Caspase—3和神經(jīng)生長(zhǎng)因子在高膽紅素血癥腦損傷中的研究

劉榕 陰懷清

[摘要] 高膽紅素血癥可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的壞死或凋亡，最終引起不同程度的腦損傷。目前對(duì)凋亡的研究過(guò)程中，人們發(fā)現(xiàn)Caspase-3在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制中有重要作用。神經(jīng)生長(zhǎng)因子是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，眾多研究表明：顱腦損傷后神經(jīng)生長(zhǎng)因子可保護(hù)受損的神經(jīng)元，促進(jìn)軸突定向再生，增加乙酰膽堿表達(dá)，改善膽堿能神經(jīng)元功能，提高腦灌注，從而改善腦功能。本文主要對(duì)Caspase-3與神經(jīng)生長(zhǎng)因子在高膽紅素血癥腦損傷中的影響進(jìn)行綜述。

[關(guān)鍵詞] 高膽紅素血癥；細(xì)胞凋亡；Caspase；神經(jīng)生長(zhǎng)因子

[中圖分類(lèi)號(hào)] R722.17 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2015）31-0157-04

Study on Caspase-3 and nerve growth factor in brain injury in hyperbilirubinemia

LIU Rong1 YIN Huaiqing2

1.Shanxi Medical University， Taiyuan 030001， China； 2.Department of Pediatrics，the Affiliated First Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001， China

[Abstract] Hyperbilirubinemia can lead to neuronal cell necrosis or apoptosis，resulting in varying degrees of brain damage.At present，in the process of study on apoptosis，people found that Caspase-3 plays a key role in the molecular mechanism of inducing cell apoptosis.Nerve growth factor is the first discovered neurotrophic factor，numerous studies show that：after brain injury，nerve growth factor can protect damaged neurons，promote axon directed regeneration，increase the expression of acetylcholine，improve the function of cholinergic neurons and improve brain perfusion，thereby improving brain function.This article mainly reviewed the influence of Caspase-3 and nerve growth factor on brain injury in hyperbilirubinemia.

[Key words] Hyperbilirubinemia； Apoptosis； Caspase； Nerve growth factor

新生兒高膽紅素血癥是新生兒期最常見(jiàn)的問(wèn)題，也是新生兒住院的主要原因之一，近年來(lái)發(fā)病率逐步上升，現(xiàn)高達(dá)30%～50%[1]。如治療不當(dāng)可引發(fā)膽紅素腦病，即核黃疸（kernicterus），導(dǎo)致不同程度的腦損傷，輕則會(huì)導(dǎo)致遠(yuǎn)期智商、情商低下、聽(tīng)力損傷等，重則會(huì)造成新生兒死亡。有報(bào)道稱(chēng)，約2/3存活患兒可遺留永久的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥[2]，對(duì)新生兒的健康造成極大威脅。因此，深入研究高膽紅素血癥腦損傷的發(fā)病機(jī)制及防治措施，對(duì)其發(fā)病率的控制有重要意義。本文就Caspase-3與神經(jīng)生長(zhǎng)因子的結(jié)構(gòu)、功能及其在高膽紅素血癥腦損傷中的作用進(jìn)行綜述，有助于高膽紅素血癥腦損傷的研究。

1 Caspase-3與高膽紅素血癥腦損傷

1.1 Caspase

Caspase是在對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的凋亡進(jìn)行研究時(shí)，人們發(fā)現(xiàn)的一組ICE（interleukin-1β convert enzyme，即Caspase-1）類(lèi)蛋白，是一組半胱氨酸蛋白酶[3]，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中有著關(guān)鍵作用，有以下共同點(diǎn)：①與Caspase-1有同源性；②其氨基端的一段序列被水解后可激活以無(wú)活性的酶原形式存在的底物；③底物中存在的天冬氨酸羧基端肽鍵在催化時(shí)斷裂[4]；④有高度保守五肽序列[5]；⑤Caspase被水解后可產(chǎn)生級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)；⑥Caspase家族一般有抑制劑[6，7]。目前至少16種Caspase在哺乳動(dòng)物中被發(fā)現(xiàn)，根據(jù)其被發(fā)現(xiàn)的先后順序命名為Caspase-1～Caspase-16[6]。

