載藥磁納米微粒在荷瘤小鼠體內(nèi)的靶向性實(shí)驗(yàn)研究

胡　瑛，郝　歡，秦　慶，于增國

載藥磁納米微粒在荷瘤小鼠體內(nèi)的靶向性實(shí)驗(yàn)研究

胡瑛，郝歡，秦慶，于增國

目的：應(yīng)用高效液相色譜法考察在外磁場協(xié)同下載阿霉素金磁復(fù)合微粒于荷瘤小鼠體內(nèi)靶向分布特性。方法：建立小鼠肝細(xì)胞癌動(dòng)物模型，并分成空白對(duì)照組、單純磁阿霉素組和磁阿霉素加磁場組?？瞻讓?duì)照組經(jīng)尾緣靜脈注射生理鹽水，單純磁阿霉素組和磁阿霉素加磁場組分別注射同等劑量的載阿霉素金磁復(fù)合微粒溶液，注射后于磁阿霉素加磁場組腫瘤靶區(qū)體表施加磁場固定（5 000 Gs、1 h）。然后移去磁場并立即處死各組小鼠，分別采集血液并完整摘取心、肝、腎和腫瘤組織標(biāo)本。應(yīng)用高效液相色譜法測定各組小鼠血液及各組織中阿霉素濃度，評(píng)價(jià)其在小鼠體內(nèi)的靶向性。結(jié)果：經(jīng)外置磁場固定作用后，靶區(qū)腫瘤組織中阿霉素濃度明顯高于其他非靶區(qū)組織，而其他非靶區(qū)組織中（除心臟外）阿霉素濃度與空白對(duì)照組相當(dāng)。在沒有外置磁場作用時(shí)，阿霉素則在體內(nèi)各組織中呈彌散性分布，但肝臟和腫瘤組織中阿霉素濃度較高。結(jié)論：磁納米微粒作為藥物載體具有明顯的磁控靶向性，能將藥物有效富聚于靶區(qū)腫瘤組織中。磁靶向藥物有望成為最有效的抗腫瘤藥物新劑型而用于臨床。

磁靶向給藥系統(tǒng)；肝細(xì)胞癌；阿霉素；金磁復(fù)合微粒；高效液相色譜法

0　引言

近年來，隨著藥物靶向治療惡性腫瘤技術(shù)的不斷研究與探索，誕生了一種以磁納米材料為藥物載體的新型靶向給藥系統(tǒng)——磁靶向給藥系統(tǒng)（magnetic targeted drugs delivery system，MTDS）[1]。該給藥系統(tǒng)既有固體材料的強(qiáng)磁性，又具有液體材料的流動(dòng)性，能在體外磁場導(dǎo)向作用下實(shí)現(xiàn)其靶向性作用，改變藥物在腫瘤組織與非腫瘤組織間的分布，最大限度地將藥物精確控制在靶區(qū)腫瘤組織中，并在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平上發(fā)揮藥效作用，從而達(dá)到提高化療效果和降低毒副作用的目的[2-3]。為考察載阿霉素金磁復(fù)合微粒的靶向性，本文建立了以高效液相色譜法測定荷瘤小鼠血液及各組織器官中阿霉素濃度的方法，并對(duì)其在外磁場協(xié)同作用下的體內(nèi)靶向分布特性進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1試藥

納米金磁復(fù)合微粒（規(guī)格：30 μm，西安金磁納米生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品）；阿霉素（北京華鋒有限公司產(chǎn)品）；載阿霉素金磁復(fù)合微粒溶液（載藥量：10.12%，按西安金磁納米生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品配方制備）；甲醇、乙腈均為色譜純。

