不同植物油體蛋白及其油體貯藏最適溫度關聯(lián)研究

曾艷玲 曾曉峰 譚曉風 張黨權(quán) 賀舍予，3 楊 亞

（經(jīng)濟林培育與保護省部共建教育部重點實驗室（中南林業(yè)科技大學）1，長沙 410004）

（林業(yè)生物技術湖南省重點實驗室2，長沙 410004）

（中南林業(yè)科技大學食品科學與工程學院3，長沙 410004）

不同植物油體蛋白及其油體貯藏最適溫度關聯(lián)研究

曾艷玲1，2曾曉峰1譚曉風1，2張黨權(quán)1，2賀舍予1，3楊 亞1

（經(jīng)濟林培育與保護省部共建教育部重點實驗室（中南林業(yè)科技大學）1，長沙 410004）

（林業(yè)生物技術湖南省重點實驗室2，長沙 410004）

（中南林業(yè)科技大學食品科學與工程學院3，長沙 410004）

以仁用杏、油桐、花生、大豆、芝麻和油茶種子為試材，研究不同植物油體蛋白的組分差異，并結(jié)合其脂肪酸成分含量分析不同溫度下油體貯藏效果。結(jié)果表明，前3種植物油體蛋白組分較多，而后3種植物油體蛋白組分相對較少；植物油體蛋白組分越多，油體差異個體也越多，同時某組分油體蛋白基因表達量越多，其對應大小的油體也越多；在4℃冷藏條件下植物油體均能達到一個較長時間保鮮的效果，但并不是溫度越低油體貯藏效果越好，脂肪酸成分和油體蛋白綜合影響植物油貯藏效果。

植物油體 油體蛋白 貯藏 溫度 脂肪酸

油體蛋白是包被在油體外部的一層磷脂和蛋白質(zhì)鑲嵌而成的半單位膜［1］，能夠在種子脫水時維護油體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，促進種子萌發(fā)，并在種子發(fā)芽時提供脂酶結(jié)合位點［2－4］。Jacks等［5］通過對花生種子油體的分離和反復蛋白清洗，發(fā)現(xiàn)了油體中蛋白質(zhì)的存在。Yastsu等［6］首次從植物種子中成功分離到油體蛋白。Vance等［7］采用分子克隆技術獲得玉米種子分子質(zhì)量為16.5 ku油體蛋白的cDNA克隆和序列，開啟了植物種子油體蛋白結(jié)構(gòu)與功能的研究［7］。目前，油體蛋白基因已從許多植物中克隆獲得，其中包括玉米、擬南芥、大豆、油菜、胡蘿卜、芝麻、向日葵、棉花、水稻、小麥、油茶和油桐［8－14］。近年來，國內(nèi)外報道了較多關于油體蛋白的研究，尤其是利用油體蛋白融合蛋白表達外源蛋白的研究，這將在改善種子油脂品質(zhì)的提高和生產(chǎn)外源蛋白的實際應用中起到十分重要的作用［15－16］。Hang［17］將玉米的油體蛋白基因轉(zhuǎn)入油菜，玉米油體蛋白基因的mRNA僅在轉(zhuǎn)基因油菜成熟種子中存在，表達量為種子總蛋白的1%，表達產(chǎn)物90%定位在油體上。植物種子油體蛋白表達定位，易于提取純化等特性為應用基因工程生產(chǎn)外源重組蛋白研究提供新的途徑。Parmenter等［18］將222 bp水蛭素基因插入擬南芥油體蛋白基因的3’端，構(gòu)建以擬南芥油體蛋白基因啟動子驅(qū)動的植物表達載體，用農(nóng)桿菌介導的葉盤法轉(zhuǎn)化油菜，經(jīng)檢測轉(zhuǎn)基因油菜種子，證實擬南芥油體蛋白－水蛭素融合蛋白在油菜油體中表達，表達產(chǎn)物具有生物學活性，表達量為種子總蛋白的1%［18］。目前，利用油菜油體植物表達系統(tǒng)生產(chǎn)水蛭素已經(jīng)進入商業(yè)化階段。但是，植物油體蛋白與油脂貯存相關研究卻鮮少報道。本研究選取仁用杏、油桐、花生、大豆、芝麻和油茶等經(jīng)濟植物，研究其油體蛋白的差異及不同溫度貯存下油體變化，為后期開發(fā)油體植物表達系統(tǒng)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油茶和油桐種子：本實驗室選育優(yōu)良品種；花生、大豆和芝麻：市售；仁用杏種子：國家林業(yè)局泡桐研究開發(fā)中心提供。丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸胺：美國Amerosco公司。

