不同代乳條件下1～35日齡羔羊瘤胃及其微生物群落的發(fā)育

李鳳鳴 雒秋江 牛越峰 潘 榕 李維東

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，動(dòng)物營養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830052)

新生反芻幼畜消化機(jī)能的發(fā)育是其食性變化的基礎(chǔ)，無論飼喂母乳還是代乳，或配制合適的代乳，或早期斷奶，都需根據(jù)反芻幼畜胃腸消化機(jī)能的發(fā)育程度來確定。了解羔羊出生后消化機(jī)能的發(fā)育，特別是瘤胃消化代謝的發(fā)育過程，對于羔羊的飼養(yǎng)管理、代乳和開食料的開發(fā)都是必要的。羔羊?qū)εＤ谭鄞?milk powder substitute，MS)有很高的消化利用性［1－2］;而羔羊?qū)σ贼~粉為蛋白質(zhì)來源的魚粉代乳(fish meal substitute，F(xiàn)S)存在著消化障礙［1－3］。本文是以牛奶粉代乳飼喂羔羊作為消化發(fā)育正常的羔羊，以魚粉代乳飼喂羔羊作為消化發(fā)育障礙的羔羊，研究羔羊日齡、飼喂魚粉代乳和開食料對羔羊瘤胃及其微生物群落發(fā)育的影響，以了解1～35日齡羔羊消化機(jī)能發(fā)育的特點(diǎn)，為羔羊早期斷奶和代乳的配制提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與試驗(yàn)動(dòng)物

選取初生重(3 380±328)g的小尾寒羊公羔共56只，分別飼喂牛奶粉代乳(28只)和魚粉代乳(28只)。羔羊在1～3日齡(出生當(dāng)天計(jì)為0日齡)均由母乳哺育，并喂牛奶粉代乳或魚粉代乳。從4日齡起全部喂牛奶粉代乳或魚粉代乳直到20日齡，期間羔羊自由采食開食料。在21日齡隨機(jī)選取飼喂2種代乳的羔羊各8只停止飼喂代乳，改為僅喂開食料。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及屠宰羔羊的日齡和數(shù)量見表1。

1.2 試驗(yàn)飼糧與飼養(yǎng)管理

牛奶粉代乳和魚粉代乳的制備參照鐘濤等［2］的方法進(jìn)行。液狀牛奶粉代乳的干物質(zhì)含量為14.12%。魚粉代乳的干物質(zhì)含量為14.46%。牛奶粉代乳和魚粉代乳的營養(yǎng)水平見表2。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及屠宰羔羊的日齡和數(shù)量Table 1 Experimental designand and the arragement of the days of age and number of slaughter lamb

表2 牛奶粉代乳和魚粉代乳的營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 2 Nutrient levels of MS and FS(DM basis) %

羔羊1～3日齡跟隨母羊哺乳并補(bǔ)喂牛奶粉代乳或者魚粉代乳，1、2、3 日齡分別補(bǔ)喂 1、2、3次。4日齡時(shí)羔羊全部改為飼喂代乳，代乳每天喂4 次，分別在09:00、14:00、19:00、24:00 飼喂。每次飼喂根據(jù)羔羊意愿自由采食，直至羔羊喝飽無吮吸行為止。在進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，若羔羊發(fā)生腹瀉，則適當(dāng)減少代乳飼喂量。從1日齡起，即提供開食料，保證羔羊自由舔食。開食料組成及營養(yǎng)水平見表3。

表3 開食料組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 3 Composition and nutrient levels of the starter(DM basis) %

