響應(yīng)面法優(yōu)化小麥胚芽蛋白逆流脈沖超聲輔助提取技術(shù)

顧 婕 馬海樂 何榮海 劉雪姣

（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院江蘇省農(nóng)產(chǎn)品物理加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鎮(zhèn)江 212013）

響應(yīng)面法優(yōu)化小麥胚芽蛋白逆流脈沖超聲輔助提取技術(shù)

顧 婕 馬海樂 何榮海 劉雪姣

（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院江蘇省農(nóng)產(chǎn)品物理加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鎮(zhèn)江 212013）

研究小麥胚芽蛋白的超聲輔助提取工藝。以脫脂小麥胚芽為原料，采用堿溶酸沉－逆流脈沖超聲復(fù)合法提取其中的蛋白質(zhì)，考察超聲提取時(shí)間、料液溫度、脈沖超聲占空比、料液比等單因素對(duì)提取率的影響，確定出各因素最適取值范圍；進(jìn)一步采用響應(yīng)面法優(yōu)化工藝條件，得到小麥胚芽蛋白質(zhì)提取最佳工藝：超聲總時(shí)間為20 min，超聲溫度50℃、料液比為0.087 g/mL（1∶12）、占空比為0.625；研究表明，在此工藝條件下，蛋白質(zhì)提取率為86.59%，較傳統(tǒng)的一次堿提酸沉法提取率提高了49.06%。

超聲提取 小麥胚芽 響應(yīng)面法

2012年我國小麥產(chǎn)量超過1.2億t，約占糧食總產(chǎn)量的20%［1］。小麥胚芽是整個(gè)麥粒中營養(yǎng)價(jià)值最高的部分，脫脂麥胚（Defatted wheat germ）是小麥胚芽制油后的殘留物，含有大量優(yōu)質(zhì)蛋白以及谷胱甘肽等一些生理活性物質(zhì)［2］，可被應(yīng)用于增補(bǔ)食品中的蛋白質(zhì)、強(qiáng)化食品中的氨基酸［3］，還是一種制備活性多肽的重要原料。

國內(nèi)外很多研究人員利用堿溶酸沉法從脫脂小麥胚芽中分離出蛋白質(zhì)［4－7］。就小麥胚芽而言，因?yàn)楹屑s30%的淀粉，在提取過程中導(dǎo)致體系黏度增加，影響了蛋白質(zhì)的酸沉，回收率下降；同時(shí)在沉淀過程中許多淀粉也會(huì)隨之沉淀，致使蛋白純度較低。為此，馬海樂等［8］建立了“堿提＋α淀粉酶水解＋酸沉淀”分離小麥胚芽蛋白的新方法，使得小麥胚芽蛋白的純度和提取率顯著提高。但是蛋白質(zhì)的總得率還不很高，分析原因發(fā)現(xiàn)主要問題出現(xiàn)在堿提這一過程。為此，本研究提出利用逆流脈沖模式的超聲波在堿提環(huán)節(jié)促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶解，進(jìn)一步提高蛋白質(zhì)的提取率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥胚芽：河南省鯤華生物技術(shù)有限公司；α淀粉酶、氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈉及其他分析試劑：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FBTQ2000超聲輔助提取/反應(yīng)設(shè)備：無錫泛博生物工程有限公司；DDS738單相電子電能表：上海華立電表廠；UDK149全自動(dòng)凱氏定氮儀：意大利VELP公司；877 Titrino plus自動(dòng)電位滴定儀：瑞士Metrohm公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 小麥胚芽蛋白超聲輔助堿提基本工藝

稱取50 g脫脂小麥胚芽粉按料水比1∶10（m/V）配制，加入5 g NaCl，用1mol/LNaOH將溶液pH調(diào)至11.0，超聲輔助提取一定時(shí)間。隨后在5 000 r/min條件下離心20 min，取上清液。將上清液pH調(diào)至6.5，按酶與底物比為0.3%添加α淀粉酶，在50℃水浴中水解1 h，隨后沸水浴滅酶10 min，調(diào)pH值至4.0，待白色沉淀完全后，離心20 min，取沉淀，60℃恒溫干燥10 h，得到粗小麥胚芽蛋白。

超聲輔助提取/反應(yīng)設(shè)備為本課題組自主研制的逆流聚能探頭式超聲設(shè)備，逆流循環(huán)速度控制在150 r/min，料液溫度維持恒定。超聲探頭功率的測(cè)定為使用單相電子電能表測(cè)定超聲1 h電表讀數(shù)，測(cè)得實(shí)際功率為464 W。