1.1.2儀器

高效液相色譜儀（1100型），包括四元梯度泵、二極管陣列檢測器、G137PA自動(dòng)脫氣機(jī)、色譜工作站（日本島津公司）等；KG21E型低溫冰箱（德國Siemens公司）；臺(tái)式微量離心機(jī)（德國Thermo公司）；WH-1漩渦振蕩器（上海滬西分析儀器廠）；鉚鐵硼稀土永久磁鐵（規(guī)格：10 mm（直徑）×10 mm（高）圓柱體；磁場強(qiáng)度為5 000 Gs，西安金磁納米生物技術(shù)有限公司提供）。

1.1.3動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)采用大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的健康昆明種小鼠30只，雌雄兼有，體質(zhì)量18～22 g。

1.2方法

1.2.1荷瘤小鼠模型的建立

無菌條件下，抽取接種7 d的肝癌（H22）小鼠腹水細(xì)胞（即指數(shù)增殖期肝癌細(xì)胞），于顯微鏡下計(jì)數(shù)并用生理鹽水將其稀釋至l×107個(gè)/ml肝癌細(xì)胞懸液，然后將肝癌細(xì)胞懸液按0.15 ml/只接種至小鼠右前肢腋部皮下。正常條件下飼養(yǎng)，待接種7 d后即可見小鼠腋下實(shí)體瘤形成，用游標(biāo)卡尺測量瘤體的長徑，達(dá)到1.0 cm左右即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)（如圖1、2所示）。

圖1　小鼠肝癌腹水細(xì)胞腋下接種

圖2　1周后在腋下體表可見腫瘤凸起

1.2.2荷瘤小鼠體內(nèi)靶向性實(shí)驗(yàn)

將30只瘤體長徑約1.0 cm左右的荷瘤小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、單純磁阿霉素組和磁阿霉素加磁場組，每組10只。其中空白對(duì)照組經(jīng)尾緣靜脈注射生理鹽水0.15 ml；單純磁阿霉素組和磁阿霉素加磁場組各注射同等劑量載阿霉素金磁復(fù)合微粒溶液0.15 ml（10 mg/ml，相當(dāng)于阿霉素0.82 mg/ml）。注射后，即刻將磁阿霉素加磁場組小鼠用戊巴比妥鈉麻醉，并在體表腫瘤靶區(qū)部位施加磁場（5 000 Gs）固定（如圖3、4所示）。1 h后移去磁場，將各組小鼠立即處死，并分別采集小鼠血液，完整摘取心臟、肝、腎和腫瘤組織（如圖5所示），置液氮中保存。

圖3　小鼠尾緣靜脈注射給藥

圖4　小鼠腫瘤部位磁鐵固定方法

圖5　處死小鼠并摘取腫瘤組織

1.2.3荷瘤小鼠血液、心臟、肝、腎和腫瘤組織中的阿霉素含量測定

（1）色譜前樣品預(yù)處理：①血液樣品前處理：將采集的小鼠全血制備成肝素抗凝血，以5 000 r/min離心5 min，取上清血漿200 μl，加入甲醇200 μl，漩渦振蕩混勻1 min；預(yù)處理后，取50 μl進(jìn)樣。②組織樣品的處理：取出小鼠腫瘤、心臟、肝、腎待檢組織，用生理鹽水將殘血洗凈，吸干并稱重，研磨成粉，加入組織質(zhì)量4倍的生理鹽水制成組織勻漿；取組織勻漿200 μl加入甲醇200 μl，漩渦振蕩混勻1 min；預(yù)處理后取50 μl進(jìn)樣。

（2）色譜條件：①色譜柱ZorbaxSB-C18（250mm× 4.6 mm，5 μm）；②柱溫25℃；③流動(dòng)相：乙腈-0.1%乙酸（28∶72，v/v）；④流速0.8 ml/min；⑤檢測波長：254 μm；⑥進(jìn)樣量50 μl。

（3）阿霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：200 μg/ml甲醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4℃保存。