1.3 樣品的收集與處理保存

在7、14、21、28和35日齡，分別取各組羔羊4只進(jìn)行屠宰。在早上飼喂后3 h，將羔羊放血致死，立即打開腹腔，分別在食管與瘤胃、網(wǎng)胃與瓣胃處雙道結(jié)扎，將瘤網(wǎng)胃取出，切開，將胃液取出混勻后取5 mL到凍存管，放入液氮中保存，用于瘤胃液真菌數(shù)量的測定，其余瘤胃液用Cyberscan 510型pH計(jì)測定并記錄，再用4層紗布過濾瘤胃液，取50 mL加1～2滴飽和氯化汞，搖勻后分裝于6支10 mL離心管中，加蓋密封保存于－20℃冰箱，用于測定瘤胃液揮發(fā)性脂肪酸(VFA)和氨態(tài)氮(NH3-N)濃度，并進(jìn)行瘤胃液細(xì)菌和原蟲的分類計(jì)數(shù)。

瘤胃液取出后，迅速在瘤胃背盲囊和腹盲囊處各取2處樣，取樣面積約為1 cm×2 cm，用硬的小紙片鋪平、鋪展，在液氮中速凍30 s，裝入5 mL凍存管后再放入液氮中保存，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后于－70℃保存，以備測定瘤胃乳頭長度和寬度。

1.4 樣品測定方法

瘤胃液細(xì)菌和原蟲顯微鏡分類計(jì)數(shù)參照朱文濤等［4］和周封文等［5］的方法。采用實(shí)時(shí)定量 PCR法檢測定瘤胃液真菌數(shù)量［6］，由生工生物工程(上海)股份有限公司測定完成。

瘤胃液N-NH3濃度測定采用氧化鎂蒸餾法。瘤胃液VFA濃度測定采用氣相色譜(GC)法［7］，取1.0 mL瘤胃液進(jìn)行樣品前處理，使用島津GC2010型氣相色譜儀測定。以巴豆酸為內(nèi)標(biāo)，采用程序升溫，升溫程序?yàn)閺?5℃，以13℃/min升溫到200℃，保持0.5 min結(jié)束。

用顯微鏡法測定瘤胃上皮乳頭長度和寬度［8］。瘤胃組織樣品切片經(jīng)蘇木精－伊紅(HE)染色后，在40倍光鏡(Motic BA200)下觀測其形態(tài)結(jié)構(gòu)，并利用Motic Images Advanced 3.2軟件測量瘤胃乳頭長度、乳頭寬度。每個(gè)樣本觀察4個(gè)非連續(xù)切片，每張切片選取2個(gè)視野，每個(gè)視野分別測定3組數(shù)據(jù)，其平均值作為1個(gè)測定結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用Excel 2007進(jìn)行整理，采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件中的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)以及單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)處理;試驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，差異顯著和極顯著標(biāo)準(zhǔn)分別設(shè)定為P ＜0.05和 P＜0.01水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 瘤胃液細(xì)菌數(shù)量

如表4所示，飼喂牛奶粉代乳時(shí)羔羊在7日齡瘤胃內(nèi)即有較多細(xì)菌，且主要為瘤胃球菌，占97.4%，而反芻月形單胞菌和大纖維桿菌幾乎沒有;瘤胃液細(xì)菌總數(shù)隨日齡不斷增加，其中大纖維桿菌數(shù)也不斷增加，但始終沒有出現(xiàn)反芻月形單胞菌。飼喂魚粉代乳時(shí)羔羊瘤胃液細(xì)菌數(shù)量變化情況與飼喂牛奶粉代乳時(shí)相似，但在7日齡時(shí)細(xì)菌總數(shù)較少。從21日齡起改喂開食料，28日齡時(shí)細(xì)菌數(shù)量較原先飼喂牛奶粉代乳和魚粉代乳的羔羊分別增加49.7%(P ＜0.01)和21.1%(P ＞0.05)，之后均開始減少，與飼喂代乳羔羊的瘤胃液細(xì)菌總數(shù)無顯著差異(P＞0.05)。

表4 不同代乳條件下1～35日齡羔羊瘤胃液細(xì)菌數(shù)量的變化Table 4 The changes of bacteria number in rumen fluid of 1 to 35 days’lambs under the condition of different milk replacers 109個(gè)/mL

