楚雄腮扁葉蜂蟲生真菌的分離鑒定及其致病性

夏舉飛，陳玉惠，李永和，劉建宏，徐榮，周航

(1．西南林業(yè)大學林學院，云南省森林災害預警與控制重點實驗室，云南 昆明 650224;2．西南林業(yè)大學生命科學學院，云南 昆明 650224)

楚雄腮扁葉蜂Cephalcia Chuxiongica Xiao隸屬于膜翅目Hymenoptera扁葉蜂科Pamphiliidae腮扁葉蜂屬Cephalcia，以幼蟲危害云南松Pinus yunnanensis、華山松P．armandii、云南油杉Keteleeria evelyniana、雪松Cedrus deodara等松科植物的針葉［1］，受害重的林分，針葉幾乎被取食殆盡，樹上掛滿幼蟲吐絲把蟲糞和針葉碎屑連結而成的幕巢，影響林木的光合作用和木材蓄積量，嚴重時導致林木枯死［2-4］。楚雄腮扁葉蜂在云南主要分布于楚雄、昆明、曲靖、文山等地，并呈進一步擴散蔓延之勢［3］;目前關于該蟲防治方面的研究報道較少，據馬蘋 等報道，在基層生產中主要采取人工摘除幕巢燒毀、翻挖幼蟲和蛹的方法防治;但這些方法不僅費工費時、破壞土表植被，而且難以做到有效而可持續(xù)控制［2］。利用蟲生真菌防治害蟲，已成為以生物防治為主導的綜合治理重要途徑之一，蟲生真菌也是害蟲種群自然調節(jié)的重要因子和害蟲生物防治的重要材料［5］。但至今未見關于楚雄腮扁葉蜂生物防治方面的研究報道。本研究在野外自然罹病死亡的楚雄腮扁葉蜂幼蟲上分離到5株楚雄腮扁葉蜂幼蟲的致病菌，并測定了其對楚雄腮扁葉蜂幼蟲的致病力，以期為楚雄腮扁葉蜂生物防治提供菌種資源和應用依據。

1 材料與方法

1.1 材料來源2014年7月在云南省尋甸縣(N 25．30°，E 103．21°、海拔1970 m)云南松和華山松混交林內，采集土中具有典型癥狀的自然罹病死亡的楚雄腮扁葉蜂幼蟲尸體標本，分別裝入滅菌的離心管內帶回實驗室。2014年11月于尋甸縣林內采集健康楚雄腮扁葉蜂幼蟲，用于回接驗證試驗。

1.2 菌株分離采用組織分離法［6-7］，將蟲尸用75%酒精棉球表面擦拭消毒后，用滅菌小刀切成米粒大小的蟲體組織，依次浸入75%的酒精中3 s，0．1%升汞消毒30 s，無菌水清洗3次，接入含青霉素0．05%的PDA(馬鈴薯:200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉18 g，蒸餾水1000 mL)培養(yǎng)基中。每皿培養(yǎng)基接3塊，置于(25±1)℃恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，接種后的第2天開始觀察，每天1次，適時挑取蟲體組織周圍新長出的少許幼嫩菌絲進行分離純化，直至分離出純菌落后保存、備用。

1.3 菌株的回接驗證及再分離對分離純化得到的菌株擴大培養(yǎng)，待其充分產孢后，用0．05%的吐溫-80水溶液洗下孢子，用渦旋振蕩器充分振蕩，使孢子盡可能分散，然后配制成1．5×108孢子/mL孢子懸浮液，用浸漬法［8］將各菌株的孢子接種到經無菌水沖洗3次的健康楚雄腮扁葉蜂幼蟲體表，每個菌株接種20頭健康幼蟲，并用0．05%吐溫-80水溶液處理作對照。將接種幼蟲放入滅菌的試管(12 mm×70 mm)中，用無菌脫脂棉加無菌水保濕，并用干燥的無菌棉塞封口，置于(25±1)℃恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，每天定時觀察記錄各菌株對楚雄腮扁葉蜂幼蟲的感染和致死情況。

從長出菌絲的楚雄腮扁葉蜂幼蟲體表，挑取少量菌絲于PDA平板上，置于(25±1)℃恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，經純化獲得純菌落后與供試菌株進行培養(yǎng)性狀和形態(tài)結構的比對，篩選出符合柯赫氏法則［6］且對楚雄腮扁葉蜂幼蟲具有致病性的菌株，排除從楚雄腮扁葉蜂幼蟲上分離到的非致病菌株。

