不同降解方式對硫酸軟骨素寡糖抗氧化活性的影響

王俊　曾凡新　程薇　熊光權(quán)　喬宇　吳文錦　張金木　鉏曉艷　史德芳　汪蘭

摘要：以鱘魚（Acipenser sinensis）硫酸軟骨素為原料，分別采用鹽酸酸解法、過氧化氫氧化法、草酸降解法和輻照降解法對其進行處理，使得鱘魚硫酸軟骨素的相對分子質(zhì)量從35 193分別降至1 841、1 155、 2 089和3 049，相對分子質(zhì)量明顯減小，且對DPPH·和·OH的清除能力及Fe3+還原能力明顯提高。結(jié)果顯示，過氧化氫降解所得硫酸軟骨素寡糖抗氧化性能很好，當(dāng)濃度為500 μg/mL時，對DPPH·和·OH的清除率可達85%和70%。

關(guān)鍵詞：鱘魚（Acipenser sinensis）；硫酸軟骨素；相對分子質(zhì)量；抗氧化活性

中圖分類號：S98；TS254 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）22-5707-04

Abstract： Taking sturgeon chondroitin sulfate as raw materials and adopting HCl acid solution， hydrogen peroxide， oxalic acid and radiation to degrade it. The results showed that the relative molecular weight of chondroitin sulfate had respectively dropped from 35 193 to 1 841， 1 155， 2 089 and 3 049. Molecular weight was greatly reduced compared with that of the raw material. In addition， the scavenging activity on DPPH o and OH o and the reducing activity on Fe3+ has been greatly increased. The results showed that chondroitin sulfate with hydrogen peroxide degradation had good oxidation resistance， when the concentration of oligosaccharide is 0.5 mg/mL， the inhibition rate on DPPH· and OH· could reach 85% and 70%.

Key words： Acipenser sinensis； the oligosaccharide of chondroitin sulfate；relative molecular weight； oxidation resistance

硫酸軟骨素（Chondroitin sulfate，CS）是軟骨素（Chondroitin，CH）的不同位置硫酸基取代產(chǎn)物，是由糖醛酸（葡糖醛酸GlcA/艾杜糖醛酸IdoA）、N-乙酰氨基半乳糖（GalNAc）及不同含量硫酸基組成[1]。其廣泛存在于各種動物的軟骨和結(jié)締組織中，由于其來源不同，因此具有不同的結(jié)構(gòu)和生理活性。大量研究表明，CS具有降血脂、抗動脈粥樣硬化、增強免疫力、抗病毒性肝炎和抗腫瘤等活性，臨床中已廣泛應(yīng)用于眼科、骨科、心血管疾病及口腔疾病等領(lǐng)域[2-5]。此外，大量研究表明，大部分多糖具有復(fù)雜的、多方面的抗氧化活性，而CS作為一種酸性黏多糖也具有一定的抗氧化能力，研究鱘魚（Acipenser sinensis）CS的抗氧化活性對于CS的廣泛應(yīng)用具有重要意義。

由于天然的多糖相對分子質(zhì)量大，較難透過生物細胞膜發(fā)揮其生理活性，因此，近年來，如何降低多糖的相對分子質(zhì)量從而提高其生物利用率成為研究熱點之一。目前，降低多糖相對分子質(zhì)量的方法主要有生物降解、化學(xué)降解、物理降解和氧化降解。生物降解主要是酶法降解，其特點是安全高效，但成本較高；化學(xué)降解可分為無機酸和有機酸，無機酸降解簡便易行，成本較低，但污染嚴重，而有機酸降解相對較安全，但不同的有機酸對多糖的降解效率差異較大；物理降解主要是超聲波降解和輻照降解，其特點是降解過程易控制，無污染；氧化降解以過氧化氫降解為主，其特點是副產(chǎn)物較少，相對分子質(zhì)量分布較為集中[6]。

