兔煤工塵肺模型各期HRCT表現(xiàn)與血清TNF-α、PDGF表達(dá)水平相關(guān)研究

陳強(qiáng)，張永林，劉嵐，麥衛(wèi)平

（山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院影像科，山西 太原 030001）

兔煤工塵肺模型各期HRCT表現(xiàn)與血清TNF-α、PDGF表達(dá)水平相關(guān)研究

陳強(qiáng)，張永林，劉嵐，麥衛(wèi)平

（山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院影像科，山西 太原 030001）

目的：探討兔煤工塵肺模型在HRCT上的影像表現(xiàn)與腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、血小板源性生長因子（PDGF）表達(dá)水平的相關(guān)性。方法：復(fù)制兔煤工塵肺模型，分別于2周、1、2、3、5個(gè)月時(shí)對兔行HRCT掃描，同時(shí)采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測兔血清TNF-α、PDGF含量。結(jié)果：煤工塵肺模型兔肺HRCT早期主要表現(xiàn)為磨玻璃影及小葉間隔增厚，中期主要表現(xiàn)為局限性肺間質(zhì)纖維化及小蜂窩狀影像，晚期主要表現(xiàn)為結(jié)節(jié)影、廣泛環(huán)狀影及實(shí)變影；試驗(yàn)組兔血清TNF-α含量低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），PDGF含量高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且隨時(shí)間的延長，TNF-α、PDGF水平均逐漸降低；兩變量相關(guān)性分析顯示TNF-α與PDGF呈正相關(guān)（P<0.05），TNF-α、PDGF含量變化與兔煤塵肺模型HRCT表現(xiàn)嚴(yán)重程度之間呈負(fù)相關(guān)（P<0.05）。結(jié)論：煤工塵肺高分辨力CT表現(xiàn)與TNF-α、PDGF表達(dá)水平密切相關(guān)，TNF-α、PDGF在肺組織不可逆纖維化過程中均發(fā)揮重要作用。

塵肺；模型，動物；體層攝影術(shù)，X線計(jì)算機(jī)，血小板源性生長因子；腫瘤壞死因子α；酶聯(lián)免疫吸附測定

煤工塵肺是由于煤礦工人長期吸入煤粉塵且粉塵在肺內(nèi)阻留引起的一種慢性疾病，以肺組織彌漫性纖維化為主要表現(xiàn)，對接觸煤塵者危害嚴(yán)重，且尚無有效的治療手段。本研究通過復(fù)制無創(chuàng)傷性兔煤工塵肺模型，從影像學(xué)表現(xiàn)和細(xì)胞因子2個(gè)方面，采用HRCT重建和酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），探討煤工塵肺的HRCT表現(xiàn)與腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、血小板源性生長因子（PDGF）表達(dá)水平的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1一般材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物選用日本大耳白兔40只，均為雄性，體質(zhì)量1.5～2.5 kg（由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供），檢疫1周后用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.2主要器材新生兒喉鏡，片長70～90 cm；導(dǎo)管直徑0.3 cm，長14 cm；導(dǎo)絲長10 cm。所用試劑盒均購于上海西塘生物科技有限公司。

1.1.3煤塵懸液制備取太原東山煤礦提供的煤塵樣品，經(jīng)球磨機(jī)充分研磨水選，制備成直徑<5 μm占95%以上且游離SiO2含量<8%的煤粉塵顆粒，以生理鹽水配成100 mg/mL煤塵懸液，高壓滅菌后備用。

1.1.4藥物配置4%戊巴比妥鈉溶液配制方法：4.0 g戊巴比妥鈉，溶于100 mL蒸餾水，用量1 mL/kg體質(zhì)量。青霉素粉針劑160萬U/支，每只20萬U/d。