1.2 主要儀器與設備

FOSSSCINO ST310油脂萃取系統(tǒng)：諾斯高斯分析儀器蘇州有限公司；G6890A氣相色譜儀（FID檢測器）：美國安捷倫科技公司。

1.3 方法

1.3.1 植物種子油體蛋白的提?。?9］

取油茶種仁1 g放入研缽中，加6 mL體積的Buffer（緩沖液）A（10 mmol／L PBS，2mmol／L二硫蘇糖醇（DTT），0.6 mol／L Sucrose），研磨成勻漿后轉(zhuǎn)入離心管中，添加等體積 Buffer B（10 mmol／L PBS＋0.4蔗糖），冷凍離心收集上層油體重新懸浮于6 mL的 Buffer C（5 mmol／L PBS＋0.1蔗糖），此時為油體的粗提物 T1，液面上覆以等體積 Buffer D（10 mmol／L PBS＋0.25蔗糖 ＋2 mol／L NaCl），冷凍離心收集上層油體重新懸浮于6 mL 9 mol／L尿素中，室溫60 r／min振蕩10 min，液面上覆以等體積10 mmol／L的PBS，再次冷凍離心收集上層油體，懸浮于少量Buffer A中，此時為油體提取物T2在4℃下保存?zhèn)溆?。油體提取物中加入2倍體積的冰丙酮，置于－20℃下1 h，可直接沉淀油體提取物中的蛋白組分。取250μL的 T2油體提取物，加750μL氯仿／甲醇（1∶2）混合物，超速冷凍離心 5min，取中間的蛋白層，即純化的油體蛋白，－70℃冰箱中保存。

1.3.2 油體貯藏效果

為了檢驗不同植物油體蛋白在不同溫度下維持油體穩(wěn)定性的效果，本試驗將新鮮的油體提取物T2分別置于37、25、4和－20℃下16 h后，在放大400倍的光學顯微鏡下觀察油體完整度。

1.3.3 油脂提取

參照GB／T 14772—2008中的索氏抽提法。

1.3.4 脂肪酸成分測定

脂肪酸成分測定釆取堿式甲酯化法測定［20］。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同植物油體蛋白SDS－PAGE電泳分析

根據(jù)不同植物種子中油體蛋白SDS－PAGE電泳結(jié)果分析（圖1），仁用杏、油桐、花生、大豆、芝麻和油茶等6種植物油體蛋白均有多條譜帶，分子量大小介于12～80 ku之間，說明這6種植物的油體大小也存在多級化。仁用杏油體中至少存在14條不同蛋白組分，其中15、25和40 ku左右蛋白的表達量遠遠大于其他蛋白；油桐油體中至少存在10條不同蛋白組分，其中13、18、26、35和50 ku左右蛋白條帶濃粗；花生油體中至少存在10條不同蛋白組分，其中15、30和70 ku左右蛋白表達量大于其他蛋白；大豆油體中至少存在4條不同蛋白組分，其中25 ku左右蛋白表達量最為明顯；芝麻油體中至少存在4條不同蛋白組分，其中13 ku左右蛋白表達量較為明顯；油茶油體中至少含有6條不同的蛋白組分，其中14.4和18.4 ku左右蛋白的表達量遠遠大于其他蛋白。這些濃粗的蛋白條帶甚至有可能是多條分子量接近的蛋白組分重疊而成。

圖1 植物種子中油體蛋白SDS－PAGE電泳圖

2.2 不同植物油體大小差異

不同植物油體大小差異較大，同一植物油體也存在大小差異（見圖2）。對仁用杏、油桐、花生、大豆、芝麻和油茶這6種油料植物的油體整體比較而言，花生的油體最大，其最大油體直徑可達2 mm左右，而大豆油體相對最小，其最大直徑僅約0.5 mm左右。對照圖1，花生分子質(zhì)量為70ku左右油體蛋白表達量較高，而大豆分子量為25 ku左右油體蛋白表達量較高，這說明植物油體大小可能與油體蛋白的大小以及油體蛋白的表達量相關。而油體蛋白組分多元化可能是導致每種植物都存在多種大小不一油體的原因之一。