本研究以自制的鱘魚CS粗品為原料，分別采用化學(xué)降解、氧化降解和物理降解方法制備相對分子質(zhì)量范圍不同的CS，并比較不同降解方式所得的低分子質(zhì)量CS的抗氧化性差異，為今后CS的進一步研究和應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CS粗提物，湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所提供；98%D-葡萄糖醛酸，阿拉?。ㄉ虾＃┰噭┯邢薰?；咔唑，化學(xué)純，阿拉?。ㄉ虾＃┰噭┯邢薰荆畸}酸，分析純，中國平煤神馬集團開封東大化工有限公司試劑廠；硫酸，優(yōu)級純，信陽市化學(xué)試劑廠；DPPH，上海源葉生物科技有限公司；732型陽離子交換樹脂，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇、氫氧化鈉、草酸、四硼酸鈉，亞硫酸鐵、水楊酸、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鉀、氯化鈉，分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；30%過氧化氫，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GL-21M型離心機，湘南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；DF-101s型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，上海東璽制冷儀器設(shè)備有限公司；DK-3600型電熱恒溫水浴鍋，中化國科（北京）科技有限公司；DZ-300A型多功能真空分裝機，溫州市興業(yè)機械設(shè)備有限公司；752型紫外可見光分光光度計，上海光譜儀器有限公司；BS124S型分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；PL3002（Ⅱ）型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DHG-9123A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；B-212型pH計，日本HORIBA公司；QE-100型中藥粉碎機，浙江屹立工貿(mào)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 低相對分子質(zhì)量CS的制備 將超微粉碎10 h的CS粗制品編號為cs；將cs配制成3%的溶液，并于60Co γ 18 kGy下進行輻照，濃縮冷凍干燥得產(chǎn)品cs-f；將cs置于0.4 mol/L HCl溶液中進行酸解（料液比為1∶30，g∶mL，下同），65 ℃水浴攪拌24 h，堿中和后濃縮冷凍干燥得產(chǎn)品cs-y；將10%的cs溶液置于10%的草酸體系中進行酸解，60 ℃水浴攪拌6 h，堿中和后濃縮冷凍干燥得產(chǎn)品cs-c；將cs置于0.6 mol/L 過氧化氫溶液中進行酸解（料液比為1∶40），80 ℃水浴攪拌24 h，堿中和后濃縮冷凍干燥得產(chǎn)品cs-h[7-10]。

1.3.2 純化 利用732型陽離子交換樹脂對cs、cs-f、cs-y、cs-c和cs-h進行純化，目的是得到純度大于50%的CS寡糖。

樹脂的預(yù)處理：①清水漂洗，至排水透明；②用蒸餾水浸泡12～24 h，使其充分膨脹；③用2倍體積1 mol/L HCl溶液浸泡12 h，并定時攪拌；④用低純水洗滌樹脂至其pH為4；⑤1 mol/L NaOH溶液浸泡12 h，并水洗至微堿狀態(tài)；⑥1 mol/L HCl溶液浸泡2 h，水洗至pH為6，超純水浸泡待用。

過柱條件：將不同處理方式所得的低相對分子質(zhì)量CS溶于蒸餾水中，配制成濃度為100 mg/mL的CS溶液10 mL。將預(yù)處理好的732型陽離子交換樹脂裝于2.5 cm×50 cm的層析柱中（為防止起泡和分層現(xiàn)象，將樹脂置于適量的蒸餾水中勻速攪拌，并勻速裝入柱中），裝柱高度50 cm，將待層析的CS溶液加入柱中，并用蒸餾水進行洗脫，控制流速1 mL/min，將流出液收集，每5 mL為一管，測定每管收集液中產(chǎn)品含量，收集出峰區(qū)的液體，濃縮后進行冷凍干燥，得純化后的產(chǎn)品[11]。

