酵母雙雜交系統(tǒng)及其應(yīng)用研究進展

崔紅軍， 魏玉清

(北方民族大學生物科學與工程學院，寧夏銀川 750021)

酵母雙雜交系統(tǒng)及其應(yīng)用研究進展

崔紅軍， 魏玉清

(北方民族大學生物科學與工程學院，寧夏銀川 750021)

酵母雙雜交系統(tǒng)作為一種有效研究蛋白質(zhì)相互作用的分子生物學方法，具有真實、高效、敏感、廣泛的特點，被廣泛應(yīng)用于諸如蛋白質(zhì)組學、基因組學等領(lǐng)域。主要對酵母雙雜交技術(shù)的原理、特點及應(yīng)用現(xiàn)狀進行了綜述。

酵母雙雜交系統(tǒng)；蛋白質(zhì)相互作用；應(yīng)用

蛋白質(zhì)是細胞中的實際功能分子，具有負責細胞生物化學活性的功能，隨著生物化學和分子生物學研究技術(shù)和手段的不斷深入，蛋白質(zhì)分子間的相互作用作為蛋白質(zhì)組學研究的主要內(nèi)容之一已成為近年來的研究熱點。蛋白質(zhì)互作不但能夠提供蛋白質(zhì)本身功能的信息，而且能夠提供蛋白質(zhì)在代謝調(diào)控、信號傳導和復(fù)合體中起作用的信息[1]。篩選、分析蛋白質(zhì)互作的方法有很多種，主要包括生物化學法，如共純化、親和純化和免疫共沉淀，質(zhì)譜技術(shù)，離子體共振技術(shù)，生物物理技術(shù)，噬菌體展示技術(shù)和酵母雙雜交技術(shù)等[2]。目前，酵母雙雜交技術(shù)當屬研究蛋白質(zhì)互作方法中較為高效、靈敏和簡便的一種方法。

1 酵母雙雜交系統(tǒng)的基本原理

酵母雙雜交系統(tǒng)是由Fields等[3]根據(jù)真核轉(zhuǎn)錄調(diào)控的特點于1989年首次提出并建立，可直接于細胞內(nèi)檢測蛋白質(zhì)的相互作用。其原理為：真核生物有上游激活序列(UAS)，在轉(zhuǎn)錄水平上進行基因的表達調(diào)控，如酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4含有2個或2個以上的結(jié)構(gòu)域，其中包括2個極其重要且可以彼此分割開的結(jié)構(gòu)域，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-binding domain, BD)和DNA轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(Transcription- activating domain, AD)。BD識別并結(jié)合于效應(yīng)基因上游激活序列，AD與BD結(jié)合成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，從而激活UAS下游報告基因的轉(zhuǎn)錄。AD和BD的單獨存在并不能激活下游基因的轉(zhuǎn)錄作用，只有兩者在空間上互相接近，下游報告基因才能得以表達。BD與表達已知蛋白X的基因片段連接，構(gòu)建成BD-X質(zhì)粒載體，AD與cDNA文庫表達未知蛋白Y的基因片段或基因突變體Y連接，構(gòu)建成AD-Y質(zhì)粒載體，把蛋白X和Y分別稱為誘餌蛋白(bait)和靶蛋白(prey)，將BD-X和AD-Y共同轉(zhuǎn)化到酵母菌體內(nèi)，此酵母菌體內(nèi)有報告基因(LacZ、His、Leu、Trp、ADE等[4])而本身并無報告基因轉(zhuǎn)錄活性。當BD-X和AD-Y這2個融合蛋白表達并相互作用時，則在空間結(jié)構(gòu)上將AD和BD拉近，從而形成轉(zhuǎn)錄因子，激活UAS下游報告基因的表達，使此轉(zhuǎn)化體可以在His、Leu、Trp、ADE等特定營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基上生長，并由于LacZ報告基因的表達，酵母菌會分泌β-半乳糖苷酶，X-gal在β-半乳糖苷酶的存在下，會變成藍色底物，從而使陽性菌落呈藍色。當BD-X和AD-Y不融合時，下游基因不表達，據(jù)此分析判斷2個蛋白是否相互作用。在目前通用系統(tǒng)中,根據(jù)BD來源不同可分為GAL4系統(tǒng)和LexA系統(tǒng)。真核細胞中是GAL4系統(tǒng);原核細胞中是LexA系統(tǒng),其轉(zhuǎn)錄啟動因子是LexA。

