試劑槽貯存酶免試劑對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

齊文娟，甄志軍，張志紅

試劑槽貯存酶免試劑對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

齊文娟，甄志軍，張志紅

目的：探討尤瑞納斯（Uranus）酶免分析儀試劑槽貯存不同時(shí)間的酶聯(lián)免疫（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑對(duì)丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）抗體檢測(cè)結(jié)果的影響。方法：將抗-HCV試劑采用Uranus試劑槽貯存，分別于0、7、14、21、28 d對(duì)HCV系列樣本進(jìn)行ELISA檢測(cè)，并對(duì)樣本吸光度（A）值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果：對(duì)于HCV抗體陰性樣本，貯存7 d內(nèi)的檢測(cè)結(jié)果較0 d無(wú)明顯變化（P＞0.05），自14 d開(kāi)始，A值逐漸升高（P＜0.05），至21～28 d均顯著高于0 d，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；而對(duì)于HCV抗體弱陽(yáng)性及陽(yáng)性樣本，自14 d開(kāi)始，檢測(cè)A值均顯著低于0 d（P＜0.01）。結(jié)論：抗-HCV試劑以試劑槽貯存至14 d對(duì)ELISA檢測(cè)結(jié)果有明顯影響，甚至導(dǎo)致弱陽(yáng)性樣本的漏檢。應(yīng)每7 d清洗試劑槽1次，并及時(shí)更換試劑。

貯存試劑；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定；丙型肝炎病毒

0 引言

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）是國(guó)家規(guī)定的獻(xiàn)血者篩查項(xiàng)目之一，間接酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是HCV抗體篩查的常用方法[1]，尤瑞納斯（Uranus）全自動(dòng)酶免分析系統(tǒng)（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“Uranus”）以高效率、循環(huán)進(jìn)樣、直觀、易操作等優(yōu)點(diǎn)用于ELISA檢測(cè)，很大程度上提高了血液檢測(cè)的質(zhì)量[2]，已普遍用于獻(xiàn)血者篩查項(xiàng)目的ELISA檢測(cè)。我站于2011年引進(jìn)U-ranus AE280，廠家建議試驗(yàn)后將剩余酶免試劑以試劑槽4℃貯存，但對(duì)于有效貯存期限未給出明確的指導(dǎo)意見(jiàn)。以往研究報(bào)道[3-4]，酶免試劑貯存不當(dāng)會(huì)使試劑檢測(cè)靈敏度下降，最終導(dǎo)致結(jié)果失控。為了探討試劑槽貯存酶免試劑對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，我們將血站用于獻(xiàn)血者HCV抗體檢測(cè)的酶免試劑以Uranus試劑槽貯存，對(duì)不同確定結(jié)果的系列樣本進(jìn)行ELISA檢測(cè)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣本

收集2012年11月至2013年11月無(wú)償獻(xiàn)血者血液樣本，經(jīng)2家HCV試劑盒檢測(cè)，陰性樣本20例，弱陽(yáng)性樣本（樣本值/臨界值（S/CO值）1～5）20例，陽(yáng)性樣本（S/CO值≥10）10例。其中，男39例，女11例。所有樣本均無(wú)溶血、乳糜、黃疸，3 200 r/min離心15 min，分離血漿后，小心吸取上層血漿于新的Eppendorf管內(nèi)，每管200 μL，每例樣本共分裝5管，置-20℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑

抗-HCV ELISA診斷試劑盒（國(guó)產(chǎn)某公司，批號(hào)：C20130508），經(jīng)中國(guó)藥品生物制品檢定所批檢合格；抗-HCV室內(nèi)質(zhì)控品，北京康徹思坦有限公司，批號(hào)為201303001，濃度為1 NCU/mL。所有試劑使用前經(jīng)過(guò)確認(rèn)，均在有效期內(nèi)。

1.3 主要儀器

Uranus AE280全自動(dòng)酶免分析系統(tǒng)（深圳愛(ài)康電子有限公司），臺(tái)式普通高速離心機(jī)（德國(guó)TECAN公司）。

1.4 方法

1.4.1 試劑準(zhǔn)備

將裝有HCV抗體的ELISA試劑盒由4℃冰箱取出，平衡至室溫（13～25℃），將HCV抗體試劑盒內(nèi)樣本稀釋液、酶結(jié)合物、底物A、底物B、終止液分別倒入相應(yīng)的Uranus試劑槽中，并放在相應(yīng)的位置。

1.4.2 樣本準(zhǔn)備

取50例凍存的系列HCV樣本，包括20例HCV陰性樣本、20例HCV弱陽(yáng)性樣本、10例HCV陽(yáng)性樣本，將樣本血漿于室溫復(fù)融，并平衡至室溫，實(shí)驗(yàn)前混勻。

