抗凍融大豆蛋白的制備

孫洪蕊 王喜波 張英華 姜國川 江連洲

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院1，哈爾濱 150030）（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院2，長春 130118）

抗凍融大豆蛋白的制備

孫洪蕊1王喜波1張英華1姜國川2江連洲1

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院1，哈爾濱 150030）（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院2，長春 130118）

采用濕法美拉德反應(yīng)對大豆蛋白進(jìn)行糖基化改性，研究了糖基化接枝產(chǎn)物的凍融穩(wěn)定性。結(jié)果表明，濕法糖基化大豆蛋白能有效提高接枝產(chǎn)物的凍融穩(wěn)定性，在SPI（大豆分離蛋白）濃度40 mg／mL、蛋白與糖質(zhì)量比1∶3、反應(yīng)時間4 h、pH 8.0、反應(yīng)溫度95℃條件下的接枝物凍融前后的EAI（乳化活性）分別是未改性蛋白的1.69倍和1.76倍，ESI（乳化穩(wěn)定性）是未改性蛋白的1.37倍和1.27倍。傅里葉紅外光譜分析表明，SPI－D接枝物在1 000 cm－1附近有較強(qiáng)的吸收，在3 700～3 200 cm－1處有一個更寬的振動伸縮吸收，葡聚糖以共價鍵的形式接入到SPI上。SPI－D接枝物在激發(fā)波長為347 nm，發(fā)射波長在435 nm處有最大的熒光強(qiáng)度，符合美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的熒光特性，進(jìn)一步證明SPI與葡聚糖發(fā)生了美拉德反應(yīng)。

大豆分離蛋白 乳化性 凍融 美拉德反應(yīng)

大豆蛋白是一種全價蛋白質(zhì)，是為數(shù)不多的可以與動物蛋白媲美的植物蛋白，可做為功能性食品配料，提高產(chǎn)品營養(yǎng)價值和加工特性，并促進(jìn)人體健康［1－2］。蛋白質(zhì)具有兩親性質(zhì)，可以吸附在油水界面，在油滴之間提供靜電斥力和空間位阻，穩(wěn)定乳液，所以經(jīng)常被用做乳化劑［3－5］，但是，蛋白質(zhì)乳液體系容易受外界條件如 pH、離子強(qiáng)度、溫度的影響［6－7］而不穩(wěn)定。有研究表明，蛋白質(zhì)乳液在冷凍－融化后，由于冰晶的生成導(dǎo)致一系列的物理化學(xué)變化的發(fā)生，尖銳的冰晶會破壞油水界面膜，使乳液變得很不穩(wěn)定，產(chǎn)生絮凝、聚結(jié)和乳析等失穩(wěn)現(xiàn)象，甚至使油相和水相完全分離［8］。我國目前還沒有專用于冷凍食品中的大豆蛋白，而常態(tài)下的大豆蛋白在冷凍條件下無法維持蛋白原有的功能性質(zhì)，從而影響了冷凍食品的品質(zhì)。美拉德反應(yīng)是一種安全有效的蛋白質(zhì)改性方法，該反應(yīng)通過蛋白質(zhì)的ε－氨基和多糖還原末端的羰基發(fā)生，無需添加任何化學(xué)物質(zhì)［9］。研究［10－13］證實蛋白質(zhì)和多糖通過美拉德反應(yīng)得到的共價接枝物的乳化性顯著提高，共價復(fù)合物在油水界面可以形成更厚的界面膜，形成了更加穩(wěn)定的網(wǎng)絡(luò)，抵抗了乳液在冷凍過程中冰晶對其網(wǎng)絡(luò)的破壞，提高了乳液對低溫的穩(wěn)定性。乳化性［14］是蛋白質(zhì)可應(yīng)用于功能性食品配料中的一項重要功能性質(zhì)。本試驗通過濕法糖基化技術(shù)提高大豆分離蛋白凍融前后的乳化特性，制備出適用于冷凍食品體系的高凍融乳化穩(wěn)定性的大豆蛋白，為實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

大豆分離蛋白：自制；葡聚糖（分子量40 000）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；九三非轉(zhuǎn)基因大豆油：市售；十二烷基磺酸鈉（SDS）：化學(xué)純；鄰苯二甲醛：Sigma公司。