1.2儀器與方法

1.2.1動物分組和兔煤工塵肺模型的建立①動物分組：按隨機(jī)分配原則，將40只健康雄性日本大耳白兔，隨機(jī)分為2周組、1個(gè)月組、2個(gè)月組、3個(gè)月組、5個(gè)月組5組各8只，每組任選5只作為煤塵組，另外3只作為對照組。②制作模型：將實(shí)驗(yàn)兔用4%戊巴比妥鈉麻醉后仰臥固定于實(shí)驗(yàn)臺上，從口腔輕柔插入新生兒喉鏡，盡量將兔頸項(xiàng)向上提直，使聲帶最大程度暴露，觀察清楚聲帶后，插入附導(dǎo)絲的氣管導(dǎo)管（導(dǎo)管進(jìn)入氣管后兔出現(xiàn)輕咳），判定導(dǎo)管插入氣管正確后，立即將導(dǎo)管末端接上濃度為100 mg/mL煤粉塵的注射器，灌注量2 mL/kg，灌注成功后，即拔出導(dǎo)管和喉鏡，輕揉雙肺使粉塵自然進(jìn)入各支氣管。同時(shí)，為預(yù)防感染影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，造模前后3 d，注射青霉素20萬U/只。按照上述實(shí)驗(yàn)方法，對照組兔注入同等劑量的0.9%氯化鈉注射液。

1.2.2CT掃描所有白兔造模前及后各期行胸部CT掃描。采用美國GE lightspeed 16螺旋CT機(jī)，掃描范圍從肺尖至肋膈角。兔麻醉、固定在固定板上、待呼吸平穩(wěn)，全身肌肉松弛后開始掃描。掃描參數(shù)：120 kV，100 mA，F(xiàn)OV 10 mm×10 mm，螺距0.938，矩陣512×512，骨算法重建。所有圖像均在GE ADW 4.1工作站上進(jìn)行后處理和分析；窗寬1 300 HU，窗位-600 HU。肺間質(zhì)纖維化不同嚴(yán)重程度的HRCT分級［1］：輕度肺纖維化改變?yōu)樾∪~間隔增厚和小葉內(nèi)結(jié)構(gòu)增粗；中度肺纖維化改變?yōu)榫窒扌孕》涓C狀影像；重度肺纖維化改變?yōu)榉蝺?nèi)廣泛環(huán)狀影像或合并有實(shí)變。

1.2.3細(xì)胞因子標(biāo)本采集與檢測：2周、1、2、3、5個(gè)月時(shí)，經(jīng)兔耳緣靜脈采血后，用ELISA法統(tǒng)一檢測血清TNF-α、PDGF含量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，2組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；試驗(yàn)組各分期比較采用方差分析，其兩兩比較采用q檢驗(yàn)；相關(guān)分析采用Spearman秩相關(guān)分析，煤塵組HRCT表現(xiàn)比較采用秩和檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1煤塵組及對照組兔子不同時(shí)期HRCT表現(xiàn)（表1）對照組兔肺各期HRCT表現(xiàn)：各期兔肺紋理清晰，走行自然，未見異常密度影（圖1）。煤塵組兔肺2周時(shí)：主要為肺內(nèi)密度稍高影，邊界模糊，呈磨玻璃密度改變（圖2）；1個(gè)月：表現(xiàn)為磨玻璃影增多，小葉間隔增厚出現(xiàn)（圖3）；2個(gè)月：纖維化影像增多，支氣管血管束周圍常常伴有纖維增生、水腫及炎性滲出等（圖4）；3個(gè)月：病變進(jìn)一步發(fā)展，可見煤結(jié)節(jié)形成累及胸膜（圖5），部分可呈蜂窩狀改變。5個(gè)月：病變晚期，肺組織纖維化加重，細(xì)支氣管擴(kuò)張，廣泛蜂窩影像形成（圖6）。

煤塵組各期HRCT的表現(xiàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=10.397，P<0.05）。

表1 各期煤塵組和對照組兔肺HRCT表現(xiàn)只

2.2煤塵組與對照組兔血清TNF-α、PDGF含量比較煤塵組兔血清TNF-α含量低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；PDGF含量高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表2）。

