磷壁酸酶生物學(xué)功能及潛在應(yīng)用

雷 高 楊 森 夏國慶 陳紅歌*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)微生物酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002;2.曼徹斯特大學(xué)炎癥與修復(fù)研究所，曼徹斯特M13 9PT)

磷壁酸(teichoic acid)和肽聚糖(peptidoglycan)共同構(gòu)成革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)成分，二者構(gòu)成的細(xì)胞壁約占細(xì)胞干重的50%［1］。細(xì)菌磷壁酸和肽聚糖的研究一直都是研究治療革蘭氏陽性細(xì)菌感染疾病的重點(diǎn)。目前已有很多針對肽聚糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行的有關(guān)抑菌物質(zhì)(如溶菌酶、青霉素)及抑菌機(jī)制的研究［2-3］，但有關(guān)它的磷壁酸降解及抗生素作用的研究卻非常少。磷壁酸是一種富含磷酸基團(tuán)的線性多聚體，其骨架由磷酸甘油或者磷酸核糖醇構(gòu)成［4］。Kusse等［5-6］首次從枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)Marburg中分離到了一種可以特異性降解磷壁酸的酶，將其命名為磷壁酸酶(teichoicase)。然而，有關(guān)磷壁酸酶的后續(xù)研究報(bào)道較少，在 NCBI、KEGG、BRENDA等數(shù)據(jù)庫中至今未有磷壁酸酶基因和蛋白的任何記錄。因此，本文將主要介紹磷壁酸酶的發(fā)現(xiàn)及命名、可能的同工酶、功能以及潛在的應(yīng)用價值。

1 磷壁酸酶簡介

1.1 發(fā)現(xiàn)及命名

1972年，Wise等［7］首次以 32P標(biāo)記的 Bacillus subtilis ATCC6051的磷壁酸作為底物，篩選到了具有分解磷壁酸能力的細(xì)菌，并且將其命名為磷壁酸分解(teichoic-acid eater，TAE)菌株。Wise等［7］雖然測到了TAE菌株的粗酶液具有分解磷壁酸的能力，但是他們并沒有對粗酶液中的各個組分進(jìn)行分離，沒有得到純的具有分解磷壁酸能力的酶。因此，他們并不能夠確定TAE菌株的粗酶液中到底有多少種酶與磷壁酸的降解有關(guān)，也沒辦法排除是一些核酸酶的作用。隨后，1982年，Kusse等［5］以帶有14C標(biāo)記的葡萄糖的磷壁酸(來自于Bacillus subtilis DSM 10)作為底物，從Bacillus subtilis Marburg的發(fā)酵液中分離并且純化到了可以特異性地降解磷壁酸的酶，并將其命名為磷壁酸酶。他們將磷壁酸酶定義為這樣一類酶:能夠特異性地作用于磷壁酸，但是不能作用于核酸類物質(zhì);具有磷酸二酯酶活性，但是不具有磷酸單酯酶活性的酶。磷壁酸酶可以作用于磷壁酸產(chǎn)生α-D-葡萄糖 -1，2甘油 -3-磷酸(α-D-glucose 1→2(sn)glycero-3-phosphate)。它在 Bacillus subtilis Marburg的產(chǎn)孢時期，活性達(dá)到最高。Kusse等［5］還測得了此 Bacillus subtilis Marburg來源的磷壁酸酶的相對分子質(zhì)量，大約為310×103，由4個亞基組成，每個亞基大約為78×103。

1.2 可能的同工酶

磷壁酸酶雖在1982年已經(jīng)被提取和純化，并且測定了相對分子質(zhì)量，但是，他們并沒有獲得此酶的基因和晶體結(jié)構(gòu)信息。而且，此后也沒有人在相關(guān)領(lǐng)域發(fā)表任何有關(guān)磷壁酸酶的文章，NCBI、KEGG、BRENDA等數(shù)據(jù)庫中至今也沒有關(guān)于磷壁酸酶基因(teichoicase)和蛋白的相關(guān)信息。然而，根據(jù)磷壁酸酶作用的底物、作用特點(diǎn)以及產(chǎn)物在NCBI上進(jìn)行搜索，發(fā)現(xiàn)其與甘油磷酸二酯磷酸二酯酶(glycerophosphodiester phosphodiesterase，GDPD)家族的一些作用底物、作用特點(diǎn)、產(chǎn)物都十分相似，尤其是 GDPD(EC:3.1.4.46)。因此，磷壁酸酶極有可能屬于GDPD家族。