1.4.3 實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按試劑說(shuō)明書(shū)，設(shè)定空白對(duì)照、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、弱陽(yáng)性室內(nèi)質(zhì)控孔，將系列HCV樣本進(jìn)行ELISA雙孔檢測(cè)，作為對(duì)照組（0 d）。在Uranus全自動(dòng)酶免分析系統(tǒng)中進(jìn)行稀釋、加樣、溫育、洗板、讀數(shù)，剩余試劑用Uranus試劑槽貯存置于4℃冰箱中，期間模擬日常實(shí)驗(yàn)時(shí)間將試劑槽取出于室溫放置，并依次于7、14、21、28 d的同一時(shí)間分別取50例系列HCV樣本進(jìn)行ELISA雙孔檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)均由同一操作人完成。

1.4.4 結(jié)果判斷

取雙孔的平均吸光度（A）值，S/CO值≥1.0判為陽(yáng)性，＜1.0判為陰性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料均以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）”表示，并進(jìn)行正態(tài)分布及方差齊性檢驗(yàn)，2組間的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

不同貯存時(shí)間的試劑槽貯存試劑對(duì)HCV抗體檢測(cè)A值的影響（±s）見(jiàn)表1。

表1 不同貯存時(shí)間的試劑槽貯存試劑對(duì)HCV抗體檢測(cè)A值的影響（±s）

表1 不同貯存時(shí)間的試劑槽貯存試劑對(duì)HCV抗體檢測(cè)A值的影響（±s）

注：*與0 d的比較，P＜0.05，有顯著差異；**與0 d的比較，P＜0.01，有極顯著差異

貯存時(shí)間/d HCV陰性 HCV弱陽(yáng)性 HCV陽(yáng)性00 0.007 6±0.001 7 0.430 4±0.057 4 3.021 3±0.555 5 07 0.007 4±0.001 3 0.429 6±0.055 3 3.068 6±0.502 4 14 0.008 9±0.003 6** 0.417 8±0.048 8** 2.801 9±0.445 3**21 0.021 7±0.005 8** 0.306 1±0.041 7** 2.155 9±0.424 0**28 0.056 3±0.072 6** 0.104 1±0.012 2** 1.040 2±0.309 5**

由表1可見(jiàn)，雖然所有HCV系列樣本以7 d內(nèi)的貯存試劑檢測(cè)，結(jié)果較0 d無(wú)明顯變化（P＞0.05），但自14 d后試劑槽貯存試劑對(duì)HCV抗體樣本的檢測(cè)A值的影響顯著：20例HCV抗體陰性樣本，自14d開(kāi)始，A值逐漸升高（P＜0.05），及至21 d均顯著高于0 d，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；貯存試劑對(duì)弱陽(yáng)性及陽(yáng)性血液樣本檢測(cè)結(jié)果的影響更顯著，20例HCV抗體弱陽(yáng)性樣本及10例陽(yáng)性樣本的檢測(cè)結(jié)果顯示：自14 d開(kāi)始，檢測(cè)樣本的A值隨試劑貯存時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低，均顯著低于0 d，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

3 討論

丙型肝炎是世界各國(guó)及地區(qū)共同面臨的嚴(yán)重傳染病，特別是經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)地區(qū)。HCV是造成輸血后肝炎的主要病因，經(jīng)血傳播是HCV傳播的主要途徑。全球已有1.17億人受到感染，我國(guó)有感染者大約4 000萬(wàn)，有相當(dāng)一部分慢性丙肝感染者會(huì)發(fā)展成肝硬化、肝癌，給家庭和社會(huì)造成沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[5-7]。因此，嚴(yán)把獻(xiàn)血者丙肝病毒感染檢測(cè)質(zhì)量關(guān)，是切斷輸血傳播丙型肝炎、保證臨床用血安全的關(guān)鍵。

目前，ELISA法測(cè)抗-HCV是我國(guó)大多采供血機(jī)構(gòu)用于獻(xiàn)血員篩查丙肝病毒傳染指標(biāo)的最主要方法[8]。根據(jù)《血站質(zhì)量規(guī)范》和《血站試驗(yàn)室質(zhì)量管理規(guī)范》的規(guī)定，為了保證檢測(cè)結(jié)果的可靠性，使酶免設(shè)備正常、高效地運(yùn)行，要求對(duì)設(shè)備建立和實(shí)施維護(hù)、校準(zhǔn)以及持續(xù)監(jiān)控等管理制度，針對(duì)設(shè)備的性能，制定完善而有層次的維護(hù)保養(yǎng)方案，對(duì)設(shè)備定期實(shí)施不同層面的維護(hù)保養(yǎng)[9]。本研究旨在通過(guò)探究酶免試劑的試劑槽貯存時(shí)間對(duì)于獻(xiàn)血者HCV抗體ELISA檢測(cè)結(jié)果的影響，明確實(shí)驗(yàn)室對(duì)Uranus全自動(dòng)酶免分析儀試劑槽的維護(hù)要求，為實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化設(shè)備維護(hù)程序提供數(shù)據(jù)支持。