2.2 瘤胃液原蟲數(shù)量

如表5所示，羔羊在7日齡瘤胃內(nèi)即有原蟲存在，之后隨日齡增加不斷增加。在7日齡飼喂魚粉代乳羔羊的瘤胃液原蟲總數(shù)比飼喂牛奶粉代乳的低27.3%(P＞0.05)。瘤胃內(nèi)原蟲主要為等毛蟲、內(nèi)毛蟲和雙毛蟲，在飼喂牛奶粉代乳的羔羊瘤胃中，分別占原蟲總數(shù)的44.5%、40.9%和14.5%，在飼喂牛魚粉代乳的羔羊瘤胃中，分別約占原蟲總數(shù)的31.3%、58.8%和 10.0%。羔羊在 21日齡改喂開食料，28日齡時(shí)原蟲總數(shù)較原先飼喂牛奶粉代乳和魚粉代乳的羔羊均極顯著減少(P＜0.01)，之后回升。

表5 不同代乳條件下1～35日齡羔羊瘤胃液原蟲數(shù)量的變化Table 5 The changes of protozoa number in rumen fluid of lambs at 1 to 35 days of 1 to 35 days’lambs under the condition of different milk replacers 105個(gè)/mL

2.3 瘤胃液真菌數(shù)量

如表6所示，飼喂牛奶粉代乳羔羊7日齡瘤胃液真菌數(shù)量較少，直到35日齡時(shí)才較多。飼喂魚粉代乳羔羊7日齡時(shí)瘤胃內(nèi)有一定量的真菌，但之后減少，直到35日齡仍無大量真菌出現(xiàn)。羔羊在21日齡改喂開食料，原來飼喂牛奶粉代乳的羔羊瘤胃液真菌數(shù)量在35日齡時(shí)顯著增加(P＜0.05)，而原先飼喂魚粉代乳的羔羊瘤胃仍幾乎沒有真菌存在。

表6 不同代乳條件下1～35日齡羔羊瘤胃液真菌數(shù)量的變化Table 6 The changes of fungi number in rumen fluid of 1 to 35 days’lambs under the condition of different milk replacers 103個(gè)/mL

2.4 瘤胃特性參數(shù)

如表7所示，飼喂牛奶粉代乳羔羊7日齡時(shí)瘤胃內(nèi)即有VFA，且主要為乙酸，之后隨日齡增加TVFA濃度不斷升高，在35日齡時(shí)為72.7 mmol/L。飼喂魚粉代乳時(shí)羔羊瘤胃液TVFA濃度也隨日齡增加而總體呈升高趨勢，但存在波動(dòng)，在14日齡有1個(gè)發(fā)酵高峰。飼喂牛奶粉代乳羔羊轉(zhuǎn)喂開食料28日齡羔羊瘤胃液TVFA濃度升高158.8%(P＜0.01)，而飼喂魚粉代乳羔羊轉(zhuǎn)喂開食料28日齡瘤胃液TVFA濃度變化不顯著(P ＞0.05)。

飼喂牛奶粉代乳羔羊7日齡時(shí)就有較高得瘤胃液氨態(tài)氮濃度，之后隨日齡逐漸升高，飼喂魚粉代乳羔羊瘤胃液氨態(tài)氮濃度在14日齡很高，為67.9 mg/dL，之后逐漸降低。飼喂牛奶粉代乳羔羊轉(zhuǎn)喂開食料瘤胃液氨態(tài)氮濃度變化不顯著(P＞0.05)，但飼喂魚粉代乳羔羊轉(zhuǎn)喂開食料瘤胃液氨態(tài)氮濃度降低 49.1%(28日齡，P＜0.05)和 9.5%(35日齡，P ＞0.05)。

表7 不同代乳條件下1～35日齡羔羊瘤胃特性參數(shù)的變化Table 7 The changes of ruminal characteristic parameters of 1 to 35 days’lambs under the condition of different milk replacers

2.5 瘤網(wǎng)胃重量和結(jié)構(gòu)形態(tài)