1.3.2 超聲輔助提取單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

研究提取時(shí)間、料液溫度、脈沖超聲占空比、料液比4個(gè)單因素對(duì)小麥胚芽蛋白提取的影響。

提取時(shí)間：在料液比為1∶10、料液溫度為50℃、占空比0.625的前提下，設(shè)定提取時(shí)間為10、20、30、40、50 min。

料液溫度：在料液比為1∶10、占空比0.625、提取時(shí)間為最佳值的前提下，設(shè)定料液溫度為20、30、40、50、60℃。

脈沖超聲占空比的影響：在料液比為1∶10、提取時(shí)間和料液溫度為上一步確定的最佳值的前提下，設(shè)定占空比為 0.417（10∶14 s）、0.5（10∶10 s）、0.625（10∶6 s）、0.714（10∶4 s）、0.833（10∶2 s）。

料液比：在提取時(shí)間、料液溫度和占空比為最佳值的前提下，設(shè)定料液比為1∶6、1∶8、1∶10、1∶15、1∶20。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用方差分析篩選出對(duì)蛋白質(zhì)提取率影響較大的因素，采用Box－Behnken模型設(shè)計(jì)優(yōu)化試驗(yàn)方案。

1.3.4 粗蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定和提取率計(jì)算

粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)參照GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》凱氏定氮法，蛋白質(zhì)換算系數(shù)為5.83。蛋白質(zhì)的提取率計(jì)算：

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

超聲提取時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率和質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響如圖1所示。

圖1 不同超聲提取時(shí)間下的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)和提取率

由圖1可知，超聲提取20 min蛋白質(zhì)的提取率和質(zhì)量分?jǐn)?shù)就達(dá)到一個(gè)較高的水平。隨著提取時(shí)間的延長，蛋白質(zhì)含量基本穩(wěn)定，而且40 min后開始下降；而提取率有一定幅度的增長，到了40 min后也開始下降。組利用原子力顯微鏡觀察超聲波對(duì)酪蛋白以及玉米蛋白結(jié)構(gòu)影響研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，在處理前期，蛋白質(zhì)顆粒迅速細(xì)化，一定時(shí)間之后開始出現(xiàn)分子聚集現(xiàn)象，主要原因在于處理前期超聲波因?yàn)檎駝?dòng)引起蛋白顆粒疏松，傳質(zhì)效果改善；到了后期，超聲波開始導(dǎo)致蛋白質(zhì)疏水鍵外露，疏水性增加，溶出的蛋白分子出現(xiàn)聚集，溶解度變差［9－11］。20 min之后蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)基本穩(wěn)定，盡管提取率還在增加，但幅度很小，所以選取超聲提取時(shí)間為20 min。

2.1.2 料液溫度對(duì)提取率的影響

料液超聲溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率和質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響如圖2所示。

圖2 不同超聲溫度下的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)和提取率

由圖2可知，隨著溫度升高，蛋白質(zhì)提取率逐步增高，在50℃達(dá)到最大值，隨后下降。分析原因，隨著溫度升高，體系中各組分之間充分接觸，增加了超聲所引起的熱效應(yīng)和空化效應(yīng)，便于蛋白質(zhì)從組分中脫離，蛋白質(zhì)的提取率得到增高。另一方面，隨著溫度增高，部分蛋白質(zhì)隨之變性，影響了蛋白質(zhì)的溶解性，使之提取率下降，同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)營養(yǎng)性質(zhì)的破壞［12－13］。由超聲的物理特性可知，隨著溫度的增加，表面張力系數(shù)（σ）及黏滯系數(shù)（η）下降，空化閾值下降，使空化泡的產(chǎn)生變得容易，空化效應(yīng)加強(qiáng)，引起提取率上升；但當(dāng)溫度進(jìn)一步增加，蒸汽壓（Pv）增高幅度增加，空化強(qiáng)度或空化效應(yīng)下降，導(dǎo)致提取率下降［14］。選擇50℃為最佳提取溫度。

2.1.3 脈沖超聲占空比對(duì)提取率的影響

占空比是指1 min內(nèi)，超聲作用時(shí)間所占的比例。占空比反映的是超聲波連續(xù)工作的時(shí)間［15］。占空比對(duì)蛋白質(zhì)提取率和質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響見圖3。

