二氮嗪對大鼠腦缺血再灌注后ZO－1和Claudin－5蛋白表達(dá)的影響

何平平 張 鴻 孫 淼

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，沈陽110004）

缺血性腦血管病是嚴(yán)重威脅人類健康的高發(fā)疾病之一，有著較高的致死率和致殘率，傳統(tǒng)的治療是將缺血后神經(jīng)元的保護(hù)作為靶向目標(biāo)，隨著“神經(jīng)血管單元”的概念在2001年被首次提出后，將神經(jīng)元、血腦屏障、膠質(zhì)細(xì)胞作為有機(jī)整體在發(fā)生缺血損傷后進(jìn)行保護(hù)成為新的研究熱點(diǎn)。

血腦屏障 （blood brain barrier，BBB）作為神經(jīng)血管單元的核心結(jié)構(gòu)，在限制和調(diào)節(jié)血漿組分與腦組織間相互交流中發(fā)揮關(guān)鍵作用。隨著分子生物學(xué)的進(jìn)展，Brightman等提出緊密連接（tight junction，TJ）在血腦屏障中發(fā)揮著核心作用，其功能包括加強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞間連接、封閉細(xì)胞間隙、調(diào)整各種物質(zhì)擴(kuò)散、參與細(xì)胞生長分化的信號的傳遞等。其中，Claudin－5及ZO－1是TJ的主要結(jié)構(gòu)蛋白，其表達(dá)水平的變化與腦微血管通透性的改變及腦水腫的程度密切相關(guān)。

我們在前期的實(shí)驗(yàn)中證明KATP通道激活可以通過調(diào)控多條信號通路對缺血后神經(jīng)元損傷發(fā)揮保護(hù)作用［1－4］，實(shí)驗(yàn)通過制作大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注（I／R）模型，觀察線粒體KATP通道特異性開放劑二氮嗪對缺血再灌注損傷后血腦屏障緊密連接的保護(hù)作用。

材料和方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar大鼠30只，♂，體重（300±20）g，普通級，由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

2.主要試劑

一抗由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供，S－P免疫組化超敏試劑盒由福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司提供，DAB顯色劑及WB二抗由武漢博士德公司提供。

3.方法

3.1 動(dòng)物分組及模型制作

Wistar大鼠隨機(jī)分為三組：假手術(shù)組、缺血再灌注組（I／R）、二氮嗪預(yù)處理組，每組各10只。二氮嗪預(yù)處理組在缺血前連續(xù)7天給予二氮嗪（20 mg／kg）腹腔內(nèi)注射。假手術(shù)組每日行同體積生理鹽水溶液腹腔注射。給藥停止后，應(yīng)用Longa線栓法制備腦缺血模型，具體步驟如下：大鼠腹腔注射10%水合氯醛 （3ml／kg），麻醉后，將大鼠仰臥位固定在手術(shù)臺上行頸部脫毛，常規(guī)消毒后在頸部正中切口，分離皮下組織，充分暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA）、頸外動(dòng)脈（ECA）、頸內(nèi)動(dòng)脈 （ICA）。在ECA與CCA分叉處結(jié)扎ECA，線栓采用直徑為0.26mm、頭端圓鈍涂有肝素的尼龍魚線，魚線經(jīng)CCA進(jìn)入ICA約18－20mm，感覺有阻力時(shí)停止，扎緊并固定魚線，缺血2h后將線輕輕拔出約1cm進(jìn)行再灌注。假手術(shù)組動(dòng)物栓線插入僅12mm，余步驟相同。24h后采用Bederson方法進(jìn)行神經(jīng)功能損傷評分，分?jǐn)?shù)越高，說明其神經(jīng)行為障礙越嚴(yán)重，1分≤評分＜4分為腦缺血模型建立成功。