1.2 主要儀器

Nicolet 6 700 FT－IR傅里葉變換紅外光譜儀：美國Thermo Fisher Scientific公司；F－4500熒光分光光度計：日本日立公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 糖基化蛋白的制備工藝

將一定濃度的大豆分離蛋白與葡聚糖在緩沖溶液中充分溶解，待大分子充分水化后，將溶液置于一定溫度的水浴鍋中反應(yīng)，然后冰浴停止反應(yīng)。將反應(yīng)后的溶液在10 000 r／min條件下離心15 min，上清液冷凍干燥即為糖基化蛋白。

1.3.2 乳化活性和乳化穩(wěn)定性測定［15］

將蛋白溶解在pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液中，取蛋白溶液9 mL與3 mL大豆油充分混合，10 000 r／min均質(zhì)1 min。均質(zhì)后形成乳濁液，0 min和10 min時分別在乳液底部取50μL與5 mL 0.1%的SDS充分混合，然后在500 nm處測吸光值。ESI用式（1）表示。

式中：A0為0 min時測得的吸光值，即為乳化活性（EAI）；A10為10 min時測得的吸光值；ESI為乳化穩(wěn)定性。試驗以0.1%的SDS溶液做空白。

1.3.3 凍融循環(huán)

根據(jù) O'Regan等［16－17］的試驗方法，并略作改進(jìn)。將蛋白溶液置于－18℃的條件下冷凍保存24 h，然后于40℃的水浴鍋中解凍1.5 h。

1.3.4 接枝度（DG）的測定

參考 Sorgentini D A［18］的方法。OPA試劑：稱取80 mg OPA溶于2 mL甲醇中，分別加入5 mL 20%SDS，50 mL 0.1 mol／L硼砂，200μLβ－巰基乙醇，用去離子水定容至100 mL，OPA試劑現(xiàn)配現(xiàn)用。測定時，取4 mL OPA試劑與200μL樣品混合，于35℃反應(yīng)2 min，340 nm測吸光度，產(chǎn)物的接枝度為反應(yīng)體系中反應(yīng)前后游離氨基含量的變化率。

1.3.5 褐變指數(shù)的測定

參照文獻(xiàn)［19］，稍作改動。將糖基化蛋白樣品制備成2 mg／mL的樣品溶液，以去離子水做空白，測定其在420 nm下的吸光值A(chǔ)420nm，表示褐變程度。

1.3.6 SPI－D接枝物的傅里葉紅外光譜分析

取一定量的SPI和SPI－D接枝物，加入一定量的KBr，研磨成粉末，壓成薄片，然后用傅里葉變換紅外光譜儀作全波段（4 000～400 cm－1）掃描。

1.3.7 SPI－D接枝物的熒光光譜分析

將SPI、SPI－D混合物和 SPI－D接枝物溶解在硼酸緩沖溶液中（0.2 mol／L，pH 8.5），蛋白濃度為1 mg／mL，使用熒光分光光度計在激發(fā)波長為347 nm處進(jìn)行發(fā)射波長的掃描。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用Microsoft Excel 2010，所有試驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)時間對糖基化蛋白凍融前后乳化性的影響

在SPI與葡聚糖質(zhì)量比1∶3，pH 7，蛋白質(zhì)量濃度50 mg／mL，反應(yīng)溫度95℃條件下，研究不同反應(yīng)時間對接枝產(chǎn)物凍融特性的影響，結(jié)果如圖1、圖2所示。