（4）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：應(yīng)用甲醇（色譜純）將阿霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液依次稀釋成100、10、1、0.5、0.1、0.05μg/L的標(biāo)準(zhǔn)阿霉素應(yīng)用液各50 μl。在150 μl空白血漿或空白組織提取液中加入阿霉素標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液，配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液。經(jīng)色譜前預(yù)處理后，進(jìn)樣測定，記錄色譜。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，阿霉素濃度（X）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：Y=27 697X+5 756.8，R2= 0.999 5。樣品濃度線性范圍為50～1 000 ng/ml，最低檢測限為5 ng/ml（S/N=3）。

1.2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有原始數(shù)據(jù)輸入計(jì)算機(jī)中，應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，當(dāng)P＜0.01時(shí)有顯著差異。

2　結(jié)果

荷瘤小鼠血液、主要器官和腫瘤組織中阿霉素濃度比較結(jié)果見表1。

表1　小鼠血液、主要器官和腫瘤組織中阿霉素濃度比較（±s）ng/ml

表1　小鼠血液、主要器官和腫瘤組織中阿霉素濃度比較（±s）ng/ml

注：*表示與生理鹽水組比較，**表示與單純磁阿霉素組比較

組別　血液　腫瘤　心臟　腎臟　肝臟生理鹽水　11.25±0.55*004.41±0.42**　0.66±0.13*07.16±0.68*07.89±0.25*單純磁阿霉素32.02±0.78*093.12±2.13**　4.27±0.25*11.53±0.43*62.32±1.95*磁阿霉素加磁場12.29±0.47*143.84±2.45**　4.68±1.02*07.42±0.29*08.89±1.07*F　1 652.140　7 360.078　65.431 33　125.746 4　6 268.339 P　00 00.000　00 00.000　00.000 00　000.0000　00 00.000

由表1可以看出，在血液中，單純磁阿霉素組的藥物濃度明顯高于磁阿霉素加磁場組，而磁阿霉素加磁場組與生理鹽水組相當(dāng)；腫瘤組織中，磁阿霉素加磁場組的藥物濃度遠(yuǎn)高于單純磁阿霉素組，單純磁阿霉素組的藥物濃度亦明顯高于生理鹽水組；心臟組織中，單純磁阿霉素組與磁阿霉素加磁場組間的藥物濃度相當(dāng)，且2組均高于生理鹽水組；腎臟組織中，單純磁阿霉素組藥物濃度略高于磁阿霉素加磁場組，磁阿霉素加磁場組與生理鹽水組相當(dāng)；肝臟組織中，單純磁阿霉素組的藥物濃度明顯高于磁阿霉素加磁場組，磁阿霉素加磁場組與生理鹽水組間無差異。

3　討論

眾多研究表明，以磁納米微粒作為藥物載體的MTDS因其具有傳統(tǒng)藥物輸送體系所不具備的諸如在外磁場作用下的良好靶向性、減少用藥劑量及毒副作用等獨(dú)特優(yōu)勢，而受到全球醫(yī)藥界的普遍關(guān)注與高度重視，已成為靶向抗腫瘤藥物新劑型的研究熱點(diǎn)[4-7]。

本實(shí)驗(yàn)研究顯示（見表1），當(dāng)載阿霉素金磁復(fù)合微粒聯(lián)合外磁場給藥后，其靶區(qū)腫瘤組織中的阿霉素濃度較比其他非靶向組織顯著增高（P=0.000），亦遠(yuǎn)高于單純載阿霉素金磁復(fù)合微粒給藥時(shí)腫瘤組織中阿霉素濃度（P=0.000）。而其他非靶向組織中（除心臟外）阿霉素濃度卻明顯低于單純載阿霉素金磁復(fù)合微粒給藥，并與生理鹽水組相當(dāng)。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，以磁納米微粒作為藥物載體的磁靶向藥物具有極強(qiáng)的磁響應(yīng)性，能在外磁場協(xié)同作用下形成物理靶向[8]，有效地將藥物聚集于靶區(qū)腫瘤組織中，顯著提高了藥物濃度并最大限度地在病灶靶部位發(fā)揮抗腫瘤作用。而且還能大幅度地改變藥物在體內(nèi)的分布狀態(tài)，使非靶向組織中的藥物含量得以極大的降低，有效地減小了藥物的毒副作用。因此，相比于傳統(tǒng)化療的給藥方式，磁靶向給藥系統(tǒng)的應(yīng)用將會(huì)獲得更加理想的抗腫瘤效果。