1.2 Caspase-3與細(xì)胞凋亡

迄今為止，研究比較透徹的是作為主要的效應(yīng)者分子的Caspass-3。人Capsape-3基因定位于染色體4q33-q35處。目前眾多研究表明，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡中Caspase-3是關(guān)鍵蛋白酶，且Caspase-3活化后可通過(guò)3種途徑導(dǎo)致細(xì)胞解體[8]：①裂解胞內(nèi)的骨架蛋白和胞外的細(xì)胞外基質(zhì)，如肌動(dòng)蛋白、角質(zhì)蛋白等。②裂解凋亡抑制物，如核酸內(nèi)切酶抑制劑（ICAD/DFF45）、Bcl-2等。③DNA修復(fù)相關(guān)分子的裂解，如DNA依賴(lài)性蛋白激酶。

底物被酶解失活后會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的形態(tài)、功能發(fā)生一系列變化，表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮，胞質(zhì)致密，核染色質(zhì)邊集，而后胞核裂解，胞質(zhì)生出芽突并脫落，形成核碎片和（或）細(xì)胞器成分的膜包被小體，即凋亡小體。凋亡現(xiàn)象在本質(zhì)上是一系列Caspase的級(jí)聯(lián)切割過(guò)程。

1.3 高膽紅素血癥腦損傷機(jī)制

膽紅素可引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡增加，已在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中得到肯定，但引起凋亡的具體發(fā)病機(jī)制仍不清楚，其可能機(jī)制如下：

1.3.1 Ca2+超載 各種原因引起的細(xì)胞內(nèi)鈣含量異常增多并導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷和功能代謝障礙的現(xiàn)象稱(chēng)為鈣超載。眾多研究表明[9，10]，胞質(zhì)中Ca2+濃度的升高與細(xì)胞凋亡（apoptosis，AP）之間存在著密切的聯(lián)系。膽紅素進(jìn)入腦組織后可能通過(guò)影響細(xì)胞膜對(duì)鈣離子的通透性，影響膜上鈣泵的活性等使細(xì)胞內(nèi)形成鈣超載現(xiàn)象，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

1.3.2 影響線(xiàn)粒體呼吸功能 線(xiàn)粒體中有許多非常重要的蛋白酶或蛋白質(zhì)，它們與細(xì)胞凋亡直接相關(guān)，如凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosis inducing factor，AIF）、細(xì)胞色素C[11]、Bcl-2家族成員、半胱氨酸水解酶[12]等，它是真核細(xì)胞的動(dòng)力加工廠(chǎng)，在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起著重要作用。Schif等通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中膽紅素發(fā)揮其毒性作用的最初部位是線(xiàn)粒體。50年代，Zeterstron和Ernster發(fā)現(xiàn)，能達(dá)到抑制小鼠肝、腦細(xì)胞線(xiàn)粒體的磷酸化及生物氧化作用的膽紅素濃度是300M。Rodrigues等[13]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)解離線(xiàn)粒體氧化磷酸化是膽紅素的主要毒性作用，膽紅素可改變線(xiàn)粒體膜的通透性，導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放，再作用于一些激酶和水解酶，啟動(dòng)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

因此，膽紅素通過(guò)造成胞內(nèi)Ca2+超載，影響線(xiàn)粒體的呼吸功能從而造成神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[14]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：高膽紅素血癥可誘導(dǎo)模型鼠腦組織Caspase-3表達(dá)增加，Caspase-3的表達(dá)在造模后24 h后出現(xiàn)高峰，表明過(guò)多的Caspase-3參與了高膽紅素血癥腦損傷的發(fā)生[15]，但在此分子鏈中具體的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制及過(guò)程尚未完全闡明。