如表8所示，飼喂牛奶粉代乳和魚粉代乳羔羊瘤網(wǎng)胃重量均隨日齡不斷增加，且2組之間差異不顯著(P＞0.05)。飼喂牛奶粉代乳和魚粉代乳羔羊轉(zhuǎn)喂開食料，對瘤網(wǎng)胃重量變化無顯著影響(P ＞0.05)。

飼喂牛奶粉代乳和魚粉代乳羔羊瘤胃乳頭長度均隨日齡增加而增加，但飼喂魚粉代乳羔羊增加程度低于飼喂牛奶粉代乳羔羊，7和35日齡時(shí)飼喂魚粉代乳羔羊瘤胃乳頭長度分別極顯著和顯著低于飼喂牛奶粉代乳羔羊(P＜0.01和P＜0.05)。飼喂牛奶粉代乳羔羊轉(zhuǎn)喂開食料，28和35日齡瘤胃乳頭長度顯著或極顯著變短(P＜0.05或P＜0.01)，飼喂魚粉代乳羔羊轉(zhuǎn)喂開食料乳頭長度雖也顯著變短(28日齡，P＜0.05)，但很快恢復(fù)。

飼喂牛奶粉代乳羔羊瘤胃乳頭寬度隨日齡增加而增加，飼喂魚粉代乳羔羊的也隨日齡增加，并且顯著或極顯著寬于飼喂牛奶粉代乳羔的羊瘤胃乳頭寬度(P＜0.05或 P ＜0.01，35日齡除外)。飼喂牛奶粉代乳羔羊轉(zhuǎn)喂開食料28日齡乳頭寬度極顯著增加(P＜0.01)，但飼喂魚粉代乳羔羊轉(zhuǎn)喂開食料乳頭寬度有所變窄(P＞0.05)。

表8 不同代乳條件下1～35日齡羔羊瘤網(wǎng)胃重量和結(jié)構(gòu)形態(tài)的變化Table 8 The changes of the weight and morphological structure of rumen-reticulum of 1 to 35 days’lambs under the condition of different milk replacers

3 討論

3.1 羔羊瘤胃微生物群落的發(fā)育

羔羊出生時(shí)瘤胃體積較小，約 9.10 g［9］，沒有微生物駐足［10］。細(xì)菌是最早出現(xiàn)在瘤胃內(nèi)的微生物，動(dòng)物出生24 h后其瘤胃壁即有兼性厭氧細(xì)菌存在［10］。本試驗(yàn)表明，羔羊在7日齡時(shí)，瘤胃液中即有較多細(xì)菌存在，總數(shù)約為成年羊的36.5%［4］，其中主要為瘤胃球菌。朱文濤等［11］曾報(bào)道45日齡羔羊單位瘤胃液中細(xì)菌總數(shù)即與成年羊的相近，羔羊與成年羊瘤胃細(xì)菌的差別主要是在瘤胃液體積上。研究表明羔羊出生時(shí)瘤胃中沒有原蟲［12］，反芻幼畜主要是通過與成年動(dòng)物直接接觸獲得原蟲，此后羔羊瘤胃液原蟲總數(shù)將持續(xù)增長至2 月齡(瘤胃液中 5.7 ×105個(gè)/mL)［13］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，7、14、21、28和35日齡瘤胃液原蟲總數(shù)分別為 1.10 ×105、1.29 ×105、1.83 ×105、3.12×105和3.55×105個(gè)/mL，分別約為成年綿羊的11.3% 、13.3% 、18.8% 、3.1% 和 36.5%［4］，表明羔羊瘤胃液原蟲總數(shù)是一逐漸增長的過程。Fonty等［13］研究表明2周齡羔羊瘤胃存在較多厭氧真菌，并且數(shù)量隨日齡緩慢增加。瘤胃液真菌在羔羊10日齡就可以檢測到，但在6～8周齡時(shí)才達(dá)到成年羊水平［14］。在本試驗(yàn)，羔羊瘤胃液真菌數(shù)量較少，直到35日齡時(shí)才較多，約為成年羊的75%［5］，結(jié)論與已有文獻(xiàn)的相似。從本試驗(yàn)和有關(guān)文獻(xiàn)看，可以認(rèn)為羔羊瘤胃液細(xì)菌總數(shù)增加最快，35日齡可以達(dá)到成年羊的97%，其中以瘤胃球菌為主，而反芻月形單胞菌出現(xiàn)較晚;真菌數(shù)量增加慢于細(xì)菌;而瘤胃液原蟲總數(shù)要達(dá)到成年動(dòng)物水平約需2個(gè)月。