圖1 反應(yīng)時間對糖基化蛋白凍融前后乳化性的影響

圖2 反應(yīng)時間對SPI－葡聚糖接枝反應(yīng)的影響

從圖1中可以看出隨著加熱時間的增長，接枝產(chǎn)物凍融前后的乳化活性和乳化穩(wěn)定性先升高后下降，反應(yīng)時間4 h時，接枝產(chǎn)物的凍融穩(wěn)定性最高，原因可能是隨著加熱時間的增長，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)部分展開，糖鏈逐漸引入大豆分離蛋白中，增加了蛋白質(zhì)的表面活性，糖鏈在蛋白吸附膜周圍形成立體網(wǎng)絡(luò)，增加了膜的厚度，增強(qiáng)了復(fù)合物對外界環(huán)境的抵抗能力［20］，使接枝物凍融前后的乳化活性和乳化穩(wěn)定性提高。而加熱時間過長，導(dǎo)致蛋白質(zhì)中引入過多的親水集團(tuán)，使接枝物過度親水而失去界面活性，使復(fù)合物的乳化活性和乳化穩(wěn)定性降低［21］。從圖2中可以看出，隨著加熱時間的增長，聚合物的顏色加深，影響產(chǎn)品的應(yīng)用。SPI和葡聚糖混合物的乳化性與未經(jīng)改性的蛋白質(zhì)基本保持不變，所以單純的加入葡聚糖對蛋白質(zhì)凍融前后的乳化性沒有影響，這與郭興鳳等［22］得到的結(jié)果相同。

2.2 SPI質(zhì)量濃度對糖基化蛋白凍融前后乳化性的影響

在SPI與葡聚糖質(zhì)量比1∶3，pH 7，反應(yīng)溫度95℃，反應(yīng)時間4 h條件下，研究不同SPI質(zhì)量濃度對接枝產(chǎn)物凍融特性的影響，結(jié)果如圖3、圖4所示。

圖3 SPI質(zhì)量濃度對糖基化蛋白凍融前后乳化性的影響

圖4 SPI質(zhì)量濃度對褐變指數(shù)的影響

從圖3中可以看出，隨著蛋白質(zhì)量濃度的增加，復(fù)合物凍融前后的乳化活性和乳化穩(wěn)定性均先升高后降低。在一定的溫度、pH值、蛋白與糖配比、反應(yīng)時間的條件下，蛋白質(zhì)濃度的增加，會增加其與糖的碰撞機(jī)會，進(jìn)而促進(jìn)接枝反應(yīng)的進(jìn)行，使復(fù)合物凍融前后的乳化性提高。但是蛋白質(zhì)量濃度越高，空間位阻越大，不利于接枝反應(yīng)的進(jìn)行。從圖4中可以看出，蛋白質(zhì)量濃度為40 mg／mL時，產(chǎn)物的褐變指數(shù)較低，顏色較淺。因此選取SPI最適質(zhì)量濃度為40 mg／mL。

2.3 SPI與葡聚糖的質(zhì)量比對糖基化蛋白凍融前后乳化性的影響

在 SPI質(zhì)量濃度 40 mg／mL，pH 7，反應(yīng)溫度95℃，反應(yīng)時間4 h條件下，研究不同SPI與葡聚糖質(zhì)量比對接枝產(chǎn)物凍融特性的影響，結(jié)果如圖5、圖6所示。

圖5 SPI與葡聚糖的質(zhì)量比對糖基化蛋白凍融前后乳化性的影響

圖6 SPI與葡聚糖的質(zhì)量比對褐變指數(shù)的影響

蛋白質(zhì)和葡聚糖的接枝反應(yīng)是特定基團(tuán)的交聯(lián)反應(yīng)，適當(dāng)?shù)谋壤瓤梢约铀俜磻?yīng)的進(jìn)行，又能減少副反應(yīng)的發(fā)生。如圖5所示，復(fù)合物凍融前后的乳化活性和乳化穩(wěn)定性在一定范圍內(nèi)隨著葡聚糖含量的增加而升高，糖濃度的增加，提高了大豆分離蛋白與葡聚糖的碰撞幾率，促進(jìn)了接枝反應(yīng)的發(fā)生，所以提高了復(fù)合物凍融前后的乳化穩(wěn)定性。同時反應(yīng)引入了糖鏈，使接枝產(chǎn)物的極性增加，溶解性提高，分子柔性增大，所以復(fù)合物的乳化活性升高。但是糖添加量過多，使溶液黏度增大，分子的流動性差，不利于接枝反應(yīng)的進(jìn)行。過量的糖鏈引入大豆分離蛋白會使蛋白質(zhì)過于親水，失去界面活性，不利于油水平衡，導(dǎo)致復(fù)合物凍融前后的乳化特性降低。從圖6中可以看出，過多的糖會導(dǎo)致接枝產(chǎn)物褐變指數(shù)顯著提高，影響產(chǎn)品應(yīng)用品質(zhì)，因此，選SPI與葡聚糖的最適質(zhì)量比為1∶3。