研究顯示，國(guó)產(chǎn)抗-HCV試劑可以用Uranus試劑槽貯存7 d而不影響陰性樣本測(cè)定，自貯存14 d開(kāi)始，血液樣本的A值逐漸增高，直至28 d檢測(cè)結(jié)果幾乎接近“灰區(qū)”值（0.071～0.140），這表明試劑槽貯存試劑時(shí)間越長(zhǎng)，其HCV檢測(cè)的假陽(yáng)性率將越高，一定程度上使假陽(yáng)性樣本增加，血液報(bào)廢率提高，導(dǎo)致寶貴的血液資源浪費(fèi)。陰性樣本產(chǎn)生非特異性顯色的原因可能與試劑槽貯存的樣本稀釋液有關(guān)。樣本稀釋液一般由磷酸鹽緩沖液、牛血清白蛋白以及試劑穩(wěn)定劑等組成，其可以保證血漿樣本最合適的ELISA反應(yīng)環(huán)境及微量血漿樣本與聚乙烯包被孔接觸面積大小的一致性。良好的樣品稀釋液可有效降低非特異性反應(yīng)，提高ELISA檢測(cè)方法的敏感性和特異性，保證ELISA檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確[10]。在HCV試劑說(shuō)明書(shū)中，寫(xiě)明樣本稀釋液不宜長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中，每次使用樣本稀釋液后應(yīng)盡快蓋好瓶蓋，否則會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。試劑槽貯存的樣品稀釋液長(zhǎng)時(shí)間暴露于一般環(huán)境中，隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng)，試劑穩(wěn)定劑中的氨基酸、糖類(lèi)等有機(jī)物易受到空氣的氧化，可能會(huì)導(dǎo)致稀釋液pH的改變以及試劑中蛋白成分的變性，在ELISA檢測(cè)中不能發(fā)揮應(yīng)有的作用，產(chǎn)生非特異性反應(yīng)。另外，底物B對(duì)光敏感，底物溶液用試劑槽貯存一定時(shí)間后易變藍(lán)，使ELISA板底增高，影響測(cè)定結(jié)果。

特別值得關(guān)注的是，當(dāng)以試劑槽貯存試劑檢測(cè)HCV抗體弱陽(yáng)性和陽(yáng)性樣本時(shí)，自貯存的14 d開(kāi)始，樣本的A值隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低，特別是28 d后的弱陽(yáng)性樣本A值低于臨界值（0.140），這樣對(duì)處于臨界值水平的HCV樣本，增加結(jié)果判斷難度，稍有不慎，使樣本的檢測(cè)結(jié)果發(fā)生質(zhì)的改變，導(dǎo)致弱陽(yáng)性樣本的漏檢。這也表明試劑槽貯存的酶免試劑對(duì)弱陽(yáng)性、陽(yáng)性樣本的檢測(cè)結(jié)果仍有較大影響。對(duì)于此結(jié)果，研究者認(rèn)為可能由以下原因造成：一方面，在血站每個(gè)批次的樣本檢測(cè)中，從試劑平衡至室溫到實(shí)驗(yàn)結(jié)束放回4℃冰箱，每次實(shí)驗(yàn)試劑槽內(nèi)的試劑在室溫中的暴露時(shí)間為4～5 h，而且實(shí)驗(yàn)后只在試劑槽上加蓋一個(gè)自制的塑料蓋便放入4℃冰箱貯存。酶結(jié)合物經(jīng)反復(fù)使用，使貯存溫度不恒定，極易使酶的催化活性和抗體的免疫活性降低。另一方面，底物A易揮發(fā)，試劑槽內(nèi)的貯存試劑長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中，可引起底物A的濃度變化及底物B的分解。底物A的濃度過(guò)低或過(guò)高都會(huì)抑制酶促反應(yīng)[11]，造成試劑盒的底物敏感度和穩(wěn)定性降低，一定條件下可引起弱陽(yáng)性和陽(yáng)性樣本A值降低，從而導(dǎo)致接近臨界值樣本出現(xiàn)假陰性，以致陽(yáng)性樣本的漏檢，由此可能造成HCV通過(guò)輸血途徑傳播的嚴(yán)重后果。