如圖3所示，低占空比條件下提取率較低，主要原因是相對(duì)于工作時(shí)間而言間歇時(shí)間過長，不僅是液體受到超聲處理的絕對(duì)時(shí)間較短，更重要的是上一個(gè)脈沖施加給處理對(duì)象的應(yīng)力已經(jīng)完全恢復(fù)，才受到再次超聲脈沖的沖擊，因此促溶效果不很顯著。隨著占空比增加，超聲波實(shí)際發(fā)射超聲波信號(hào)的時(shí)間得到延長，空化效應(yīng)增強(qiáng)［16］，提取率和質(zhì)量分?jǐn)?shù)也有所增加，在占空比達(dá)到0.625即超聲時(shí)間工作10 s，間歇6 s時(shí)，提取率和質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最大值；再增加占空比就使得反應(yīng)體系內(nèi)溫度增高，蒸汽壓（Pv）增高幅度增加，空化強(qiáng)度或空化效應(yīng)下降，導(dǎo)致提取率下降。據(jù)此，最佳提取占空比為0.625。

圖3 不同超聲占空比下的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)和提取率

2.1.4 料液比對(duì)提取率的影響

由圖4可知，隨著料液比減小，小麥胚芽蛋白提取率先增加后降低，在料液比為1∶10的時(shí)候提取率達(dá)到最高。這是因?yàn)殡S著料液比的減小，溶劑量加大，溶解溶質(zhì)的能力自然增加。但隨著料液比的進(jìn)一步下降，溶液愈來愈稀，其黏滯系數(shù)η和表面張力系數(shù)σ降低，導(dǎo)致超聲波要求的空化閾值雖然減少，但是空化泡崩潰時(shí)伴隨產(chǎn)生的最大溫度Tmax與最大壓力Pmax值也會(huì)降低，空化效果降低，因此提取率降低［17］。而蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著料液比增加逐步增加，趨于平衡。由于料液比增加需要的生產(chǎn)成本也會(huì)增加，所以選擇料液比1∶10比較合適。

圖4 不同料液比下的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)和提取率

2.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，超聲輔助提取時(shí)間在20 min，溫度為50℃，料液比為1∶10，超聲占空比為0.625時(shí)小麥胚芽蛋白提取率最大。通過SPSS單因素分析，溫度、料液比、占空比對(duì)提取率影響較大，選擇這3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，超聲提取時(shí)間固定為20 min。試驗(yàn)因素和水平見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)以及結(jié)果見表2。

表1 Box－Benhnken中心組合設(shè)計(jì)的因素和水平表

表2 Box－Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.2.1 數(shù)值模型方程

用Design－Expert8.0.6軟件對(duì)表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，建立蛋白提取率（Y）的二階響應(yīng)回歸模型，進(jìn)而分析各試驗(yàn)因素X對(duì)于響應(yīng)值Y的影響。小麥胚芽蛋白提取率的回歸方程如下：

2.2.2 回歸與方差分析

回歸模型方差分析結(jié)果見表3。

表3 方差分析表結(jié)果

由表3可知，模型P＜0.000 1，本研究所得回歸模型極其顯著。模型Radj2＝0.953 3，該模型可以解釋95.33%響應(yīng)值的變化，因此模型與實(shí)際擬合較好。模型一次項(xiàng)X1，X2，二次型X12對(duì)響應(yīng)值蛋白質(zhì)提取率Y影響極其顯著（P＜0.000 1）；二次型對(duì)響應(yīng)值影響顯著（P＜0.05）；3個(gè)因素對(duì)蛋白質(zhì)提取率影響依次為X2＞X1＞X3，即料液比＞超聲溫度＞超聲占空比；交互項(xiàng)X1X2對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響顯著；X1X3，X2X3對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響不顯著；結(jié)果表明，各因素對(duì)小麥胚芽蛋白質(zhì)提取率影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

2.2.3 響應(yīng)面因素交互作用分析

圖5 各因素交互作用對(duì)提取率影響的響應(yīng)面及等高線圖

圖5為各個(gè)因子交互作用的響應(yīng)面3D和等值線分析圖。從響應(yīng)面的最高點(diǎn)和等值線可以看出，在所選的范圍內(nèi)存在極值，既是響應(yīng)面的最高點(diǎn)，同時(shí)也是等值線最小橢圓的中心點(diǎn)［18］。由圖5a可知，蛋白質(zhì)提取率隨著料液比和溫度呈現(xiàn)增加后下降的趨勢(shì)，等高線逐步呈現(xiàn)橢圓形，說明X1X2交互作用較強(qiáng)，編碼值較大的X1和X2的響應(yīng)值較低，可能是因?yàn)殡S著溫度和料液比增加，溶劑體系內(nèi)部滲透壓達(dá)到了動(dòng)態(tài)平衡，且伴隨著熱效應(yīng)產(chǎn)生，蛋白質(zhì)發(fā)生變形，從而提取率降低［19］。由圖5b可知，隨著溫度和占空比增加，蛋白質(zhì)提取率均呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，二者等高線是圓形，說明X1X3交互不明顯。由圖5c可知，隨著料液比和占空比增加，蛋白質(zhì)提取率有緩慢下降趨勢(shì)，二者等高線是明顯圓形，X2X3交互不明顯。