3.2 免疫組織化學(xué)染色

大鼠在腦缺血再灌注24h后經(jīng)10%水合氯醛深度麻醉，以4%多聚甲醛灌注后斷頭，取額頂葉皮層（去除明顯的壞死組織）缺血半影區(qū)組織于4%多聚甲醛中24h后700ml／L乙醇室溫保存，石蠟包埋后切片，切片厚度5μm，取各組組織的三套石蠟切片分別進(jìn)行抗－ZO－1，抗－Claudin－5陽性對照染色切片，脫蠟、水化，蒸餾水洗后，微波修復(fù)30min后分別加入一抗，4℃過夜，PBS洗滌，滴加二抗，37℃孵育30min；滴加鏈霉素卵白素過氧化物酶（ABC），37℃孵育30min，PBS沖洗，DAB顯色，水沖洗，脫水，透明，封片，在光鏡下觀察。

3.3 Western Blot定量檢測

每組樣本取等量蛋白（約50μg）分別進(jìn)行勻漿，勻漿器中分別加入裂解液，1200g，40℃，離心5 min，收集上清，酚試劑法對上清蛋白進(jìn)行定量，按照每泳道15μg加載于SDS－PAGE凝膠電泳孔中，以電壓120V／40mA，2h，電泳后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，脫脂奶粉室溫封閉2h，TBST洗5min×3次，分 別 加 入一抗 （ZO－1、Claudin－5 抗 體或 GAPDH），4℃封閉過夜，TBST洗5min×3次，然后加入二抗（1∶10000）室溫2h，TBST洗5min×3次，堿性磷酸酶法顯色.以同一樣本的GAPDH作為內(nèi)參，凝膠圖像分析儀掃描圖像，目的蛋白含量 ＝ 樣本目的蛋白灰度值／同一樣本GAPDH灰度值.

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

1.免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

如圖1所示，假手術(shù)組的血管內(nèi)皮細(xì)胞上ZO－1、Claudin－5沿血管均勻連續(xù)表達(dá)，缺血組血管內(nèi)皮細(xì)胞上ZO－1、Claudin－5分布斷續(xù)、稀少；二氮嗪處理組ZO－1、Claudin－5分布情況較缺血組明顯好轉(zhuǎn)。

2.Western Blot定量檢測結(jié)果

圖像分析軟件，結(jié)果顯示缺血再灌注組ZO－1及Claudin－5的蛋白表達(dá)較假手術(shù)組明顯減少，二氮嗪預(yù)處理組ZO－1及Claudin－5的蛋白表達(dá)較缺血再灌注組增多（表1及圖2）。

圖1 二氮嗪對 MCAO模型大鼠ZO－1、Claudin－5蛋白表達(dá)的影響（箭頭所示為陽性表達(dá)，SABC×400）Fig.1Effect of diazoxide on ZO－1and Claudin－5protein expression of cerebral ischemia－－reperfusion in rats（The arrows point to positive expressions，SABC ×400）

表1 各組大鼠ZO－1、Claudin－5與GAPDH總灰度比值（）Table 1 The ratio of total grey value of ZO－1and Claudin－5vs GAPDH of each group（）

表1 各組大鼠ZO－1、Claudin－5與GAPDH總灰度比值（）Table 1 The ratio of total grey value of ZO－1and Claudin－5vs GAPDH of each group（）

＊P＜0.05vs I／R group；＊＊P＜0.01vs sham group

組別（Group）5 1.05±0.26 0.09±0.08缺血再灌注組（I／R group） 5 0.39±0.12＊＊ 0.21±0.99＊＊二氮嗪預(yù)處理組（diazoxide treatment） 5 0.68±0.11＊ 0.57±0.08＊n ZO－1 Claudin－5假手術(shù)組（sham group）

圖2 各組大鼠ZO－1、Claudin－5蛋白的變化（免疫印跡）Fig.2The changes of ZO－1and Claudin－5in each group（Western blot）

討 論

血腦屏障是神經(jīng)血管單元的核心結(jié)構(gòu)，其通過限制和調(diào)節(jié)血漿組分與腦組織間相互交流來維持腦內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。缺血條件下可導(dǎo)致血腦屏障的損傷，從而進(jìn)一步 加重腦 損傷［5］。有報(bào)道［6、7］血腦屏障的損傷是腦缺血早期患者死亡的主要危險(xiǎn)因素之一。因此在急性缺血性腦損傷后選擇有效的治療策略來限制血腦屏障功能紊亂顯得尤為重要。