1.3.3 產(chǎn)品純度

1）D-葡萄糖醛酸含量。D-葡萄糖醛酸含量采用硫酸-咔唑法[12]測定。

2） 硫酸軟骨素含量[13]。

1.3.4 體外抗氧化能力的測定

1）對DPPH·的清除能力。對DPPH·的清除能力的測定參照謝果凰[14]的方法，具體方法如下：將不同處理方式所得的低相對分子質(zhì)量CS溶于蒸餾水，并根據(jù)其純度配置成CS濃度依次為100、200、300、400、500 mg/mL的溶液，依次編號1、2、3、4、5。配制濃度為2×10-4 mol/L的DPPH乙醇溶液，按表1加反應(yīng)液用力搖勻。將未加樣品的DPPH·溶液，加入比色皿中進行吸光度的測定，記錄吸光度為A0（用50%的乙醇溶液調(diào)零）。然后測出Ai、Aj所表示的樣品的吸光度。清除率按公式（1）計算，重復(fù)3次。

式中，A0為未加樣品溶液的DPPH溶液的吸光度；Ai為加入樣品溶液后的DPPH溶液的吸光度；Aj為樣品溶液自身的吸光度。

2）對·OH的清除能力。對·OH的清除能力的測定參照張蓮[15]的方法，具體方法如下：將不同處理方式所得的低相對分子質(zhì)量CS溶于蒸餾水，并根據(jù)其純度配置成CS濃度依次為100、200、300、400、500 mg/mL的溶液，依次編號1、2、3、4、5。在試管中依次加入2 mmol/L的FeSO2溶液2 mL、6 mmol/L的水楊酸溶液2 mL，不同濃度的樣品溶液2 mL，于37 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)15 min，最后加入6 mmol/L的H2O2溶液2 mL啟動反應(yīng)，搖勻，于37 ℃恒溫水浴15 min后，在波長510 nm處測定吸光度，清除率計算方法如公式（2），重復(fù)3次。將樣品溶液換成等體積的蒸餾水，測得其吸光度即為A0（蒸餾水調(diào)零）。

清除率=■×100% （2）

式中，A0為空白溶液對照；Ai為加入樣品后的吸光度。

3）對Fe3+的還原能力。還原能力的測定參照李彥杰等[16]的方法，并略有改動，具體方法如下：將不同處理方式所得的低相對分子質(zhì)量CS溶于蒸餾水，并根據(jù)其純度配置成CS濃度依次為100、200、300、400、500 mg/mL的溶液，依次編號1、2、3、4、5，分別取1 mL依次加入pH 6.6的磷酸緩沖液和1%鐵氰化鉀溶液各2.5 mL，混勻后于50 ℃水浴20 min，然后加入10%的三氯乙酸溶液2.5 mL，混勻，800 r /min離心10 min，取上清液2.5 mL，再次加入蒸餾水和0.1%氯化鐵溶液各2.5 mL，混勻后靜置10 min，在700 nm處測定吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 相對分子質(zhì)量

由表2數(shù)據(jù)可知，經(jīng)上述方法降解后的產(chǎn)品相對分子質(zhì)量至少可降低90%。比較各產(chǎn)品相對分子質(zhì)量可知，過氧化氫氧化降解效果最好，不僅所得CS寡糖相對分子質(zhì)量小，而且分散指數(shù)小，相對分子質(zhì)量范圍更窄；其后，依次為鹽酸降解、草酸酸解和輻照降解。

2.2 不同降解方法制備的CS的抗氧化能力

2.2.1 對DPPH·的清除能力 從圖1可以看出，CS寡糖對DPPH·的清除能力呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。5種CS寡糖中，經(jīng)過氧化氫降解所得產(chǎn)品cs-h對DPPH·的抑制效果最好，其次是cs-y、cs-f，cs-c的抑制效果最差；當(dāng)樣品cs-h濃度為400 μg/mL時，清除率可達90%，繼續(xù)增大濃度，抑制率不再增加，反而有所下降，說明已達劑量飽和狀態(tài)。CS寡糖對DPPH·的清除能力的差異不僅與其處理方式有關(guān)，也與相對分子質(zhì)量大小、硫酸基含量以及不飽和雙鍵的形成有關(guān)，具體原因有待進一步研究。