綜上所述，用Uranus試劑槽貯存7 d內(nèi)HCV抗體試劑對(duì)于ELISA檢測(cè)結(jié)果并無(wú)影響。然而酶免試劑在經(jīng)過(guò)試劑槽貯存過(guò)程中會(huì)受到各種因素（如空氣、溫度、振蕩等）的影響，其試劑質(zhì)量會(huì)發(fā)生不同程度的變化，試劑盒內(nèi)任何一種組分不穩(wěn)定都會(huì)導(dǎo)致酶免檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生誤差，特別是酶結(jié)合物、底物等。因此，對(duì)全自動(dòng)酶免分析儀的試劑槽應(yīng)進(jìn)行周期性、多層次的維護(hù)保養(yǎng)[12]。一般進(jìn)口酶免分析儀的試劑槽配置為消耗性器材，采用1周更換1次的方法對(duì)試劑槽進(jìn)行維護(hù)[13-15]，而Uranus全自動(dòng)酶免分析儀的試劑槽為廠家固定配置器材，因此為了確保酶免試劑在獻(xiàn)血員血液篩檢中的高質(zhì)量使用，首先建立試劑槽維護(hù)和持續(xù)監(jiān)控等管理制度，并將維護(hù)保養(yǎng)方案寫(xiě)入實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理手冊(cè)。其次，切實(shí)實(shí)施試劑槽周維護(hù)制度，每周對(duì)Uranus試劑槽進(jìn)行1次一般維護(hù)，徹底清洗后，浸泡30 min后用純水沖洗干凈，將試劑槽倒扣于吸水紙上，實(shí)驗(yàn)前更換新試劑；每次維護(hù)時(shí)用棉簽徹底清潔試劑槽內(nèi)壁，特別是Uranus試劑槽為棕色壁，試劑變色不易察覺(jué)，如觀察擦拭后的棉簽上有藍(lán)色或其他雜質(zhì)，說(shuō)明該試劑槽中的試劑組分已變質(zhì)或已受污染，應(yīng)用純水浸泡過(guò)夜后徹底清洗干凈，并用紫外線照射消毒；每天使用前應(yīng)觀察槽中的試劑是否變色、渾濁等，如試劑外觀發(fā)生改變，立即按以上針對(duì)試劑槽污染程序的維護(hù)操作對(duì)其進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)換用備用的試劑槽。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要估計(jì)試劑用量，盡量減少試劑剩余量；使用后應(yīng)及時(shí)加蓋相應(yīng)的試劑槽蓋子并將試劑槽放人4℃冰箱貯存，并監(jiān)測(cè)和記錄冰箱溫度，防止溫度或其他因素對(duì)酶免試劑的質(zhì)量造成影響[16]，避免試劑槽貯存試劑帶來(lái)的系統(tǒng)誤差，保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確，確保臨床用血安全。本實(shí)驗(yàn)為模擬實(shí)驗(yàn)，設(shè)計(jì)還不夠完善，采用的血液樣本數(shù)量及選取的時(shí)間點(diǎn)偏少，研究結(jié)果有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

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（收稿：2014-03-06 修回：2014-06-11）

Influence of reagents stored in tank on ELISA results

QI Wen-juan,ZHEN Zhi-jun,ZHANG Zhi-hong
（Blood Center of Xingtai,Xingtai 054000,Hebei Province,China）

ObjectiveTo discuss the influences of reagents storage time in Uranus tank on ELISA results for HCV detec tion.MethodsAnti-HCV reagents were stored in Uranus tank,and then underwent ELISA detection 0,7,14,21 and 28 d after,and the absorbance(A)values were analyzed statistically.ResultsThe negative reagents to HCV antibody had A values 7 d after with no significant difference with those of 0 d(P＞0.05),and increased gradually 14 d after(P＜0.05), and significantly higher than those of 0 d(P＜0.01).The positive and weakly positive samples had A values significantly lower 14 d after than those of 0 d(P＜0.01).Conclusion It′s proved that 14 d reagent storage in Uranus tank may obviously influence the ELISA results and may even result in missed detection of weakly positive samples.The tank has to be cleaned once a week,and the reagents have to be replaced timely.[Chinese Medical Equipment Journal，2015，36（1）：87-89]

storage reagent;enzyme-linked immunosorbent assay;hepatitis C virus

R318.6；TH776

A

1003-8868（2015）01-0087-03

10.7687/J.ISSN1003-8868.2015.01.087

邢臺(tái)市科技支撐項(xiàng)目（2012ZC170）

齊文娟（1976—），女，主管技師，主要從事輸血檢驗(yàn)方面的研究工作，E-mail：qiwenjuan2002@163.com。

054000河北邢臺(tái)，邢臺(tái)市中心血站（齊文娟，甄志軍，張志紅）