入25mL 70%甲醇，70℃水浴鍋中提取30min，抽濾，將濾液定容于100mL容量瓶中，過(guò)0.22μm微孔濾膜后進(jìn)樣。

1.2.3色譜條件色譜柱：漢邦BenetnachTM C18色譜柱（5μm×4.6mm×250mm）；檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm；流動(dòng)相為甲醇∶水∶磷酸（28∶72∶0.1，v/v）；流速：0.8mL·min-1；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。

1.2.4線性關(guān)系和線性范圍的考察將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液分別稀釋成一系列濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，過(guò)0.22μm微孔濾膜后依次進(jìn)樣10μL。以對(duì)照品含量為橫坐標(biāo)，相對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到7種對(duì)照品的回歸線方程和線性范圍。

1.2.5樣品含量的測(cè)定按照1.2.2項(xiàng)下方法制備樣品溶液并適當(dāng)稀釋，按照1.2.3項(xiàng)下方法進(jìn)樣，用外標(biāo)法計(jì)算各物質(zhì)含量，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

2　結(jié)果與分析

2.1色譜條件的選擇

以甲醇-水-磷酸為流動(dòng)相，流速為0.8mL·min-1，可快速有效分離EC、C、EGC、GC、EGCG、ECG和CAF，結(jié)果見(jiàn)色譜圖，圖1（a、b）分別為混標(biāo)色譜圖和樣品色譜圖。兒茶素類含多個(gè)酚羥基，水溶液呈酸性，堿性條件易被氧化，加酸不僅能防止拖尾改善峰形，還能抑制其水解和氧化褐變。結(jié)果證明目標(biāo)成分對(duì)磷酸選擇性良好，該色譜條件下，目標(biāo)成分與其他雜峰分離良好。

圖1?。╝）兒茶素類和咖啡因?qū)φ掌飞V圖，（b）西鄉(xiāng)綠茶樣品色譜圖Fig.1?。╝）The HPLC chromatogram of the mixture of catechins and CAF standards，（b）the HPLC chromatogram of the sample Xixiang green tea

2.2兒茶素類和咖啡因的線性關(guān)系和線性范圍

GC、EGC、C、EGCG、ECG、EC和CAF保留時(shí)間、回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍如表1所示。結(jié)果表明，在給定的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1精密度實(shí)驗(yàn)將混合對(duì)照品溶液按照1.2.3項(xiàng)下方法連續(xù)進(jìn)樣5次，進(jìn)樣量10μL?？疾旆迕娣e的一致性，結(jié)果GC、EGC、C、EGCG、ECG、EC和CAF峰面積RSD值分別為0.24%、0.15%、0.22%、0.25%、0.57%、0.11%和0.12%。

2.3.2重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取同一份樣品（西鄉(xiāng)綠茶）按

表1　兒茶素類和咖啡因線性關(guān)系和線性范圍（n=5）Table.1　The calibration curves and linear ranges of catechins and CAF（n=5）

1.2.2項(xiàng)下試樣制備方法制5份供試品溶液，按照1.2.3項(xiàng)下方法依次進(jìn)樣，分別考察這7種化合物峰面積變化。GC、EGC、C、EGCG、ECG、EC和CAF峰面積RSD值分別為2.95%、0.68%、2.28%、1.55%、1.61%、2.18%和0.51%

2.3.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取1.2.2項(xiàng)下西鄉(xiāng)綠茶供試品按1.2.3項(xiàng)下色譜條件分別在0、4、8、12、24h進(jìn)樣一次。記錄各物質(zhì)峰面積，結(jié)果GC、EGC、C、EGCG、ECG、EC和CAF 24h內(nèi)峰面積RSD值分別為0.49%、2.25%、2.91%、0.74%、0.73%、3.33%和0.52%，表明EGC、C和EC在24h內(nèi)基本穩(wěn)定，GC、EGCG、ECG和CAF在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好，能滿足測(cè)定要求。

2.3.4加樣回收率實(shí)驗(yàn)同份供試品溶液按1.2.3項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣，測(cè)定樣品中EGCG和CAF的含量。分別加入EGCG和CAF對(duì)照品儲(chǔ)備液90μL和50μL，充分混勻后再次進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率和RSD值。結(jié)果見(jiàn)表2，EGCG平均回收率100.89%，RSD值為2.00%；CAF平均回收率99.07%，RSD值為2.37%，表明EGCG和CAF的加樣回收率良好。

表2　EGCG和CAF加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table.2　The recovery test results of EGCG and CAF

圖2　不同茶葉樣品色譜疊加圖Fig.2　The HPLC chromatogram of various tea samples

表3　茶樣中兒茶素類和咖啡因的含量（±SD，n=3）Table.3　The contents of catechins and caffeine in tea samples（±SD，n=3）

表3　茶樣中兒茶素類和咖啡因的含量（±SD，n=3）Table.3　The contents of catechins and caffeine in tea samples（±SD，n=3）