2.4 pH值對糖基化蛋白凍融前后乳化性的影響

在SPI與葡聚糖的質(zhì)量比1∶3，反應(yīng)溫度95℃，SPI質(zhì)量濃度為40 mg／mL，反應(yīng)時間4 h條件下，研究不同pH值對接枝產(chǎn)物凍融特性的影響，結(jié)果如圖7、圖8所示。

圖7 pH對糖基化蛋白凍融前后乳化性的影響

圖8 pH對褐變指數(shù)的影響

美拉德反應(yīng)的本質(zhì)是堿催化反應(yīng)，堿性條件有利于接枝反應(yīng)的進(jìn)行，隨著pH的增加（圖7），接枝產(chǎn)物凍融前后的乳化性均先增加后減小。堿性條件下，－COO＋含量增加，提高了微粒之間的靜電斥力，使雙電層厚度增加，溶液中界面膜的厚度也增加，接枝產(chǎn)物對極端環(huán)境有了更強(qiáng)的抵抗力，凍融后仍保持較好的乳化特性。但是，pH過高，可能會發(fā)生“胱賴反應(yīng)”，影響接枝反應(yīng)的進(jìn)行［23］，故選擇pH 8為宜。

2.5 反應(yīng)溫度對糖基化蛋白乳化性的影響

在SPI與葡聚糖的質(zhì)量比1∶3，pH 8，SPI質(zhì)量濃度40 mg／mL，反應(yīng)時間4 h條件下，研究不同反應(yīng)溫度對接枝產(chǎn)物凍融特性的影響，結(jié)果如圖9、圖10所示。

圖9 反應(yīng)溫度對糖基化蛋白凍融前后乳化性的影響

圖10 反應(yīng)溫度對糖基化蛋白褐變指數(shù)的影響

接枝產(chǎn)物凍融前后的乳化活性和乳化穩(wěn)定性隨著溫度的升高而增加（圖9），溫度為95℃時達(dá)到最大值。研究顯示溫度低于90℃時美拉德反應(yīng)速度很慢，而溫度高于90℃時反應(yīng)速率顯著提高［24］。一定的反應(yīng)溫度，會使SPI致密的球狀結(jié)構(gòu)變疏松，釋放出更多的接觸位點與葡聚糖發(fā)生反應(yīng)，但是溫度過高會使蛋白過度變性，失去界面活性，進(jìn)而導(dǎo)致復(fù)合物乳化性的降低。從圖10中可以看出，溫度越高，褐變指數(shù)越大，復(fù)合物的顏色越深，不利于其在食品中應(yīng)用，陸鈁［25］等也得出相似的趨勢，本試驗選擇反應(yīng)溫度95℃。

2.6 驗證試驗

在上述試驗條件下（SPI濃度40 mg／mL、蛋白與糖質(zhì)量比1∶3、反應(yīng)時間4 h、pH 8.0、反應(yīng)溫度95℃），進(jìn)行驗證性試驗，結(jié)果如表1所示。

表1 接枝產(chǎn)物的凍融特性

濕法糖基化技術(shù)可有效提高接枝產(chǎn)物的凍融特性，由表1可見，接枝產(chǎn)物的EAI在凍融前后分別比空白樣品提高了1.69倍和1.76倍，ESI在凍融前后分別比空白樣品提高了1.37倍和1.27倍，表明濕法糖基化技術(shù)提高大豆蛋白凍融特性具有現(xiàn)實可行性。

2.7 傅里葉紅外光譜分析

SPI和葡聚糖發(fā)生糖基化反應(yīng)的特征為羥基的引入，在紅外光譜上體現(xiàn)為在3 700～3 200 cm－1附近相較于SPI有較寬的吸收峰和在1 260～1 000 cm－1附近有更強(qiáng)的吸收［26］。