2.2.2 對·OH的清除能力 由圖2可知，經(jīng)過氧化氫氧化所得寡糖cs-h和經(jīng)鹽酸酸解所得寡糖cs-y呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性，且對·OH的清除能力明顯強于其他寡糖。當(dāng)寡糖cs-h的濃度為500 μg/mL時，其對·OH的清除率可達70%，當(dāng)寡糖cs-y的濃度為500 μg/mL時，其對·OH的清除率可達65%。草酸酸解和輻照降解所得寡糖其對·OH的抑制效果不明顯，分析可能與其處理方式和分子質(zhì)量大小有關(guān)。

2.2.3 對Fe3+的還原能力 由圖3可知，不同處理方式所得CS寡糖對Fe3+的還原能力僅cs-h呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，其他幾種方式處理所得CS產(chǎn)品對Fe3+的還原能力較弱，比較發(fā)現(xiàn)，鹽酸處理后的產(chǎn)品還原能力大于輻照處理的，草酸處理后的最弱，但仍強于僅超微粉碎的產(chǎn)品，由此可知，CS對Fe3+的還原能力不僅僅與分子質(zhì)量有關(guān)，與處理方式也有很大的關(guān)系，因此，可以通過分析不同處理方式的CS產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)差異（如硫酸基含量、不飽和雙鍵等），來判斷影響低分子質(zhì)量CS還原能力的決定性因素。

將各產(chǎn)品相對分子質(zhì)量及其對自由基的清除能力和Fe3+的還原能力結(jié)合分析發(fā)現(xiàn)，其抗氧化性并不是隨著相對分子質(zhì)量的降低嚴格增加的，且同一樣品對不同自由基的清除能力和還原能力也有差異，相對分子質(zhì)量對CS的抗氧化性有影響，但不是絕對影響，是與其他因素共同作用的結(jié)果。

3 小結(jié)與討論

由試驗數(shù)據(jù)可明顯看出，經(jīng)過氧化氫氧化所得CS寡糖cs-h不僅相對分子質(zhì)量小，相對分子質(zhì)量范圍窄，且對DPPH·、·OH的抑制能力和對Fe3+的還原能力均為最優(yōu)，且效果明顯，濃度為500 μg/mL時，對DPPH·的清除率可達85%，對·OH的清除率可達70%；一定條件鹽酸酸解效果稍弱，所得CS寡糖cs-y對DPPH·和·OH有明顯的抑制作用，對Fe3+的還原作用相對較弱；草酸酸解和輻照降解不僅降解效果不明顯，而且所得寡糖分散系數(shù)高，抗氧化性較弱。

有研究指出，CS寡糖的抗氧化性與其硫酸基含量、成分變化及不飽和雙鍵的形成有關(guān)。孫濤等[8]人對κ-卡拉膠進行不同方式的降解，并比較其成分和體外抗氧化性發(fā)現(xiàn)，酸解會導(dǎo)致硫酸基含量的水解，對自由基的清除能力有所降低。張蓮等[17]通過比較酶解和酸解CS寡糖發(fā)現(xiàn)，硫酸基含量對其體外抗氧化性無明顯影響，而酸解過程中產(chǎn)生的不飽和糖醛酸對自由基清除能力和還原能力有積極作用。史敏娟等[9]通過比較過氧化氫+銅離子氧化體系降解和自由基降解CS發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過氧化氫體系所得寡糖氨基己糖、己糖醛酸和硫酸基含量等主要成分基本不變。根據(jù)試驗數(shù)據(jù)，分析影響CS抗氧化性能的最主要因素是其分子質(zhì)量大小，其次不同降解方式所得寡糖中不飽和雙鍵的形成和其他成分的改變也可能造成抗氧化能力的差異，具體原因有待進一步研究。

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（責(zé)任編輯 龍小玲）