注：“ND”表示not detected。

商品綠茶含量（mg·g-1）GC　EGC　C　EGCG　CAF　EC　EGC福建天山綠茶　7.27±0.15　21.14±0.24　ND　26.04±0.20　12.80±0.48　5.49±0.73　5.06±0.79廣西綠茶　6.07±0.24　14.19±0.07　ND　25.76±0.01　13.96±0.33　4.78±0.73　7.24±0.96杭州綠茶　9.61±1.17　12.08±0.48　ND　20.53±0.43　14.44±0.43　2.13±0.07　5.15±1.00四川雀舌　16.99±0.35　21.36±0.28　ND　28.65±0.10　21.65±0.03　2.81±0.22　13.18±0.16西鄉(xiāng)綠茶　15.08±0.50　20.59±0.67　ND　38.61±0.93　20.02±0.38　4.79±0.33　7.83±1.07浙江有機(jī)綠茶　7.38±0.35　17.24±0.61　ND　27.00±0.35　13.69±0.38　4.25±0.25　4.85±0.83紫陽(yáng)綠茶　15.31±0.67　16.61±0.49　2.24±0.62　38.23±0.24　18.94±0.68　3.98±0.69　8.23±0.82浙江麗水綠茶　13.46±1.87　15.06±0.17　1.97±0.24　31.91±0.33　17.07±0.37　3.72±0.59　6.91±0.77湖北神農(nóng)綠茶　21.26±0.37　9.35±0.33　2.62±0.10　13.38±0.78　5.67±0.09　3.40±0.64　5.81±0.57福建鐵觀音　6.04±0.12　20.49±0.33　ND　26.28±0.78　12.08±0.48　5.00±0.50　5.71±0.48有機(jī)鐵觀音　25.90±0.41　18.38±0.50　1.88±0.19　28.79±0.03　13.43±0.67　4.07±0.22　5.99±0.51西湖龍井　18.15±0.59　16.28±0.56　ND　39.58±0.49　18.49±0.34　4.42±0.09　11.22±0.86

2.4樣品測(cè)定結(jié)果

研究中發(fā)現(xiàn)，兒茶素類和咖啡因的分離測(cè)定對(duì)甲醇和水的比例比較敏感，本研究確定的色譜條件分離效果好，方法穩(wěn)定。圖2為不同茶樣色譜疊加圖，除GC分離度＞1，其他5種兒茶素和咖啡因的分離度均＞2。盡管12種市售綠茶中所含化合物及其含量各有差異，但在該色譜條件下均能得到很好的分離測(cè)定，有力地論證了該法的可靠性。結(jié)果顯示該方法顯著優(yōu)于劉小喬[12]和劉錦文[23]建立的方法，三種方法都采用甲醇-水-磷酸洗脫劑系統(tǒng)，本文建立的方法不僅采用簡(jiǎn)單且應(yīng)用性強(qiáng)的等度洗脫，還改善了劉小喬和劉錦文方法出現(xiàn)的酯型兒茶素嚴(yán)重拖尾的問(wèn)題。同時(shí)，也解決了現(xiàn)行國(guó)標(biāo)方法中EC和EGCG難分離的問(wèn)題[10，12，24]。

表3為12種樣品茶葉中GC、EGC、C、EGCG、CAF、EC和ECG的含量，其中EGCG均為含量最高的組分。該結(jié)果表明，不同綠茶中兒茶素類和咖啡因的含量差別很大，6種兒茶素的含量也差別很大，這可能與綠茶的產(chǎn)地、日照、溫度、采摘季節(jié)，葉子的老嫩及茶樹(shù)品種的不同有關(guān)[25]，EGCG為綠茶中含量最高的兒茶素，這一結(jié)果也與Bansal等[8，16-18，20，26]研究結(jié)果一致。

3　結(jié)論

綠茶提取物成分復(fù)雜、干擾成分很多，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[7，24]和一些前人相關(guān)研究多用梯度洗脫。本文建立的HPLC法，采用常用、低毒、且價(jià)格低廉的洗脫劑甲醇-磷酸-水進(jìn)行等度洗脫，操作簡(jiǎn)單，重現(xiàn)性好且對(duì)檢測(cè)設(shè)備要求低；通過(guò)線性實(shí)驗(yàn)、精密度實(shí)驗(yàn)、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)、加樣回收實(shí)驗(yàn)和12種商品綠茶樣品含量的測(cè)定驗(yàn)證了該方法的可靠性。該方法用時(shí)短，在26min內(nèi)可完成7種成分的分離測(cè)定，快速、準(zhǔn)確、分離度好，重復(fù)性高，可用于兒茶素類成分和咖啡因的分析測(cè)定，為茶葉的品質(zhì)認(rèn)定和指紋圖譜研究，以及茶多酚產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供基礎(chǔ)，適合推廣使用。

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Simultaneous determination of some selected catechins and caffeine in tea by performance liquid chromatography

The contents of six catechins（GC，EGC，C，EGCG，ECG and EC）and limited composition caffeine were investigated by HPLC method with Hanbon BenetnachTMC18column（5μm×4.6mm×250mm）at 30℃and the UV detection wavelength was 280nm.The mobile phase was methanol-water-phosphorus acid（28∶72∶0.1，v/v/v）isocratic elution system，and the flow rate was 0.8mL·min-1.The results showed that the linear ranges of GC，EGC，C，EGCG，ECG，EC and caffeine were 0.10～1.00，0.16～1.00，0.10～1.00，0.05～0.50，0.10～1.50，0.10～2.00 and 0.02～1.00mg·mL-1respectively，and the correlation coefficients were ranged from 0.9984～0.9999.The average recoveries of the two most abundant compositions EGCG and CAF were 100.89%and 99.07%，respectively.The resolutions of the six object components were more than 2，except GC.The method was simple，rapid，accurate，reproducible and ideal for routine analysis of catechins and caffeine.

catechins；EGCG；caffeine；HPLC

TS201.2

A

1002-0306（2015）04-0053-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.002

2014－06－04

張琪（1989-），女，在讀碩士研究生，研究方向：中藥物質(zhì)基礎(chǔ)分析。

李翠芹（1969-），女，博士，副教授，研究方向：中藥物質(zhì)基礎(chǔ)分析和生化分子藥理學(xué)。

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2011BA106B06）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助（GK201303009）。