當(dāng)單純給予載阿霉素金磁復(fù)合微粒而無外磁場協(xié)同作用時(shí)，藥物則彌散分布在荷瘤小鼠的各組織中（見表1），表明載阿霉素金磁復(fù)合微粒在體內(nèi)具有良好的組織擴(kuò)散性與滲透性，這種特性不僅保證了載藥磁性微粒在體內(nèi)不發(fā)生聚集、不堵塞血管，并能均勻擴(kuò)散到腫瘤組織中[9]，這對(duì)提高藥物的抗腫瘤效果是非常關(guān)鍵的。但從我們的實(shí)驗(yàn)中可以看出，阿霉素在荷瘤小鼠體內(nèi)各組織器官及血液中的分布亦不相同，其腫瘤、肝臟、血液、腎臟、心臟組織中的阿霉素濃度呈依次性減低，即腫瘤和肝臟中的阿霉素濃度明顯高于血液及其他組織。腫瘤組織中阿霉素濃度增高，表明載阿霉素金磁復(fù)合微粒除具有良好的靶向性外，對(duì)腫瘤組織具有一定的選擇性[10]，并且腫瘤組織中血管密度較高，可達(dá)正常肝臟的2～6倍[11]，這是導(dǎo)致腫瘤組織中阿霉素濃度遠(yuǎn)高于正常肝臟及其他組織的主要原因。肝臟組織中阿霉素濃度高于血液及其他組織，與藥物主要在肝臟中進(jìn)行代謝以及肝臟中單核巨噬細(xì)胞豐富，使更多的載阿霉素金磁復(fù)合微粒被攔截或吞噬有關(guān)[12]。

此外，從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，在外置磁場的協(xié)同作用下心臟組織中阿霉素濃度與沒有外置磁場作用而單純磁阿霉素給藥時(shí)的藥物濃度相當(dāng)，且兩者均明顯高于生理鹽水對(duì)照組，分析造成這一結(jié)果的主要原因，是由于心臟距離外置固定磁體較近所形成的非特異靶向性所致。

總之，通過對(duì)本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果的直觀分析與靶向性評(píng)價(jià)，表明以磁納米微粒作為藥物載體所構(gòu)建的磁靶向藥物，能在外磁場作用下顯示出獨(dú)特磁響應(yīng)性、良好靶向可控性和組織擴(kuò)散性等諸多優(yōu)勢，有望成為最理想的抗腫瘤藥物新劑型應(yīng)用于臨床。

[1]張景京力，張志榮，譚群友.磁靶向給藥系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2001，32（12）：564-567.

[2]成黨校，唐敏章.阿霉素磁微球的制備及在家兔肺內(nèi)的靶向定位[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，1996，17（1）：39-41.

[3]趙玉瑩，謝忠艷，薛凡.磁性藥物微球治療惡性腫瘤的進(jìn)展[J].黑龍江醫(yī)學(xué)，2010，34（10）：745-748.

[4]王艷萍，徐維平，蘇育德，等.納米磁性材料在腫瘤治療中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2012，8（3）：183-184.

[5]Hofman M A，Purba J S，Swaab D F.Annual variations in the vasopressin neuron population of the human suprachiasmatic nucleus[J]. Neuroscience，1999，53（4）：1 103-1 112.

[6]凌麗，張武雄，朱亮.抗腫瘤靶向微粒給藥系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，26（1）：107-110.