表2 煤塵組和對照組血清TNF-α、PDGF含量比較（pg/mL，±s）

表2 煤塵組和對照組血清TNF-α、PDGF含量比較（pg/mL，±s）

注：TNF-α，腫瘤壞死因子；PDGF，血小板源性生長因子。

組別例數(shù)TNF-αPDGF煤塵組2551.40±1.421 771.86±139.03對照組1568.57±7.231 585.79±187.73 t值11.6023.589 P值＜0.05＜0.05

2.3各期煤塵組兔血清TNF-α、PDGF含量比較煤塵組兔血清TNF-α含量隨著時(shí)間的延長而降低（P< 0.05）；PDGF含量隨分期的增加而降低（P<0.05）（表3）。

2.4兔血清TNF-α、PDGF含量的相關(guān)性分析兔血清TNF-α與PDGF含量的相關(guān)性分析，TNF-α與 PDGF含量呈正相關(guān)（r=0.402，P<0.05）。

2.5兔血清TNF-α、PDGF含量與兔肺間質(zhì)纖維化HRCT表現(xiàn)嚴(yán)重程度相關(guān)性分析煤塵組兔血清TNF-α、PDGF含量與肺間質(zhì)纖維化嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)（前者r=-0.54，P<0.05；后者r=-0.37，P<0.05）。

表3 各期煤塵組和對照組血清TNF-α、PDGF含量比較（pg/mL，±s）

表3 各期煤塵組和對照組血清TNF-α、PDGF含量比較（pg/mL，±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與2周時(shí)比較，▲P＜0.05；與1月時(shí)比較，■P＜0.05。

組別例數(shù)TNF-αPDGF煤塵組2周589.74±11.83*1 917.72±208.62*1個(gè)月578.57±8.74*1 809.18±202.14*▲2個(gè)月561.54±10.18*▲1 730.78±189.26*▲3個(gè)月544.96±5.65*▲■1 710.11±237.67*▲■5個(gè)月520.35±3.50*▲■1 691.52±176.42*▲■對照組1568.57±7.231 585.79±187.73 F值43.2877.925 P值＜0.05＜0.05

3 討論

煤工塵肺的發(fā)病機(jī)制至今尚不完全清楚，其發(fā)生發(fā)展過程與多種肺間質(zhì)纖維化有關(guān)的細(xì)胞因子密切相關(guān)，而HRCT能很好顯示肺的細(xì)微結(jié)構(gòu)，是目前檢查肺間質(zhì)性疾病的最佳方法［2］。本研究目的是通過復(fù)制兔煤工塵肺模型，探討其HRCT表現(xiàn)與TNF-α、PDGF表達(dá)水平之間的相關(guān)性，為煤工塵肺的早期診斷及治療提供可靠的信息。

TNF-α是具有多種生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子，其主要由單核-巨噬細(xì)胞分泌，通過激活及活化中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多類細(xì)胞，參與煤工塵肺的免疫反應(yīng)過程。國內(nèi)外諸多實(shí)驗(yàn)均已證實(shí)煤塵可誘發(fā)TNF-αmRNA的表達(dá)增強(qiáng)，促使肺泡巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞中TNF-α的大量釋放［3-5］，其中其308位點(diǎn)G→A的突變是造成人體TNF-α表達(dá)量差異的重要因素，其基因多態(tài)性引起mRNA活性蛋白表達(dá)水平的改變，進(jìn)而影響煤工塵肺發(fā)生發(fā)展過程。TNF-α基因308位點(diǎn)Arg/Arg、Gln/Arg、Gln/Arg+Arg/Arg基因型攜帶者易患煤工塵肺［6-7］。PDGF是在血小板中發(fā)現(xiàn)的二聚體蛋白，能刺激間葉來源的細(xì)胞分裂生長，是Fb的有絲分裂原。Fb所表達(dá)的PDGF-BB主要以滯留形式存在，可對其毗鄰細(xì)胞發(fā)生作用和促進(jìn)自分泌［8-9］。PDGF在啟動纖維化的過程中，對巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等具有趨化作用，可刺激成纖維細(xì)胞增生，影響細(xì)胞外基質(zhì)代謝，參與肺纖維化的形成過程［10］。因此，PDGF一方面通過促使上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞發(fā)生有絲分裂從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化，另一方面還可以通過抑制膠原纖維的降解來發(fā)揮促纖維化作用［11］。Lou等［12］認(rèn)為TNF-α能誘導(dǎo)血小板和嗜酸性粒細(xì)胞在肺內(nèi)聚集，激活的血小板可進(jìn)一步釋放促纖維化細(xì)胞因子，如PDGF、TGF-β1。本研究顯示試驗(yàn)組早期兔血清TNF-α、PDGF含量均高于對照組，TNF-α與PDGF含量呈正相關(guān)，與上述研究結(jié)論一致。