2 酵母雙雜交系統(tǒng)的研究歷史

酵母雙雜交系統(tǒng)在應(yīng)用中得到不斷改進和完善，并衍生出幾個新的系統(tǒng)。1993年，Li等[5]提出酵母單雜交系統(tǒng)，在單雜交系統(tǒng)中無需轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域和誘餌蛋白的融合蛋白與DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和靶蛋白的融合蛋白結(jié)合來激活報告基因的表達，轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合蛋白可直接與特異DNA序列結(jié)合激活報告基因表達，單雜交系統(tǒng)是研究轉(zhuǎn)錄因子分離鑒定的有效方法[6]。1996年,Vidal等[7]提出反向酵母雙雜交系統(tǒng)，即使用表達產(chǎn)物對酵母菌本身有毒性的報告基因，當誘餌蛋白和靶蛋白沒有相互作用或者相互解離時酵母菌株能夠正常生長。此雙雜交模式更適用于研究蛋白質(zhì)間作用位點或者利用抑制或阻斷蛋白質(zhì)間相互作用來尋找藥物。1996年，Sengupta等[8]提出酵母三雜交系統(tǒng)，它與雙雜交的不同在于激活結(jié)構(gòu)域融合蛋白與結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合蛋白之間的相互作用需要第三組分的介導來完成，該組分可為RNA、蛋白質(zhì)或小分子物質(zhì)。1997年，Aronheim等[9]提出Sos招募系統(tǒng)，其原理為哺乳動物的Ras鳥苷酸交換因子Sos蛋白為一種胞質(zhì)蛋白，酵母中其同源Ras鳥苷酸交換因子Cdc25蛋白定位于細胞膜上。Cdc25突變可產(chǎn)生溫度敏感缺陷型細胞，使酵母菌株不能在37 ℃下生長，可將Sos蛋白定位在細胞膜上代替Cdc25蛋白的作用，激活Ras信號通路，恢復(fù)酵母菌株在37 ℃條件下生長的能力。酵母雙雜交及其衍生系統(tǒng)在蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間、蛋白質(zhì)與核酸間以及蛋白質(zhì)與其他小分子間互作的研究中起著舉足輕重的作用。

3 酵母雙雜交系統(tǒng)的主要特點

酵母雙雜交技術(shù)可以精確地分析已知蛋白間的相互作用，以及篩選編碼未知蛋白的基因，具有真實性、敏感性、高效性、廣泛性等[10]特性。即便雙雜交是檢驗蛋白質(zhì)互作的有效方法，其自身也存在缺點，如易產(chǎn)生假陽性、假陰性等。

3.1 酵母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)點

(1)檢測蛋白質(zhì)的相互作用是在真核細胞內(nèi)進行，在核酸水平上操作，避免了蛋白質(zhì)的分離純化過程，保證了蛋白質(zhì)的活性，所以能更加真實地反映蛋白質(zhì)互作情況。

(2)報告基因表達產(chǎn)物的積累，使雙雜交技術(shù)能敏感地檢測到蛋白質(zhì)間微弱、暫時的作用。

(3)可以直接從cDNA文庫中篩選與已知蛋白質(zhì)相互作用的基因片段。雙雜交技術(shù)應(yīng)用廣泛，可采用不同類型細胞構(gòu)建cDNA文庫，分析不同類型細胞的蛋白質(zhì)功能。

(4)酵母菌有不同的標記基因：營養(yǎng)缺陷型基因、抗性基因，易于相互作用的蛋白質(zhì)的篩選。

3.2 酵母雙雜交系統(tǒng)的局限性及改進

(1) 假陽性。假陽性是酵母雙雜交中的主要問題。由于某些蛋白質(zhì)本身具有激活報告基因表達的功能，無需誘餌蛋白和靶蛋白的特異性結(jié)合，某些蛋白和空載體的結(jié)合也可激活轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，抑或是某些蛋白質(zhì)表面有其他蛋白質(zhì)的低親和力區(qū)，易于激活報告基因的表達，產(chǎn)生假陽性現(xiàn)象。針對上述不足，研究者們對報告基因進行改進[11]，對其載體構(gòu)建策略進行改進[12]等，提出雙篩選系統(tǒng)和假陽性顯示分析法，顯著減少假陽性的產(chǎn)生。