2 神經(jīng)生長(zhǎng)因子及其對(duì)中樞神經(jīng)損傷的保護(hù)作用

2.1神經(jīng)生長(zhǎng)因子簡(jiǎn)介

神經(jīng)生長(zhǎng)因子（nerve growth factor，NGF）是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，目前為人們所熟悉的經(jīng)典的NGF是從小鼠頜下腺分離所得，其相對(duì)分子質(zhì)量為140×103，是一種蛋白質(zhì)，由118個(gè)氨基酸組成，由以非共價(jià)鍵結(jié)合的一個(gè)β亞單位、兩個(gè)α亞單位及兩個(gè)γ亞單位組成，其分子組成中含有2個(gè)鋅原子，增加了分子的穩(wěn)定性，其中有活性的亞基是β亞單位[16，17]。目前，人類(lèi)NGF的基因序列已經(jīng)明確，研究表明：人類(lèi)NGF與小鼠NGF有90%的同源性[18]。NGF通過(guò)與其受體的結(jié)合發(fā)揮作用，哺乳動(dòng)物中存在兩種可與NGF結(jié)合的跨膜受體，即高親和力受體酪氨酸激酶受體（TrkA）和低親和力受體p75NTR。當(dāng)TrkA和p75NTR共同存在時(shí)，p75NTR可通過(guò)增加TrkA與NGF的親和力促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞軸突的生長(zhǎng)，但當(dāng)p75NTR單獨(dú)存在時(shí)，則會(huì)介導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[19]。

2.2 NGF對(duì)中樞神經(jīng)損傷的保護(hù)作用

顱腦損傷后，應(yīng)用外源性NGF可促進(jìn)神經(jīng)纖維再生，誘導(dǎo)軸突定向生長(zhǎng)，修復(fù)受損的神經(jīng)元。黃莉等[20]通過(guò)建立新生大鼠缺氧缺血性腦病模型，應(yīng)用外源性NGF對(duì)其進(jìn)行干預(yù)，證實(shí)新生大鼠缺氧缺血后，NGF可使其皮質(zhì)和海馬部位的神經(jīng)細(xì)胞凋亡明顯減輕，腦組織病理及超微結(jié)構(gòu)改變均減輕。龍琦等[21]用神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）、外源性堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）及二者聯(lián)合用藥分別對(duì)缺氧缺血腦損傷（HIBD）新生大鼠進(jìn)行干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，NGF、bFGF均可提高HIBD后海馬區(qū)神經(jīng)元的數(shù)量；而二者聯(lián)合應(yīng)用則可明顯提高神經(jīng)元的數(shù)量。孔祥梅等[22]的進(jìn)一步研究中，先用谷氨酸造成體外培養(yǎng)的大腦基底神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元損傷，再用NGF干預(yù)，發(fā)現(xiàn)NGF保護(hù)組大腦基底神經(jīng)節(jié)GAP-43mRNA和NF-L表達(dá)較對(duì)照組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。GAP-43在神經(jīng)系統(tǒng)正?；顒?dòng)所必需的軸漿運(yùn)輸中有重要作用，而軸漿運(yùn)輸與神經(jīng)再生及損傷后修復(fù)有密切關(guān)系，表明NGF可促進(jìn)神經(jīng)元再生。同時(shí)，Ziemba等[23]的研究移植神經(jīng)定向生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)中，將載有神經(jīng)生長(zhǎng)因子基因序列的病毒載體植入特定區(qū)域，發(fā)現(xiàn)隨著NGF的表達(dá)，植入大鼠胼胝體處的背根神經(jīng)元有向高濃度NGF區(qū)域生長(zhǎng)的趨勢(shì)。Jin Y等[24]也證實(shí)在顱腦損傷時(shí)，通過(guò)復(fù)合介導(dǎo)途徑，NGF可使軸突通過(guò)損傷區(qū)生長(zhǎng)。以上研究證實(shí)了NGF的神經(jīng)元保護(hù)作用，其具體機(jī)制可能如下：