[7]趙志娟，丁紅，羅斌華.肺靶向多柔比星微球小鼠體內(nèi)組織分布特性研究[J].中國藥學(xué)雜志，2012，47（5）：354-357.

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[8]何強(qiáng)芳，李國明，朱潔民.磁性氟尿嘧啶殼聚糖微球的制備及其釋藥性能[J].應(yīng)用化學(xué)，2006，23（2）：209-211.

[9]李艷，趙玲，路西明，等.磁性微粒靶向給藥系統(tǒng)治療消化道惡性腫瘤的基礎(chǔ)研究與臨床初探[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2006，23（9）：925-928.

[10]龔連生，張德陽，劉恕.磁性阿霉素白蛋白納米粒在移植性肝癌模型中的磁靶向性[J].中華肝膽外科雜志，2003，9（9）：543-546.

[11]Ensminger W D，Gyves J W.Regional cancer chemotherapy[J].Cancer Treat Rep，1984，68：101-105.

[12]葉鵬，宋金春，李娟.氟尿嘧啶脂質(zhì)體在小鼠體內(nèi)的組織分布及靶向性評(píng)價(jià)研究[J].中國藥房，2011，22（13）：1 168-1 170.

（收稿：2015-01-20修回：2015-06-01）

Targeting experiment of drug-bearing magnetic nano-particle in tumor-bearing mice

HU Ying1,HAO Huan2,QIN Qing1,YU Zeng-guo2
（1.Department of Clinical Laboratory,the 210th Hospital of the PLA，Dalian 116021,Liaoning Province,China; 2.Medical College of Dalian University,Dalian 116622,Liaoning Province,China）

Objective To investigate the targeting distribution of adriamycin-bearing gold magnetic particle in the tumorbearing mice by using high-performance liquid chromatography and external magnetic field.Methods Mouse hepatocellular carcinoma models were established and then divided into a control group(group A),a group with adriamycin-bearing magnetic nano-particles(group B)and a group with external field and adriamycin-bearing magnetic nano-particles(group C).The mice in group A were administrated with physiological saline in the tail veins,and the ones in group B and C were infused with the solution of adriamycin-bearing gold magnetic particles.Some external magnetic field(5 000 Gs,1 h) was posed on the target areas of the mice in group C and then removed after a while.All the mice in the three groups were killed,and the blood and the specimens of the hearts,livers,kidneys and tumor tissues were collected.The concentrations of adriamycin in the blood and tissues were detected with high-performance liquid chromatography to evaluate in vivo targeted distribution in mice.Results External field made the adriamycin concentrations in the targeted tumor areas significantly higher than those in non-targeted areas,and the non-targeted areas except the heart had the concentrations equivalent to those in the control group.When the external field was absent,adriamycin had diffused distribution in the tissues while high concentrations in the liver and tumor tissues.Conclusion Magnetic nano-particle shows magnetically controlled targeting when used as drug-bearing carrier and can concentrate the drug in the targeted tumor tissues.Magnetically targeted drug may be popularized clinically as a new-type antineoplastic agent.[Chinese Medical Equipment Journal，2015，36（10）：14-16，20]

magnetic targeted drugs delivery system;hepatocellular carcinoma;adriamycin;gold magnetic nano-particle; high-performance liquid chromatography

[中國圖書資料分類號(hào)]R318；R730.53A

1003-8868（2015）10-0014-04

10.7687/J.ISSN1003-8868.2015.10.014

2014遼寧?。▏遥┐髮W(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201411258）

胡瑛（1983—），女，主管檢驗(yàn)師，主要從事檢驗(yàn)診斷學(xué)方面的研究工作，E-mail：huying_may@163.com。

116021遼寧大連，解放軍210醫(yī)院檢驗(yàn)科（胡瑛，秦慶）；116622遼寧大連，大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院（郝歡，于增國）

于增國，E-mail：yuzengguo@163.com