3.2 羔羊瘤胃特性參數(shù)發(fā)育

3日齡羔羊瘤胃內(nèi)容物中即有乙酸、丙酸、丁酸存在，分別為 11.0、3.6、0.43 mmol/L［15］，而在本試驗(yàn)7日齡時(shí)，羔羊瘤胃液的乙酸、丙酸、丁酸濃度分別為19.9、4.1 和1.7 mmol/L，約為成年綿羊的40.09%［16］，表明瘤胃發(fā)酵在羔羊出生早期即已出現(xiàn)。新生反芻幼畜瘤胃液VFA濃度隨日齡不斷升高［17］，在本試驗(yàn)飼喂牛奶粉代乳的條件下，羔羊瘤胃液TVFA濃度在7、14、21、28和35日齡分別為25.8、32.0、30.3、42.2 和 72.7 mmol/L，因此在 35日齡以后瘤胃液中TVFA濃度才能達(dá)到成年綿羊的水平［16］。

羔羊瘤胃液氨態(tài)氮的濃度在出生后就會很高，在35日齡以后與成年羊相比并沒有很大的不同［16］。本試驗(yàn)結(jié)果表明羔羊在7日齡瘤胃液氨態(tài)氮濃度就已較高，為33.2 mg/dL，提示代乳蛋白在瘤胃內(nèi)已有降解，羔羊瘤胃液氨態(tài)氮濃度隨日齡變化的趨勢并不明顯。

在本試驗(yàn)，羔羊瘤胃液TVFA濃度隨日齡增加不斷升高，而pH也不斷升高，主要與瘤胃液氨態(tài)氮濃度也不斷升高有關(guān)。

3.3 羔羊瘤網(wǎng)胃重量和結(jié)構(gòu)形態(tài)的發(fā)育

在本試驗(yàn)，羔羊瘤網(wǎng)胃重量隨日齡不斷增加，飼喂牛奶粉代乳時(shí)瘤網(wǎng)胃重量(y1)與日齡(x1)呈線性相關(guān):y1=0.409 3x1－ 14.190(R2=0.909，P ＜0.05)。瘤胃乳頭長度和寬度是影響吸收的重要因素，瘤胃乳頭在羔羊出生后不斷增長［18］。本試驗(yàn)與已有結(jié)果相似，羔羊瘤胃乳頭的長度和寬度均隨日齡而不斷增加，飼喂牛奶粉代乳時(shí)分別增長225和125 μm/d。

瘤胃液VFA濃度可能與瘤胃上皮乳頭發(fā)育有關(guān)。在本試驗(yàn)，瘤胃液TVFA濃度(x2)與瘤胃乳頭長度(y2)和寬度(y3)呈現(xiàn)顯著相關(guān):y2=7.784 6x2+178.48(R2=0.901 8，P ＜ 0.05);與瘤胃乳頭寬度呈現(xiàn)極顯著相關(guān):y3=2.441 8x2+101.24(R2=0.985，P ＜0.01)，提示 TVFA 濃度決定瘤胃上皮乳頭的發(fā)育。