圖1對照組兔：肺紋理清晰，走形自然圖2～6均為煤塵組兔圖22周：雙肺可見到磨玻璃影、斑片影圖31個(gè)月：右肺可見到膜玻璃影，左肺見到呈不規(guī)則狀的特征性纖維條索影圖42個(gè)月：左肺見到支氣管血管影走形異常圖53個(gè)月：右肺多發(fā)纖維條索影，牽拉周圍結(jié)構(gòu)，左肺見數(shù)個(gè)結(jié)節(jié)圖65個(gè)月：右肺可見多發(fā)蜂窩影，肺內(nèi)結(jié)構(gòu)紊亂

接觸粉塵的早期，機(jī)體對粉塵刺激敏感而發(fā)生強(qiáng)烈的應(yīng)激反應(yīng)，肺泡巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞過度激活［13］，產(chǎn)生過量的細(xì)胞因子TNF-α、PDGF等，造成肺組織損傷和發(fā)生纖維化；隨著接觸粉塵時(shí)間延長，機(jī)體對粉塵耐受性增高，產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞活性減低，進(jìn)而細(xì)胞因子分泌減少；煤工塵肺晚期，由于沉積的膠原纖維收縮壓迫肺組織［14］，上述細(xì)胞及其分泌因子減少。本研究顯示，煤塵組兔血清TNF-α、PDGF含量2周時(shí)最高，隨著時(shí)間的延長而降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），與上述結(jié)論一致。

本研究兔煤工塵肺模型在2周時(shí)血清TNF-α、PDGF含量最高，且隨時(shí)間延長逐漸降低，兔肺HRCT表現(xiàn)主要以磨玻璃影為主，部分出現(xiàn)小葉間隔增厚，呈輕度肺纖維化。1至2個(gè)月期間，TNF-α、PDGF含量逐漸減少，HRCT上以局限性肺間質(zhì)纖維化及小蜂窩狀影為主要表現(xiàn)，呈中度肺纖維化；3個(gè)月后，TNF-α、PDGF含量繼續(xù)減少，HRCT以廣泛蜂窩影、煤結(jié)節(jié)影及實(shí)變影為主要表現(xiàn)，呈中-重度肺纖維化。筆者認(rèn)為臨床檢測TNF-α、PDGF含量早期升高后期降低時(shí)，肺組織纖維化不可逆的過程啟動。

綜上所述，TNF-α、PDGF是煤工塵肺發(fā)生、發(fā)展中的2項(xiàng)重要的免疫指標(biāo)，與HRCT表現(xiàn)有密切關(guān)系，且TNF-α和PDGF在煤工塵肺的早期高表達(dá)，可作為煤工塵肺早期預(yù)警的血清學(xué)指標(biāo)。

［1］關(guān)硯生，馬大慶，賀文，等．煤工塵肺間質(zhì)纖維化的高分辨率CT表現(xiàn)及病理基礎(chǔ)［J］.中國醫(yī)學(xué)影像技術(shù)，1998，16（5）：302-304.

［2］陳忠，顧元?jiǎng)P，袁晨華.MDCT對煤工塵肺的診斷價(jià)值［J］.華北煤炭醫(yī)學(xué)院報(bào)，2010，12（2）：165-166.

［3］李娟，郝小惠，范雪云，等.塵肺患者血清腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素-6表達(dá)水平及意義［J］.中國職業(yè)醫(yī)學(xué)，2012，39（3）：245-246.