(2) 假陰性。假陰性雖不是酵母雙雜交中的主要問題，但仍需重視。其常見原因：一是兩蛋白質(zhì)間作用微弱使得報告基因不表達或表達量少而使其難以檢測，對其進行改進應(yīng)選擇高敏感的菌株及多拷貝載體。二是誘餌蛋白和靶蛋白融合體的表達對細胞有毒害作用，應(yīng)選擇敏感性低的菌株或拷貝數(shù)低的載體[8]。

(3) 核內(nèi)反應(yīng)。利用酵母雙雜交研究互作蛋白質(zhì)必須定位在細胞核內(nèi)，這限制了核外蛋白質(zhì)的研究。針對此現(xiàn)象，產(chǎn)生了Sos恢復(fù)系統(tǒng)[9]，將互作蛋白的研究場所轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)中。

(4) 此外，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化率的高低是成敗的關(guān)鍵。研究表明質(zhì)粒轉(zhuǎn)化過程中共轉(zhuǎn)化比依次轉(zhuǎn)化效率高[13]。

4 酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用

酵母雙雜交作為具有開創(chuàng)意義的研究方法，是研究蛋白質(zhì)互作，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的重要手段，目前已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間、蛋白質(zhì)與核酸間以及蛋白質(zhì)與其他小分子間相互作用的研究。該技術(shù)也可用于大規(guī)模蛋白質(zhì)間互作的研究,具有易于自動化、高通量[14]等特點。

4.1 檢測已知蛋白質(zhì)間的互作建立酵母雙雜交系統(tǒng)最初是為了研究已知蛋白間的互作。至今應(yīng)用雙雜交系統(tǒng)已證實了大量蛋白質(zhì)間的相互作用。如已知玉米類pto和類ptil基因參與逆境脅迫的信號傳導，鄒華文等[15]利用雙雜交技術(shù)初步確定只有Zmpto和Zmptil相互作用時才能激活報告基因的表達。柑橘衰退病毒(CTV)能引起柑橘衰退病，CTV編碼的外殼蛋白CP和P20蛋白均存在自身互作，Chofong等[16]運用雙雜交技術(shù)分析和GST-pulldown體外驗證，表明P20氨基酸序列N端的1～21位氨基酸及CP氨基酸序列N端的41～84位氨基酸對自身互作具有重要作用。PML是與急性早幼粒細胞白血病(APL)發(fā)病機制相關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)，包含PML的coild-coil結(jié)構(gòu)域，命名為PML-C。2010年，朱丹等[17]從白血病cDNA文庫篩選出包含CYPN2蛋白在內(nèi)的9種與PML-C結(jié)構(gòu)域相互作用的蛋白質(zhì)，為闡明APL發(fā)病機制提供新的思路。2012年，吳秀娟等[18]利用酵母雙雜交以及免疫共沉淀試驗進一步驗證PML-C和CYPN2之間的相互作用，PML-C和CYPN2作用形成的復(fù)合物可能影響CYPN2的正常功能，與APL發(fā)病有重要關(guān)系。

4.2 發(fā)現(xiàn)新蛋白及蛋白新功能酵母雙雜交最重要的用途是從cDNA文庫中尋找與已知蛋白相互作用的未知蛋白[19]，繼而研究蛋白互作效應(yīng)。目前研究者應(yīng)用雙雜交系統(tǒng)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多新蛋白。如崔雨明等[20]利用酵母雙雜交技術(shù)在人白細胞文庫中篩選到8個與流感病毒PB1-F2蛋白相互作用的宿主蛋白，為探索流感病毒致病機理指明了一定方向，提供一定理論基礎(chǔ)。 GsCBRLK在 ABA 及鹽脅迫誘導的鈣離子信號通路中起著關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，為更加深入地研究GsCBRLK的作用機制，楊姍姍等[21]應(yīng)用酵母雙雜交篩選到SNARE和14-3-3兩種與GsCBRLK互作的蛋白。獨腳金內(nèi)酯(SLs)是一種抑制植物分枝的新型激素，其合成及信號傳導途徑尚不清楚，王濤[22]以多個水稻矮化多分蘗突變體包為試驗材料研究SLs，利用酵母雙雜交等方法篩選到與SLs信號途徑中D3和D14互作的蛋白質(zhì)，為闡明SLs調(diào)控水稻分蘗、植物分枝的作用機制奠定了理論基礎(chǔ)。為明確不結(jié)球白菜 Pol胞質(zhì)雄性不育相關(guān)基因的信號傳遞通路,錢瑜等[23]構(gòu)建了不結(jié)球白菜Pol胞質(zhì)雄性不育花酵母雙雜交cDNA文庫，篩選到與細胞色素C還原酶鐵硫蛋白( BCRISP1)互作的蛋白CYP81G和PIP2。