2.2.4 數(shù)值模型驗(yàn)證

通過響應(yīng)面軟件分析得出小麥胚芽蛋白提取最佳條件為：超聲溫度49℃、料液比為0.087 g/mL（1∶12）、占空比為0.609，蛋白質(zhì)提取率的預(yù)測(cè)值為87.18%。將最佳條件修正為溫度50℃、料液比為0.087 g/mL（1∶12）、占空比為 0.625即超聲 10 s，間歇6 s，在此條件下提取小麥胚芽蛋白，實(shí)際提取率為86.59%，產(chǎn)品中蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為68.90%，提取率與理論預(yù)測(cè)值相比相對(duì)誤差＜5%。因此，該模型能較好預(yù)測(cè)實(shí)際小麥胚芽蛋白質(zhì)提取率，有實(shí)用價(jià)值。

2.2.5 對(duì)照試驗(yàn)及結(jié)果分析

根據(jù)1.3.1方法采用不加超聲的傳統(tǒng)堿溶酸沉提取方法進(jìn)行小麥胚芽蛋白的提取試驗(yàn)，將20 min的超聲波輔助提取改為30 min的磁力攪拌提取，將試驗(yàn)結(jié)果與本研究最佳條件下所得結(jié)果進(jìn)行對(duì)照。傳統(tǒng)一次堿提酸沉所得到的麥胚蛋白提取率為58.09%，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為72.24%。相比之下，采用超聲輔助提取法蛋白質(zhì)的提取率提高了49.06%，因此是一種可取的方法。

3 結(jié)論

采用堿溶酸沉－逆流超聲復(fù)合法提取麥胚蛋白，結(jié)果證明超聲作用效果明顯，蛋白質(zhì)提取率得到明顯提高。試驗(yàn)表明影響蛋白質(zhì)提取率的因素順序?yàn)榱弦罕龋境暅囟龋境曊伎毡?。在單因子試?yàn)基礎(chǔ)上，將響應(yīng)面方法應(yīng)用到逆流超聲輔助提取小麥胚芽蛋白的提取工藝的優(yōu)化。在總超聲時(shí)間20 min下，確定了最佳工藝條件：超聲溫度50℃、料液比為 0.087 g/mL（1∶12）、占空比為 0.625。響應(yīng)面的預(yù)測(cè)值為87.18%。蛋白質(zhì)實(shí)際提取率為86.59%，較傳統(tǒng)的一次堿提酸沉法提取率提高了49.06%。

［1］國家統(tǒng)計(jì)局：中華人民共和國2012年國民經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展統(tǒng)計(jì)公報(bào).［2013－01－08］.http：//www.stats.gov.cn/tjsj/tjgb/ndtjgb/qgndtjgb/201302/t20130221_30027.html

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Optimization of Ultrasonic Extraction of Protein from Defatted Wheat Germ by Response Surface Methodology

Gu Jie Ma Haile He Ronghai Liu Xuejiao
（Jiangsu Provincial Key Laboratory for Physical Processing of Agricultural Products，F(xiàn)ood and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013）

The study was aimed to establish an optimized method by ultrasonic pretreatment to prepare DWGP.In the experimentof the paper，protein isolates have been prepared from defatted wheatgerm（DWG）by alkaline extraction and isoelectric precipitation combined with ultrasonic pretreatment.Ultrasonic time，ultrasonic temperature，pulsemode and solid－to－solvent ratiowere inspected respectively as every single factor to determine the optimal value for experiment.Then Response Surface Methodology（RSM）was used to optimize extraction conditions to calculate maximum extraction efficiency.The results showed that the optimum extraction conditions were：ultrasonic time of 20 min，ultrasonic temperature at50℃，solid－to－solvent ratio at1∶12，pulsemode as10 s on and 6 s off.On the conditions，the average protein recovery was86.59%，which almost fitted themodel calculation value 87.18%.Compared with traditional alkaline extraction and isoelectric precipitation，the protein recovery was increased by 49.06%.

ultrasonic extraction，defatted wheat germ，response surfacemethodology

TS210.9

A

1003－0174（2015）08－0019－05

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科技專項(xiàng)（201303071），國家863計(jì)劃（2013AA102203）

2014－03－24

顧婕，女，1989年出生，碩士，食品物理加工

馬海樂，男，1963年出生，教授，食品物理加工