2.2.1 拮抗自由基作用 神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)含有許多自由基清除劑，如過(guò)氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶等，顱腦損傷致白細(xì)胞活化后會(huì)釋放一些對(duì)細(xì)胞有害的細(xì)胞因子，如IL-6和氧自由基等，而這些有害的細(xì)胞因子反過(guò)來(lái)又會(huì)加重腦損傷。周政等[25]用NGF對(duì)大鼠轉(zhuǎn)基因后研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，NGF轉(zhuǎn)基因大鼠發(fā)生短暫腦缺血損傷后，其腦皮質(zhì)、海馬區(qū)中神經(jīng)細(xì)胞的凋亡明顯減少，而一些自由基清除劑如銅鋅超氧化物歧化酶、谷胱甘肽還原酶等的含量明顯增高。也有實(shí)驗(yàn)證明[26]：NGF可通過(guò)增加自由基清除劑的活性，減輕顱腦損傷時(shí)神經(jīng)元的凋亡。

2.2.2 細(xì)胞內(nèi)ca2+水平的穩(wěn)定 腦缺血腦損傷后，通過(guò)促進(jìn)氧自由基生成、加重酸中毒、破壞細(xì)胞膜等途徑可使細(xì)胞內(nèi)形成Ca2+超載現(xiàn)象，從而引起神經(jīng)元的壞死或凋亡。有研究表明[27]：離體細(xì)胞在外源性H2O2存在時(shí)，胞內(nèi)Ca2+會(huì)明顯增加，而（1～100）μg/L的NGF可抑制低濃度H2O2（0.05 mmol/L）引起的Ca2+升高，且呈劑量依賴(lài)性，提示NGF通過(guò)穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)Ca2+的水平來(lái)保護(hù)損傷神經(jīng)元。Cheng等[28]認(rèn)為其原因可能是NGF增強(qiáng)細(xì)胞排出及緩沖Ca2+的能力，提示NGF能通過(guò)影響那些調(diào)節(jié)Ca2+內(nèi)流的蛋白質(zhì)（如谷氨酸受體、電壓依賴(lài)Ca2+通道、Na+和K+通道等）的表達(dá)及功能，發(fā)揮其對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用。

2.2.3 拮抗興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性 興奮性氨基酸中與缺血性腦損傷有關(guān)的主要是谷氨酸，正常情況下參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的信息傳遞，但過(guò)量的谷氨酸會(huì)損傷神經(jīng)元。當(dāng)谷氨酸濃度升高時(shí)，通過(guò)NMDA信號(hào)傳導(dǎo)途徑使細(xì)胞內(nèi)形成Ca2+超載現(xiàn)象，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[29]。王艷輝等[30]的實(shí)驗(yàn)證明：與興奮性氨基酸毒性作用有關(guān)的小腦細(xì)胞凋亡，可被濃度為50 μg/L、l00 μg/L的NGF緩解，因某些單核細(xì)胞能夠分泌NFG。Zassler等[31]將這類(lèi)單核細(xì)胞移植入模型動(dòng)物體內(nèi)后，研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，移植組中通過(guò)NMDA途徑導(dǎo)致的膽堿能神經(jīng)元凋亡數(shù)目明顯減少，表明NGF可通過(guò)拮抗興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性實(shí)現(xiàn)對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)。