SPI和SPI－D接枝物的紅外光譜圖如圖11所示。SPI－D接枝物在1 000 cm－1附近有較強(qiáng)的吸收，在3 700～3 200 cm－1處有一個更寬的振動伸縮吸收，由此可以證明SPI以共價結(jié)合的方式引入葡聚糖，SPI和葡聚糖發(fā)生了美拉德反應(yīng)。

圖11 大豆分離蛋白（SPI）和大豆分離蛋白－葡聚糖接枝物（SPI－D）的紅外光譜圖

2.8 熒光光譜分析

研究表明［27－28］，熒光物質(zhì)是美拉德反應(yīng)的中間產(chǎn)物，所以測定反應(yīng)體系的熒光性可用于鑒定美拉德反應(yīng)的發(fā)生。熒光物質(zhì)的典型熒光光譜的特征為激發(fā)波長340～370 nm，發(fā)射波長在420～440 nm。

SPI－D接枝物的熒光光譜圖如圖12所示，SPI－D接枝物在激發(fā)波長為347 nm，發(fā)射波長在435 nm處有最大的熒光強(qiáng)度，而SPI在發(fā)射波長為450 nm處熒光強(qiáng)度最大，符合美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的熒光特性，說明SPI和葡聚糖發(fā)生了美拉德反應(yīng)。

圖12 大豆分離蛋白（SPI）和大豆分離蛋白－葡聚糖接枝物（SPI－D）的熒光光譜圖

3 結(jié)論

濕法糖基化技術(shù)能夠有效提高接枝產(chǎn)物的凍融特性，接枝產(chǎn)物經(jīng)凍融處理前后的EAI分別是未改性樣品的1.69倍和1.76倍，ESI是未改性樣品的1.37倍和1.27倍。因此，濕法糖基化技術(shù)用于制備高凍融穩(wěn)定性大豆蛋白具有現(xiàn)實可行性。

傅里葉紅外光譜和熒光光譜分析證明SPI和葡聚糖發(fā)生了美拉德反應(yīng)，產(chǎn)物凍融前后乳化性能的提高是由于糖基化反應(yīng)的發(fā)生。

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Preparation of Soy Protein with High Freeze－Thaw Stabilization

Sun Hongrui1Wang Xibo1Zhang Yinghua1Jiang Guochuan2Jiang Lianzhou1
（College of Food Science，Northeast Agricultural University1，Haerbin 150030）（College of Food Science and Engineering，Jilin Agricultural University2，Changchun 130118）

Soy protein isolate－dextran graft reaction products have been prepared by Maillard reaction on the wet－h(huán)eating condition，and the freeze－thaw stabilization of conjugates has been studied in the paper.The results indicated that the high freeze－thaw stabilization of soy protein isolate can be improved through Maillard reaction.The optimum conditions are as follows：soy protein isolate concentration 40 mg／mL，the weight ratio of soy protein isolate and dextran 1∶3，reaction time 4 h，pH 8.0，and reaction temperature 95℃.Compared with the previously unmodified soy protein isolate，the emulsifying activity index（EAI）of before and after freezing and thawing were increased by 1.69 and 1.76 times respectively，and the emulsion stability index（ESI）were increased by 1.37 and 1.27 times respectively.Fourier transform infrared spectroscopy（FT－IR）analysis showed that compared to soy protein，soy protein isolate－dextran conjugates in 3 700～3 200 cm－1stretching vibration presented a wider absorption.SPI－D also showed a strong absorption at 1 000 cm－1and soy protein isolate was grafted with dextran molecules by covalent bonds.The conjugates had the strongest florescence intensity on condition of emission of 347 nm，the excitation of 435 nm and it was conformed to the fluorescence characteristics of Maillard reaction products.All data showed that the complex of the soy protein and dextran had been produced by the reaction.

soy protein isolate，emulsifying properties，freeze－thaw，Maillard reaction

TS201.2

A

1003－0174（2015）04－0050－06

863計劃（2013AA102208），國家大豆產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目（CARS－04－PS25），黑龍江省教育廳科研項目（12531050），黑龍江省應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)計劃項目（WB13C10201）

2013－12－10

孫洪蕊，女，1989年出生，碩士，食品科學(xué)

王喜波，男，1975年出生，副教授，糧食油脂及植物蛋白工程