4.3 篩選多肽類藥物及尋找藥物作用位點分子間相互作用可能導致疾病的產(chǎn)生，研究表明，多肽類藥物對治療癌癥和病毒類等疾病最有效。利用酵母雙雜交技術(shù)篩選與來源于腫瘤、細菌及病毒的蛋白間相互作用的多肽類藥物，分析疾病發(fā)生機理，確定藥物互作蛋白在腫瘤、細菌及病毒中的位置，有目標性地干擾疾病蛋白的表達，已達到治療疾病的預(yù)期效果。Waheed等[24]利用細菌逆向雙雜交篩選出一種細胞周期蛋白，可干擾Gag蛋白與TsG101的結(jié)合，阻斷 HIV-1在宿主內(nèi)的出胞過程。秦咸蘊[25]運用雙雜交篩選出引起手足口病的腸道病毒EV71的抑制活性中藥，為治療腸道病毒疾病提供了理論基礎(chǔ)。人巨細胞病毒(HCMC)是導致胎兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常的一種感染性病原，王慧等[26]利用酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)鼠巨細胞病毒(MCMV)即刻早期基因M122 蛋白與宿主因子Myst4相互作用的結(jié)合位點位于M122蛋白的1～148氨基酸，為預(yù)防和治療MCMV導致的神經(jīng)系統(tǒng)異常提供一定的理論基礎(chǔ)。

4.4 建立蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)許多蛋白在功能上是互相聯(lián)系的，在生命活動中彼此協(xié)調(diào)控制。隨著基因組計劃的完成，大量開放閱讀框產(chǎn)生，研究閱讀框的功能成為后續(xù)任務(wù)，這些基因的功能由其編碼產(chǎn)生的蛋白質(zhì)體現(xiàn)，利用酵母雙雜交技術(shù)研究蛋白互作，并向大規(guī)模、自動化、高通量方向成熟[27]，建立起蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)。建立蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)能更加系統(tǒng)地了解生命活動，尋找有利蛋白，解決困擾人類的重大疾病[28]等。郜盡[29]在研究肝臟調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子時選擇32個ORF為誘餌篩選互作蛋白，繪制肝臟再生過程中轉(zhuǎn)錄因子互作網(wǎng)絡(luò)，為肝臟蛋白質(zhì)組學研究提供新思路。加拿大和美國科學家組成的一個國際研究小組，繪制出迄今最大規(guī)模的人類基因組編碼蛋白間直接相互作用的圖譜，并預(yù)測出數(shù)十個與癌癥相關(guān)的新基因，包括蛋白質(zhì)間 1.4 萬個直接相互作用[30]。相信完成此項研究將會解釋困擾人類的眾多問題。

5 存在問題與展望

酵母雙雜交系統(tǒng)自建立以來，雖存在假陽性、假陰性等局限性，但仍處于不斷改進和完善的過程。因其快速、靈敏、高效的特征被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)間的相互作用，蛋白質(zhì)與基因的結(jié)構(gòu)功能，新型多肽類藥物的開發(fā)與利用等多個領(lǐng)域，并在此基礎(chǔ)上衍生出酵母單雜交系統(tǒng)、反向酵母雙雜交系統(tǒng)、酵母三雜交系統(tǒng)及Sos恢復(fù)系統(tǒng)等。為人類提供大量生物學信息，為人類獲得生物體內(nèi)蛋白質(zhì)間作用關(guān)系的有效途徑。隨著科學研究的不斷深入，相信酵母系統(tǒng)必將發(fā)揮越來越重要的作用。

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Review on Application Status of Yeast Two Hybrid System

CUI Hong-jun, WEI Yu-qing

(College of Bioscience and Bioengineering, Beifang University of Nationalities, Yinchuan, Ningxia 750021)

The yeast two hybrid system, as a kind of effective molecular biology method for studies of protein interactions, is real, effective, sensitive, and popular, which is widely used in proteomics, genomics and other fields. The principle, characteristics and application status of yeast two hybrid technology were reviewed.

Yeast two hybrid system; Protein-protein interaction; Application

北方民族大學國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(201311407019)。

崔紅軍(1990- )，女，河北河間人，本科生，專業(yè)：生物工程。

2015-03-24

S 188

A

0517-6611(2015)13-045-03