GDPD家族是一類專門水解甘油磷酸二酯類底物，產(chǎn)生甘油-3-磷酸和相應(yīng)的醇類(如:膽堿、乙醇胺、肌醇、絲氨酸)的水解酶［8-14］，催化的反應(yīng)如下:

GDPD家族中一些酶的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)得到［11，13，15］，它們是類似于磷酸丙糖異構(gòu)酶晶體結(jié)構(gòu)的α/β折疊桶結(jié)構(gòu)，由8個β折疊片和8個α螺旋組成。鎂離子(Mg2+)、鈣離子(Ca2+)是甘油磷酸二酯酶的激活劑［11，16-18］。甘油磷酸二酯酶廣泛存在于原核生物、真核生物中，并且對許多甘油磷酸二酯都具有特異性的水解能力，例如:甘油磷酸膽堿(glycerophosphocholine)、甘油磷酸乙醇胺(glycerophosphoethanolamine)、甘油磷酸甘油(glycerophosphoglycerol)、雙甘油磷酸甘油［bis(glycerophosphoglycerol)］。而這些底物在結(jié)構(gòu)上與甘油型磷壁酸十分相似，都是以磷酸和甘油形成的磷酸二酯鍵作為骨架。而且，據(jù)Santos-Beneit等［19］和 Mcoughlin 等［20］的報(bào)道，甘油磷酸二酯酶在細(xì)菌對磷和碳源的利用上也發(fā)揮著重要作用。因此，甘油磷酸二酯酶極有可能是磷壁酸酶的同工酶。

2 磷壁酸酶的功能

2.1 降解細(xì)菌磷壁酸

磷壁酸酶是Kusse等［5-6］依據(jù)其可以特異性地降解磷壁酸而命名的，因此，降解磷壁酸應(yīng)該就是磷壁酸酶的功能之一。根據(jù)報(bào)道，他們以Bacillus subtilis DSM 10的磷壁酸作為底物，以14C標(biāo)記葡萄糖，與Bacillus subtilis Marburg來源的磷壁酸酶作用后，生成了α-D-葡萄糖-1，2甘油-3-磷酸。因此，磷壁酸酶降解磷壁酸的方式應(yīng)該就是:作用于磷壁酸中的甘油-磷酸骨架，從而產(chǎn)生甘油-3-磷酸和甘油。

2.2 參與磷脂和磷元素代謝

根據(jù)Kusse等［5-6］的研究，磷壁酸酶作用于磷壁酸中的甘油-磷酸骨架，產(chǎn)生甘油-3-磷酸和甘油，而甘油-3-磷酸對于原核和真核生物都有著非常重要的作用。在原核生物中，如大腸桿菌(Escherichia coli)，據(jù) Larson 等［21］報(bào)道，在 GDPD的作用下，甘油磷酸二酯類物質(zhì)可以被降解，生成甘油-3-磷酸和醇類。而甘油-3-磷酸在ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的運(yùn)輸下到達(dá)胞質(zhì)，參與到磷脂的合成途徑中［16，22-23］，為磷脂的合成提供原料。在真核生物中，GDPD也發(fā)揮著相同的作用。Cheng等［10］報(bào)道了擬南芥在培養(yǎng)基磷饑餓的情況下，在GDPD的作用下，不僅可以從磷脂上獲得甘油-3-磷酸用以合成新的脂類，同時還可以獲得磷元素用以機(jī)體的磷代謝。另外，Santos-Beneit等［19］發(fā)現(xiàn)天藍(lán)鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)中甘油磷酸二酯酶在磷源和碳源的調(diào)節(jié)中也發(fā)揮著重要的作用。由于甘油磷酸二酯酶是磷壁酸酶可能的同工酶，而且磷壁酸酶作用于磷壁酸后的產(chǎn)物也為甘油-3-磷酸，因此，磷壁酸酶也極有可能在原核生物和真核生物的磷脂以及磷元素代謝過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。