隨著分子生物學(xué)的進(jìn)展，緊密連接（tight junction，TJ）在血腦屏障中所發(fā)揮的核心作用已經(jīng)被充分地證明，內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接是由3種跨膜蛋白Claudin、Occludin、連接黏附分子（JAM）與胞漿附著蛋白（ZO－1、ZO－2、ZO－3）等共同組成的復(fù)合體［8］。一般認(rèn)為，細(xì)胞與細(xì)胞之間主要在跨膜蛋白Occludin處形成TJ，而僅有Occludin的表達(dá)卻不能形成TJ，而只有Claudin－5將成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染之后，才能在TJ上定位到Occludin蛋白，Claudin－5是緊密連接形成的充要條件［9］，Occludin則起到輔助作用。在低氧情況下，隨著乏氧時(shí)間的延長，ZO－1蛋白由細(xì)胞膜上逐漸遷移到胞漿中，然后進(jìn)入胞核內(nèi)，造成occludin－ZO－1－F－actin連接的斷裂，BBB通透性增加［10］。因此有人認(rèn)為Claudin－5蛋白是腦血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性調(diào)節(jié)的最重要調(diào)節(jié)因子，而ZO－1表達(dá)水平的下降標(biāo)志著BBB的破壞［5］，可以說Claudin－5、ZO－1是TJ的主要結(jié)構(gòu)蛋白。在正常情況下，這兩種蛋白均沿著細(xì)胞膜連續(xù)分布。

ATP敏感性鉀通道（ATP－sensitive potassium channels，KATP）是一類由內(nèi)向整流鉀通道（Kir6.X，包括 Kir6.1和 Kir6.2）亞基和磺酰脲類受體（SUR1，SUR2A或SUR2B）亞基組成的異源性多聚體［11］，根據(jù)分布部位不同，分為細(xì)胞膜KATP通道和線粒體KATP通道，其活性除了受ATP濃度調(diào)節(jié)，還可被KATP通道開放劑激活。當(dāng)線粒體基質(zhì)ATP不足時(shí)，該通道開放，線粒體內(nèi)膜去極化，呼吸鏈活性顯著增強(qiáng)，從而提高細(xì)胞對缺血缺氧的耐受能力［12］。二氮嗪是線粒體KATP的特異性開放劑，最早被應(yīng)用于心肌缺血方面的研究，其對線粒體KATP敏感性是膜KATP2000倍［13］。我們自2006年以來一直從事KATP通道開放劑對腦缺血神經(jīng)元保護(hù)機(jī)制的研究。在前期體外試驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)線粒體KATP通道開放劑二氮嗪可能通過caspase依賴的通路和非caspase依賴的通路對氧糖剝奪（OGD）誘導(dǎo)的SH－SY5Y細(xì)胞凋亡發(fā)揮保護(hù)作用。但我們前期對KATP通道開放劑腦保護(hù)機(jī)制的研究主要集中在對神經(jīng)元保護(hù)的研究。

在本次實(shí)驗(yàn)中，我們通過免疫組化及 Western blot定量測定的方法對比各組大鼠腦組織微血管內(nèi)皮細(xì)胞上ZO－1、Claudin－5的表達(dá)情況，結(jié)果顯示假手術(shù)組ZO－1、Claudin－5的表達(dá)連續(xù)、豐富，缺血再灌注組這兩種蛋白的表達(dá)較假手術(shù)組明顯減少，定量分析顯示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，相對于缺血再灌注組，二氮嗪預(yù)處理組的表達(dá)情況得到改善，這說明腦缺血再灌注損傷可能與構(gòu)成血腦屏障緊密連接的相關(guān)蛋白ZO－1、Claudin－5表達(dá)減少有關(guān)，而二氮嗪可通過增強(qiáng)ZO－1、Claudin－5的表達(dá)來減輕血腦屏障的開放程度，從而對腦缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用。本研究為二氮嗪發(fā)展成為缺血性腦卒中的治療藥物提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)也為神經(jīng)血管單元新的靶向研究提供了實(shí)驗(yàn)線索。

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