圖2 植物種子中油體顯微圖（×400）

2.3 不同植物油體在不同溫度下貯藏效果

圖3 植物油體在不同溫度下貯藏16 h后顯微觀測（×400）

不同植物油體最適貯藏溫度有較大差異，并不是通常人們所認為的溫度越低最適合保存（表1）。由圖3可見，仁用杏和油茶油體提取物在37℃保存16 h，油體出現(xiàn)較明顯的聚合現(xiàn)象，油脂容易變質(zhì)；25℃保存16 h，雖然油體有輕微聚合，但是仍然保存著較多的大小不一的完整油體，但油茶大的油體組分存留較少；4℃保存16 h，油體保存較為完整，與新鮮提取出的油體差異不大；－20℃保存16 h，雖然油體保存較為完整，但卻有輕微的聚合現(xiàn)象，且油茶大的油體組分明顯減少。油桐油體在37、25、4和－20℃條件下貯藏16 h效果與仁用杏油體相似，但是油桐油體在－20℃條件下保存16 h后聚合現(xiàn)象更為明顯。花生油體在37℃和25℃保存16 h，均存在較明顯的聚合現(xiàn)象，但是25℃貯藏條件下還存在少數(shù)較大的油體，這是4℃和－20℃保存16 h后都不再存在的組分，這可能說明70 ku左右花生油體蛋白在常溫下穩(wěn)定性最好，而－20℃保存16 h，花生油體也存在輕微的聚合現(xiàn)象。大豆油體在4℃和－20℃條件下保存16 h完整度最好，37℃和25℃保存16 h后較大的油體幾乎都不存在了。芝麻油體在－20℃條件下保存16 h完整度最好；4℃條件下雖然貯藏16 h效果也較好，但是大的油體組分較少；37℃和25℃保存16 h后芝麻油體均出現(xiàn)了不同程度的聚合現(xiàn)象，且油體密度明顯減少。

2.4 油脂成分與油體貯藏效果相關分析

不同植物油體在不同溫度下貯藏效果存在明顯差異，這可能與其油體蛋白的大小多少有關，并且與該植物所含脂肪酸成分有較大關系。根據(jù)表1可以看出，在4℃冷藏條件下，試驗植物油體保存狀態(tài)均良好；在油體蛋白組分數(shù)量相當?shù)那闆r下，多不飽和脂肪酸含量高的植物油體在－20℃冷凍條件下更容易發(fā)生聚合現(xiàn)象；在飽和脂肪酸成分含量相當?shù)那闆r下，則表現(xiàn)出油體蛋白組分數(shù)量越多在冷凍條件下越容易發(fā)生聚合現(xiàn)象。

表1 植物油體在不同溫度下貯藏16 h后綜合分析

3 結(jié)論

3.1 油體大小與油體蛋白的大小以及油體蛋白的表達量密切相關，油體蛋白大小組分越多，油體大小差異個體也越多，同時某組分油體蛋白表達量越多，其對應大小的油體也越多。

3.2 植物油無論是食用油還是工業(yè)用油，在4℃冷藏條件下均能達到一個較長時間保鮮的效果。

3.3 油體蛋白組分數(shù)量相當?shù)那闆r下，多不飽和脂肪酸含量高的植物油體在－20℃冷凍條件下卻更容易發(fā)生聚合現(xiàn)象，這一結(jié)果似乎與生活常識有悖，這說明可能是因為多元化的因素導致了這一現(xiàn)象，如與其相關的脂酶種類、催化最適溫度，蛋白質(zhì)變性等等，具體原因還需進一步科學驗證。

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Correlation Between Plant Oleosin and the Optimum Temperature for Oil Storage

Zeng Yanling1，2Zeng Xiaofeng1Tan Xiaofeng1，2Zhang Dangquan1，2He Sheyu1，3Yang Ya1

（Key Laboratory of Cultivation and Protection for Non－Wood Forest Trees（Central South University of Forestry and Technology），Ministry of Education1，Changsha 410004）（Hunan Provincial Key Laboratory of Forestry Biotechnology2，Changsha 410004）（College of Food Science and Engineering，Central South University of Forestry and Technology3，Changsha 410004）

Kernel apricot，Vernicia fordii，Arachis hypogaea，Glycine max，Cortex cinnamomiandCamellia oleiferahave been chosen as material to research the oleosin components in the paper.The effects of the oil body storage were analyzed under different temperatures as well as the content of the fatty acid composition.The results showed that the oleosin components of the first 3 plants were more than those of the latter 3 ones；the oleosin components changed along with the increasing in different oil bodies.At the same，the oleosin genes expressed a positive correlation along with the corresponding oil bodies.When storaged under 4℃ or less，the all tested plant oil could be preserved better，but lower temperature was not always the better storage temperature.Not only oleosin but also fatty acid compositions affect the storage of plant oil.

plant oil，body oleosin，storage，temperature，fatty acid

S379

A

1003－0174（2015）04－0056－05

湖南省科技廳一般項目（2011FJ3219），湖南省自然科學基金（14JJ2104），中南林業(yè)科技大學校重點青年基金（QJ2011008A）

2013－12－05

曾艷玲，女，1980年出生，博士，經(jīng)濟林栽培育種及林業(yè)生物技術

曾曉峰，男，1979年出生，講師，經(jīng)濟林產(chǎn)品加工利用