2.3 阻止革蘭氏陽性致病菌對宿主細(xì)胞的黏附、定植

磷壁酸是一類由多聚甘油磷酸酯或多聚磷酸核糖醇構(gòu)成的陰離子聚合物，其側(cè)鏈上羥基往往帶有丙氨酸(Ala)或者N-乙酰葡糖胺(N-acctylglucosamine，GlcNAc)，故通常帶有一定量的正電荷，形成正負(fù)電荷交替出現(xiàn)的鏈狀聚合物結(jié)構(gòu)［24］。近年來，越來越多的研究表明，磷壁酸在革蘭氏陽性細(xì)菌與宿主細(xì)胞的互作中發(fā)揮著十分重要的作用［25-28］。據(jù) Weidenmaier等［29］報(bào)道，磷壁酸在金黃色葡萄球菌對大鼠鼻腔黏膜上皮細(xì)胞的黏附中發(fā)揮著重要作用。Gao等［30］利用排斥試驗(yàn)和競爭試驗(yàn)也證明了磷壁酸在丁酸梭菌的黏附、定植過程中發(fā)揮著主要作用。因此，磷壁酸酶對磷壁酸的降解可能導(dǎo)致革蘭氏陽性細(xì)菌對宿主細(xì)胞黏附率的降低，進(jìn)而阻止諸如金黃色葡萄球菌等一些革蘭氏陽性細(xì)菌對宿主細(xì)胞的黏附、定植。

3 磷壁酸酶潛在的應(yīng)用價值

磷壁酸酶作為一種可以特異性地降解甘油型磷壁酸的磷酸二酯酶，在細(xì)菌生理學(xué)研究和動物疾病預(yù)防方面都具有潛在的價值。

3.1 細(xì)菌生理學(xué)研究

磷壁酸酶的發(fā)現(xiàn)是非常重要的，它對進(jìn)一步地了解革蘭氏陽性細(xì)菌磷壁酸的合成與降解以及磷脂、磷元素的代謝機(jī)制有著非常重大的意義。

在磷壁酸合成機(jī)制研究方面，黃健［31］報(bào)道了在肺炎鏈球菌體中存在的基因spd1672是影響磷壁酸合成的關(guān)鍵基因，該基因缺失后，會導(dǎo)致細(xì)菌磷壁酸合成顯著減少，并且對宿主定植、侵襲能力減弱。在磷壁酸降解方面，也僅有Kusse等［5］從枯草芽孢桿菌中發(fā)現(xiàn)并純化到了可以降解磷壁酸的磷壁酸酶，揭示磷壁酸酶在其他細(xì)菌和真菌中的存在狀況及其特性對于研究磷壁酸的降解機(jī)制具有重要的作用。

根據(jù)Kusse等［5-6］的研究，磷壁酸酶作用于甘油型磷壁酸后會形成α-D-葡萄糖-1，2甘油-3-磷酸。而甘油-3-磷酸往往被細(xì)菌用來合成脂類物質(zhì)［16］，如磷脂。另外，據(jù) Schwan 等［23］報(bào)道螺旋原蟲(Spirochetes)在生長環(huán)境中缺乏磷源和碳源時，會降解磷脂類物質(zhì)生成甘油-3-磷酸，用來當(dāng)作碳源和磷源，保證細(xì)胞能夠進(jìn)行正常的磷代謝以及達(dá)到較高的細(xì)胞濃度。因此，磷壁酸酶在細(xì)胞磷脂和磷代謝的過程中發(fā)揮著很大的作用。研究磷壁酸酶也將有助于更加深入地了解細(xì)胞對磷脂和磷元素的代謝過程。

3.2 動物細(xì)菌性疾病預(yù)防

根據(jù) Weidenmaier等［29］和 Gao 等［30］的報(bào)道，磷壁酸在金黃色葡萄球菌對宿主細(xì)胞的黏附、定植中發(fā)揮著重要作用。因此，磷壁酸酶可望在以下方面對預(yù)防細(xì)菌性疾病發(fā)揮作用。