1.4 致病菌株的鑒定

1.4.1 培養(yǎng)性狀觀察 將分離純化得到的菌株，取直徑為5 mm的菌塊接種于查氏培養(yǎng)基(NaNO33 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0．5 g，KCl 0．5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0．01 g，蔗糖30 g，瓊脂15 g，蒸餾水1000 mL)上，置于25±1℃恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)14 d后，觀察、描述其培養(yǎng)性狀并拍照。

1.4.2 形態(tài)結構觀察 采用改進的小培養(yǎng)法［8］培養(yǎng)各菌株。在超凈工作臺內將切取的2塊1．5 cm×1．5 cm×1 mm大小的查氏培養(yǎng)基置于無菌載玻片上，用接種針蘸取少許菌株孢子接種于培養(yǎng)基一端，蓋上蓋玻片后，將載玻片置于無菌培養(yǎng)皿內的2根玻璃棒上，培養(yǎng)皿底部墊1層加入適量無菌水的脫脂棉和濾紙以保濕，最后蓋好皿蓋，置于25±1℃恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，從第3天開始每天定時在光學顯微鏡下觀察菌絲的生長及顯微結構并拍照。

1.4.3 分子鑒定 將致病菌株在PDA平板上培養(yǎng)1周，刮取菌絲，采用CTAB法［10］提取DNA，ITS序列測定引物為通用引物ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')和ITS5(5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3')［11］，擴 增 反 應 體 系(50μL):ddH2O 36μL，10×KOD buffer 5μL，2 mmol/L dNTPs 5μL，10μmol/L的ITS4和ITS5各1μL，KOD酶1μL。擴增程序:94℃反應3 min;94℃反應30 s，58℃反應30 s，72℃反應3 min，35個循環(huán);72℃反應10 min。用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，確定有特異擴增后，再擴增1個50μL體系的PCR并進行PCR產物回收?；厥蘸笤儆?%瓊脂糖凝膠檢測DNA。為了數據更加準確，選取條帶清楚的PCR樣品經切膠純化，送往北京信諾金達生物科技有限公司直接測序。

1.5 菌株的致病性將致病菌株進行擴大培養(yǎng)，并按1．3的方法進行孢子懸浮液的配制、接種、培養(yǎng)及觀察記錄，每個致病菌株同樣接種20頭健康幼蟲，并用0．05%吐溫-80水溶液處理作對照組，觀察記錄直至第16天。

1.6 數據處理數據應用Excel和SPSS16．0數據處理系統(tǒng)進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 菌株分離結果經分離和純化，從楚雄腮扁葉蜂自然罹病死亡的幼蟲尸體上分離得到15株真菌，鑒定到屬的12株，分別屬于10屬;未產孢尚不能判斷其分類地位的有3個菌株。各菌株的編號及分類地位見表1。

2.2 菌株的回接驗證及再分離15個菌株回接驗證試驗結果表明，有5個菌株(SWYH01，SWYH02，SWYH06，SWYH07，SWYH09)能夠成功感染楚雄腮扁葉蜂幼蟲，接種3d后均能觀察到在接種幼蟲體表長出的白色菌絲，以及幼蟲表現(xiàn)出反應遲鈍、行動遲緩、體色變化等癥狀，接種16 d后的僵蟲數見圖1。再分離結果顯示，接種蟲體上長出的菌絲體與原接種菌株培養(yǎng)性狀和形態(tài)結構均相同，進一步表明這5株菌均是楚雄腮扁葉蜂幼蟲的致病性蟲生真菌。

表1 分離得到的菌株編號及其分類地位

圖1 幼蟲被不同菌株感染后的僵蟲數

2.3 致病菌株鑒定結果

2.3.1 培養(yǎng)性狀及形態(tài)鑒定 5株致病菌在查氏培養(yǎng)基上培養(yǎng)14 d后的形態(tài)特征(圖2)描述如下。

菌株SWYH01 菌落直徑42 mm，較薄、平坦、絨狀至粉狀;正面白色或黃色，反面淡黃色，培養(yǎng)基無色;產孢細胞基部膨大，球形、近球形，大小(2．5～4．0)μm×(2．8～3．6)μm，向上變細為1～2μm的“Z”形產孢軸，可單生或聚生于菌絲上;分生孢子橢圓形(3．1～5．8)μm×(2．6～3．1)μm、近球形(1．3)2．0～3．5(4．0)μm。