［4］Piguet PF，Collart MA，Grau GE，et al.Requirement of tumornecrosis factor for development of silicainduced pumonary fibrosis［J］.Nature，1990，344：245-247.

［5］周建華.石棉誘導(dǎo)AM因子對成纖維細(xì)胞作用的研究［J］.工業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病，1997，23（4）：215-218.

［6］Fan Hongmin，Zhuo Wang，F(xiàn)eng Fumin，et al.Association of TNF-α-238G/A and 308 G/A gene polymorphisms with pulmonary tuberculosis among patients with coal worker’s pneumoconiosis［J］. Biomed Environ Sci，2010，23：137-145.

［7］李舉，黃嬋，郭嘉昒，等.腫瘤壞死因子-α308位點(diǎn)多態(tài)性與塵肺易感的Meta分析［J］.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2013，40（2）：217-221.

［8］周偉琳，蔡衛(wèi)民，丁永祥.血小板衍生生長因子與肝纖維化［J］.浙江大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2000，29（6）：283-286.

［9］閆國和，艾國平.血小板源性生長因子與組織修復(fù)［J］.中國康復(fù)理論與實(shí)踐，2007，13（1）：39-41.

［10］陳興年，莫星帆，劉杰.矽肺患者血清TGF-β1和PDGF蛋白的檢測及臨床意義［J］.臨床肺科雜志，2010，15（7）：945-947.

［11］GulumianM，Borm PJ，Vallyathan V，et al Mechanistically identified suitable biomarkers of exposure，effect，and susceptibility for silicosis and coalworkers’pneumoconiosis：a comprehensive review［J］.J Toxicol Environ Health B Crit Rev，2006，9：357-95.

［12］Lou J，Donati YR，Juillard P，et al.Platelets play an important role in TNF-induced microvascular endothelial cell pathology［J］. Am J Pathol，1997，151：1397-1405.

［13］李慶，李廷，祁新蘭.煤工塵肺患者血清TNF-α、sIL-2R、IL26和IL28檢測的意義［J］.中國工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志，2006，19（1）：11-12.

［14］邱堅(jiān)衛(wèi).石工矽肺的X射線探討［J］.中國職業(yè)醫(yī)學(xué)，2005，32（3）：51-52.

Association of the HRCT features and expression of serum TNF-α、PDGF in the rabbits model of coal worker's pneu-moconiosis

CHEN Qiang，ZHANG Yonglin，LIU Lan，MAI Weiping.Department of Radiology，Second Hospital of Shanxi Medical

University，Taiyuan，030001，China.

Objective:To investigate the association of the HRCT features and expression of serum TNF-α and PDGF in the rabbits model of coal worker's pneumoconiosis（CWP）.Methods：Copying the CWP rabbit model，at 2 weeks and month of 1，2，3，5，CT scan was performed in each group，meanwhile，levels of TNF-α and PDGF in serum were measured by ELISA test. Results：HRCT features in the CWP rabbits model showed that ground-glass opacities and thick interlobular septa were observed in the early stage，pulmonary fibrosis and small honeycomb imaging were found in the middle stage，nodules、extensive ring shadow and opacities were discovered in the late stage.The level of TNF-α in serum of CWP rabbits was lower，but the level of PDGF was higher in comparison with those of the control（P<0.05，respectively）.Moreover，with the pulmonary lesions aggravating，serum TNF-α and PDGF decreased gradually.TNF-α expression level was positively related to PDGF（P<0.05）.TNF-α、PDGF expression levels were negatively related to the severity of pulmonary interstitial fibrosis（P<0.05）.Conclusion:The expression levels of TNF-α and PDGF in serum maybe related to the severity of pulmonary interstitial fibrosis，TNF-α and PDGF play an important role.

Pneumoconiosis；Model，animals；Tomography，X-ray computed；Platelet-derived growth factor；Tumor necrosis factoralpha；Enzyme-linked immuno-sorbent assay

2015-00-00）

10.3969/j.issn.1672-0512.2015.06.008

張永林，E-mail：zyl3212008@sina.com。