3 Caspase-3與NGF中樞神經(jīng)元保護(hù)作用的相關(guān)性

我們知道，發(fā)生高膽紅素血癥腦損傷時(shí)，可導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡，Caspase-3是Caspase家族中與細(xì)胞凋亡關(guān)系最密切的，并在其中發(fā)揮著重要作用，而NGF對(duì)受損的中樞神經(jīng)元有明確的保護(hù)作用，為了研究中樞神經(jīng)損傷時(shí)受到NGF干預(yù)后腦組織中Caspase-3的表達(dá)變化，人們進(jìn)行了大量實(shí)驗(yàn)。葛洪亮等[32]在大鼠脊髓損傷后用蛇毒神經(jīng)生長(zhǎng)因子進(jìn)行干預(yù)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，干預(yù)組損傷脊髓組織中 Caspase-3蛋白表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。張彥等[33]用神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)紅藻氨酸（KA）致癲癇大鼠進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)NGF能有效抑制其海馬區(qū)Caspase-3的表達(dá)，發(fā)揮其腦損傷保護(hù)作用。有實(shí)驗(yàn)表明[34]，大鼠腦缺血再灌注后，腦內(nèi)Caspase-3表達(dá)增多，并于再灌注后24 h達(dá)到高峰，與對(duì)照組相比，Caspase-3在NGF干預(yù)組腦組織中表達(dá)減少。也有研究表明[35]，NGF可通過(guò)下調(diào)c-jun mRNA及Caspase-3蛋白的表達(dá)，減少缺血神經(jīng)元的凋亡。也有人用神經(jīng)生長(zhǎng)因子、外源性降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）以及二者聯(lián)合分別對(duì)短暫性全腦缺血后再灌注大鼠進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)NGF和CGRP均可抑制全腦缺血后大鼠紋皮質(zhì)Caspase-3蛋白表達(dá)，聯(lián)合應(yīng)用則能顯著抑制Caspase-3表達(dá)，提示NGF和CGRP通過(guò)抑制Caspase-3蛋白表達(dá)對(duì)缺血神經(jīng)元起保護(hù)作用，且二者對(duì)保護(hù)缺血神經(jīng)元可能有協(xié)同作用[36]。

以上結(jié)論表明：NGF可通過(guò)抑制Caspase-3的表達(dá)實(shí)現(xiàn)對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)，但NGF如何對(duì)Caspase-3進(jìn)行作用尚不完全清楚，可能與NGF的拮抗興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性、穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平及增加自由基清除劑的活性等作用有關(guān)?？梢圆孪?，在高膽紅素血癥腦損傷致細(xì)胞凋亡的過(guò)程中，有Caspase-3的參與，如果用外源性NGF進(jìn)行干預(yù)，有可能降低腦組織中Caspase-3蛋白的表達(dá)，從而延緩甚至阻斷高膽紅素血癥腦損傷的發(fā)展，而有關(guān)NGF如何影響高膽紅素血癥腦損傷腦組織中Caspase-3表達(dá)的報(bào)道目前仍比較少，這些都有待進(jìn)一步研究。

4 前景及展望

近年來(lái)，高膽紅素血癥腦損傷的發(fā)生發(fā)展過(guò)程及其防治措施逐漸成為研究熱點(diǎn)，但相關(guān)報(bào)道目前仍比較少。眾多體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，過(guò)量膽紅素可加速神經(jīng)細(xì)胞凋亡，且Caspase-3在其中有關(guān)鍵作用，但具體的分子機(jī)制并不清楚，而NGF的神經(jīng)元保護(hù)作用雖然明確，但其分子機(jī)制尚未完全闡明，尤其是在高膽紅素血癥腦損傷中，NGF對(duì)損傷腦組織中Caspase-3表達(dá)的影響及其作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。因此，高膽紅素血癥腦損傷后腦組織中Caspase-3的表達(dá)變化研究及神經(jīng)生長(zhǎng)因子的神經(jīng)元保護(hù)機(jī)制研究，有助于對(duì)高膽紅素血癥腦損傷發(fā)生發(fā)展過(guò)程的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，有望探索出一條可行的高效準(zhǔn)確的干預(yù)通路，以盡可能減輕過(guò)量膽紅素造成的腦損傷，甚至一定程度上阻止高膽紅素血癥腦損傷的發(fā)展。

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（收稿日期：2015-09-15）