菌株SWYH02 菌落直徑60 mm，疏松絨狀或粉狀，平展，表面具有肉色凸起小顆粒，具有3個明顯的輪層;正面紫灰色或淡紫色，反面米色或淡紫色，培養(yǎng)基無色;分生孢子梗(7．5～13．0)μm×(2．0～3．0)μm，長短差異大;輪生體由3～6個產孢細胞組成，產孢細胞基部呈柱狀膨大或不膨大，頂部細，孢子呈鏈狀排列。分生孢子橢圓形或近橢圓形，2．0～3．0(4．0)μm。

菌株SWYH06 菌落直徑60 mm，絮狀，由內向外厚薄不均，表面有明顯小液滴;正面白色或淡黃色，反面淡黃色，培養(yǎng)基無色;產孢細胞擬青霉型或輪枝孢型，單生或簇生于菌絲或分生孢子梗上;擬青霉型分生孢子梗明顯，長短不一，(13．0～18．5)μm×(2．0～3．0)μm，基部膨大，向上逐漸變細，頸部細長，2～4個形成的輪生體著生于分生孢子梗上;輪枝孢型分生孢子梗(15．5～31．5)μm×(2．5～3．0)μm，不發(fā)達，似營養(yǎng)菌絲，其上有單生、對生或1～3個輪生的產孢細胞，纖細，基部膨大不明顯，向上逐漸變細，頸部長;分生孢子粘結成頭狀，臘腸形(5．0～6．0(7．8))μm ×(2．5～3．0)μm，球 形(2．6～4．0(5．0))，橢圓形(4．5～7．0(7．8))μm ×(2．5～4．0)μm，卵形(4．0～5．5)μm×(2．5～4．0)μm。

菌株SWYH07 菌落直徑45 mm，中央氣生菌絲突起、疏松，向外氣生菌絲減少、變薄;正面白色、淡黃色或橘黃色，反面橘黃色，培養(yǎng)基無色;分生孢子梗不規(guī)則分枝，長短不一，其上著生有2～4個產孢細胞組成的輪生體，產孢細胞(5．0～13．0)μm×(2．0～3．0)μm，基部擬橢圓形膨大，向上變細成明顯的頸部。分生孢子呈鏈狀排列，球形(2．0～3．0)μm或擬橢圓形(1．3～2．5)μm×(2．0～3．0)μm。

菌株SWYH09 菌落直徑35 mm，內部疏松，邊緣緊密突起;正面白色、乳白色或淡黃色，反面黃色或淡黃色，培養(yǎng)基無色;產孢細胞(4．0～11．5)μm×(3．0～4．5)μm，基部球形、近球形，多簇生于囊泡上，偶見直接著生于菌絲上;產孢軸纖細具齒突，長2．6～18．2μm，呈“Z”字形彎曲。分生孢子球形(1．3)2～2．9μm或近球形。

圖2 各菌株的形態(tài)特征

通過培養(yǎng)性狀及形態(tài)結構觀察，結合中國真菌志第三十二卷［12］、第四十三卷［13］、第四十七卷［14］初步判定菌株SWYH01為白僵菌屬Beauveria的布氏白僵菌B．brongniartii，SWYH02為擬青霉屬Paecilomyces的淡紫擬青霉P．lilacinus，SWYH06為生赤殼屬Bionectria的淡色叢赤殼B．ochroleuca，SWYH07為棒束孢屬Isaria的粉質棒束孢I．farinosa，SWYH09為白僵菌屬的球孢白僵菌B．bassiana。

2.3.2 分子生物學鑒定 將各菌株測得的ITS基因序列在NCBI上進行BLAST比對，發(fā)現(xiàn)菌株SWYH01與布氏白僵菌(JX110373．1和JX110374．1)的相似度均為98%;SWYH02與淡紫擬青霉(GU980015．1和HM242262．1)的相似度均為99%;SWYH06與淡色叢赤殼(GU112755．1和AB003950．1)的相似度均為99%;SWYH07與粉質棒束孢(AB233337．1和KC768083．1)的相似度均為99%;SWYH09與球孢白僵菌(JN379794．1和KC753398．1)的相似度均為99%。

結合該5株菌的培養(yǎng)性狀和形態(tài)結構鑒定結果，確定菌株SWYH01為白僵菌屬的布氏白僵菌，SWYH02為擬青霉屬的淡紫擬青霉，SWYH06為生赤殼屬的淡色叢赤殼，SWYH07為棒束孢屬的粉質棒束孢，SWYH09為白僵菌屬的球孢白僵菌。