3.4 魚粉代乳和開食料對羔羊瘤胃及其微生物群落發(fā)育的影響

關(guān)于飼糧(代乳)對早期反芻幼畜瘤胃微生物發(fā)育影響的報(bào)道較少。在本試驗(yàn)飼喂魚粉代乳時(shí)羔羊瘤胃液細(xì)菌總數(shù)并無顯著變化，轉(zhuǎn)喂開食后有增加趨勢，而原蟲總數(shù)在飼喂魚粉代乳時(shí)有減少趨勢，特別是在轉(zhuǎn)喂開食料初期，瘤胃液原蟲總數(shù)極顯著減少，表明羔羊飼糧(代乳)類型主要影響瘤胃液原蟲總數(shù)。瘤胃液真菌數(shù)量在本試驗(yàn)中由于測定變異較大，尚無確切結(jié)論，但似乎飼喂牛奶粉代乳時(shí)數(shù)量較多。

在本試驗(yàn)，飼喂魚粉代乳對羔羊瘤胃液TVFA濃度沒有顯著影響，但其隨日齡變化的模式與飼喂牛奶粉代乳的不同，在14日齡有一個(gè)明顯升高再降低的過程。飼喂魚粉代乳羔羊14日齡時(shí)瘤胃液氨態(tài)氮濃度過高，提示羔羊已處在氨中毒狀態(tài)［19］。轉(zhuǎn)喂開食料時(shí)原來喂牛奶粉代乳的羔羊瘤胃液TVFA濃度升高，而原來飼喂魚粉代乳的卻急劇降低，氨態(tài)氮濃度也降低，之后才恢復(fù)，可能與氮采食量減少有關(guān)。以上說明飼喂魚粉代乳羔羊瘤胃液TVFA和氨態(tài)氮的濃度變化隨日齡和飼糧都有其特殊性。

Jud［20］認(rèn)為新生反芻動(dòng)物僅喂乳汁或代乳品，會延滯瘤胃的發(fā)育，這些動(dòng)物的瘤胃比同齡的正常動(dòng)物小，胃壁較薄，乳頭缺乏正常的發(fā)育和色澤。Krehbiel［21］認(rèn)為飼糧不同會引起瘤胃乳頭和胃腸黏膜適應(yīng)性改變。在本試驗(yàn)，飼喂魚粉代乳和轉(zhuǎn)喂開食料對羔羊的瘤網(wǎng)胃重量均無顯著影響，但是，瘤胃乳頭長度有減少的趨勢，而乳頭寬度在飼喂魚粉代乳時(shí)變寬，在飼喂牛奶粉代乳轉(zhuǎn)開食料時(shí)也變寬，提示瘤胃乳頭寬度與長度對于瘤胃代謝或吸收可能有不同的意義，較劣質(zhì)的代乳或開食料使瘤胃乳頭變寬。

4 結(jié)論

①飼喂牛奶粉代乳羔羊瘤胃在7日齡即有原蟲和細(xì)菌駐足。瘤胃液原蟲和細(xì)菌總數(shù)隨日齡增加。7日齡羔羊瘤胃液真菌數(shù)量較少，直到35日齡時(shí)才較多。

②羔羊瘤胃在7日齡即有VFA和氨態(tài)氮，并隨日齡增加而增加;羔羊瘤網(wǎng)胃重量、瘤胃乳頭長度和寬度隨日齡增加而增加。

③飼喂魚粉代乳時(shí)羔羊瘤胃液原蟲和細(xì)菌總數(shù)趨于減少，7日齡時(shí)有一定量的真菌，但之后減少，直到35日齡仍無較多真菌出現(xiàn)。瘤胃液VFA和氨態(tài)氮濃度變化較為劇烈，瘤網(wǎng)胃重量減少，瘤胃上皮乳頭長度變短，但寬度增加。

④21日齡斷奶羔羊轉(zhuǎn)喂開食料時(shí)瘤胃液細(xì)菌總數(shù)增加、原蟲總數(shù)減少，而瘤胃液真菌數(shù)量、VFA和氨態(tài)氮濃度變化與原先飼喂的代乳類型有關(guān)。

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