3.2.1 外傷感染治療

長期以來，動物疫病多，疫情復(fù)雜始終是制約我國畜牧業(yè)健康發(fā)展的一個重要因素［32］。造成動物患病的因素是多方面的，外傷感染則是較為常見的因素之一。在造成動物外傷感染的細(xì)菌中，革蘭氏陽性細(xì)菌占有很大的比例。例如，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、腸球菌(Enterococcus)、鏈球菌(Streptococcus)等。這些革蘭氏陽性細(xì)菌的感染極易引起諸如肺炎、化膿性感染、敗血癥、臍帶炎等，很容易引起幼畜的死亡。目前，防治這些疾病的發(fā)生，人們主要采用注射疫苗以及飼喂抗生素類藥物的方法。但是，疫苗和抗生素類藥物的使用極易造成在動物肉類制品中殘留量超標(biāo)。而且，抗生素類藥物的頻繁使用也極易使一些革蘭氏陽性致病菌產(chǎn)生抗性。而磷壁酸酶的使用則可以避開這些問題。磷壁酸酶用于動物外傷感染的治療主要依靠其可以降解磷壁酸，阻止革蘭氏陽性細(xì)菌對宿主細(xì)胞的定植、黏附［33］，繼而阻止其在外傷處繁殖以及產(chǎn)生毒素，從而達(dá)到保護(hù)動物免受外傷感染。

3.2.2 在飼料中的應(yīng)用

磷壁酸酶還可以添加到動物飼料中，尤其是幼畜飼料，作為一些由革蘭氏陽性細(xì)菌造成的食入性疾病的阻斷劑。幼畜較成年動物，免疫力低，對環(huán)境的適應(yīng)能力差，其機(jī)體的免疫力主要來自母體［34］。因此，向幼畜飼料中添加磷壁酸酶制劑，與溶菌酶等抑菌物質(zhì)共同使用，不僅可以抑制一些致病菌的繁殖，同時也可以抑制一些革蘭氏陽性細(xì)菌磷壁酸的合成，從而達(dá)到保護(hù)幼畜的效果。磷壁酸酶制劑作為革蘭氏陽性細(xì)菌阻斷劑加入到飼料中，除了可以達(dá)到保護(hù)幼畜的效果外，還可以減少抗生素類藥物的使用，從而減少甚至避免動物肉制品中抗生素的殘留，對于無抗化養(yǎng)殖具有積極的意義。

磷壁酸酶用作飼用酶制劑，除了和其他飼用酶制劑一樣存在易變性失活的不足之外，還會在其作用特異性方面存在一些不理想的性質(zhì)。由于磷壁酸酶是作為革蘭氏陽性致病菌的阻斷劑而發(fā)揮作用，它降解細(xì)胞壁中的磷壁酸從而阻止革蘭氏陽性病原菌對宿主細(xì)胞的定植、黏附［33］，達(dá)到抑制病原菌繁殖的目的，在這個過程中磷壁酸酶也可能會不加選擇地對一些有益的革蘭氏陽性細(xì)菌如雙歧桿菌等產(chǎn)生抑制作用，從而對動物尤其是幼畜生長產(chǎn)生不利影響，因此，在磷壁酸酶飼用時需要對其進(jìn)行更深入的功效研究。

4 小結(jié)

磷壁酸酶自1982年由Kusse等［5］提出并命名后，至今并沒有得到其基因信息，在NCBI、KEGG、BRENDA等數(shù)據(jù)庫中也沒有關(guān)于磷壁酸酶基因和蛋白的相關(guān)信息。即便如此，我們也相信自然界肯定存在著可以特異性地降解磷壁酸的磷壁酸酶。雖然，磷壁酸酶作為酶制劑在動物飼料應(yīng)用方面存在著不足，但其在動物細(xì)菌性疾病預(yù)防方面有著極大的應(yīng)用潛力。而且，磷壁酸酶的發(fā)現(xiàn)不僅將會對細(xì)菌學(xué)研究產(chǎn)生重大的推動作用，對動物，尤其是幼畜動物的一些由革蘭氏陽性細(xì)菌引起的外傷感染的治療和食入性疾病的防范也有著十分重要的意義。同時，對減少動物養(yǎng)殖過程中抗生素類藥物的使用和降低動物肉制品中抗生素的殘留也有著一定的積極作用。因此，磷壁酸酶的發(fā)現(xiàn)，無論是在理論研究方面，還是實(shí)際應(yīng)用方面，都有著非常重大的意義。

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