2.4 菌株對楚雄腮扁葉蜂幼蟲的致病性幼蟲感染不同菌株后，體色變化基本相似，均由原來的鮮綠色逐漸變?yōu)辄S色、淡黃色、深棕色或褐色，但不同菌株的孢子在蟲體上的萌發(fā)速度及侵染部位有所差異，5個菌株中有4個菌株(淡色叢赤殼除外)的孢子主要侵染幼蟲的頭部、尾部和節(jié)間褶;而淡色叢赤殼菌株的孢子則主要侵染幼蟲的氣門處，并且孢子萌發(fā)速度最快，在接種的第2天便在幼蟲的多個氣門處觀察到菌絲的生長。其它菌株則需3～4 d才能在蟲體上見到菌絲。5個菌株接種幼蟲后隨著孢子萌發(fā)和菌絲的不斷生長覆蓋，蟲體逐漸僵化死亡，有的蟲體干癟，失去原有形態(tài)(圖3)。

圖3 不同菌株感染后的楚雄腮扁葉蜂幼蟲癥狀

5個致病菌株在接種濃度為1．5×108個/mL孢子時，對楚雄腮扁葉蜂幼蟲均有一定的致病性，但致病力強弱有差異。致病力最強的是SWYH06，接種后16 d幼蟲校正死亡率高達100%;SWYH02的致病力較弱，幼蟲校正死亡率僅為43．64%。各菌株的致病性由強到弱依次為SWYH06，SWYH07，SWYH01，SWYH09，SWYH02。

表2 5個不同菌株對楚雄腮扁葉蜂幼蟲的致病性測定結果

3 結論與討論

野外采集樣本的過程中，發(fā)現(xiàn)真菌對楚雄腮扁葉蜂的寄生主要發(fā)生在幼蟲期。在云南省尋甸縣楚雄腮扁葉蜂化蛹前和老熟幼蟲下樹入土1個月后，有些個體出現(xiàn)自然罹病死亡情況，發(fā)病初期先在頭部、節(jié)間褶和氣門處長出少量白色菌絲，蟲體綠色;隨時間推移，蟲體表面菌絲生長量不斷增加，白色菌絲覆蓋范圍不斷擴大，最后整個蟲體被一層厚厚的白色菌絲完全包裹或從蟲體不同部位長出白色或黃色的孢梗束，蟲體變僵，蟲體顏色由原來的綠色變?yōu)辄S色、深棕色或黑色。

本研究從楚雄腮扁葉蜂自然罹病死亡幼蟲上分離的SWYH01(布氏白僵菌)、SWYH02(淡紫擬青霉)、SWYH06(淡色叢赤殼)、SWYH07(粉質棒束孢)、SWYH09(球孢白僵菌)5株蟲生真菌為楚雄腮扁葉蜂幼蟲的病原菌，其對楚雄腮扁葉蜂幼蟲的室內感染方式與林內感染方式基本一致，除菌株SWYH06(淡色叢赤殼)主要從氣門感染幼蟲外，其余菌株均從頭部、尾部、節(jié)間褶等部位感染幼蟲。

據初步統(tǒng)計，全世界已知扁葉蜂科昆蟲種類250種以上，中國已知腮扁葉蜂屬的昆蟲有19種［15］。從扁葉蜂科昆蟲蟲體上分離蟲生真菌，國內外卻鮮見報道，本研究從楚雄腮扁葉蜂自然罹病死亡幼蟲蟲體上分離蟲生真菌尚屬首次。采用形態(tài)和分子生物學方法對5株致病性真菌進行了鑒定。其中球孢白僵菌、布氏白僵菌、粉質棒束孢、淡紫擬青霉為有歷史記載的昆蟲致病菌［16］，而淡色叢赤殼在前人的相關研究中主要集中在植物內生真菌和真菌寄生菌等方面［14］，本文首次發(fā)現(xiàn)其對昆蟲的寄生性和致病性，而且對楚雄腮扁葉蜂的室內致病力明顯高于其他菌株，該菌株對楚雄腮扁葉蜂的防控有較大的開發(fā)應用潛力。但淡色叢赤殼的生物學特性、寄主范圍和其在林內對楚雄腮扁葉蜂幼蟲的防控效果還有待進一步研究。

志謝:本文在蟲生真菌分離和形態(tài)鑒定中，得到西南林業(yè)大學周彤燊教授的指導和幫助，在此表示衷心的感謝。

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