己糖激酶-Ⅱ在直腸癌組織中表達(dá)臨床意義

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己糖激酶-Ⅱ在直腸癌組織中表達(dá)臨床意義

龔海*，石欣，劉雙海

（東南大學(xué)附屬江陰醫(yī)院肛腸外科，江蘇214400）

[摘要]目的：檢測己糖激酶-Ⅱ基因在直腸癌組織中表達(dá)，探討其與患者預(yù)后的關(guān)系。方法：通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）、蛋白質(zhì)印跡方法、免疫組織化學(xué)方法了解己糖激酶-Ⅱ在直腸癌100例組織中表達(dá)，探討與腫瘤病理因素關(guān)系。結(jié)果：RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示直腸癌組織陽性表達(dá)己糖激酶-Ⅱ在RNA水平顯著高于正常組織陽性表達(dá)。直腸癌組織中己糖激酶-Ⅱ表達(dá)陽性率顯著高于對照組（P＜0.01）。腫瘤大小、分化程度、合并腫瘤分期與己糖激酶-Ⅱ的表達(dá)呈正相關(guān)（P值分別為P=0.001，P=0.000，P=0.019），而淋巴轉(zhuǎn)移與否與己糖激酶-Ⅱ的表達(dá)無相關(guān)性（P=0.815）。結(jié)論：直腸癌組織中HK-Ⅱ呈高表達(dá)，HK-Ⅱ抑制劑能抑制腫瘤糖酵解從而抑制腫瘤生長、增殖，促進(jìn)腫瘤凋亡，為腫瘤治療提供契機(jī)。

[關(guān)鍵詞]直腸癌；己糖激酶-Ⅱ；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)；蛋白質(zhì)印跡法；免疫組織化學(xué)法

2000年Hanahan等[1]在Cell雜志上提出了能量代謝失衡是腫瘤細(xì)胞特征之一。而己糖激酶（hexokinase，HK）是糖酵解的關(guān)鍵限速酶，能將葡萄糖轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖，為惡性腫瘤細(xì)胞提供能量從而促進(jìn)腫瘤的生長及增殖。HK家族有多種亞型，大多數(shù)惡性腫瘤在HK-II亞型中呈高表達(dá)。國內(nèi)外在肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等方面有所探討，但在直腸癌中目前相關(guān)資料比較少。本研究通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR）、蛋白質(zhì)印跡法（Western-blot）、免疫組織化學(xué)法了解己糖激酶-Ⅱ在直腸癌組織中表達(dá)，并分析其與腫瘤大小、臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移等臨床特征之間的關(guān)系。

1　資料與方法

1.1一般資料直腸癌根治術(shù)100例腫瘤新鮮標(biāo)本、癌組織石蠟標(biāo)本及距離腫瘤2cm癌旁組織的石蠟標(biāo)本，其中新鮮標(biāo)本于標(biāo)本離體后0.5小時內(nèi)放入液氮中保存。入組標(biāo)準(zhǔn)：（1）病理診斷明確，病理分期采用美國腫瘤研究聯(lián)合會（AJCC）和國際抗癌聯(lián)盟（UICC）共同制定公布的第7版TNM分期；（2）患者未接受術(shù)前化療或放療；（3）患者均知情同意。

1.2方法

1.2.1RT-PCR：按試劑說明行RNA提取，取2μgRNA應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；HK-II及GAPDH引物由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。HK-II（442bp）上游引物：5’-GGC AAT GAA ACC AAA GCC AGG AG-3’，下游引物：5’-GGA AGG AGG AGC CAG AAG CAA CC-3’；GAPDH（715bp）上游引物：5’-CAA ATT CCA TGG CAC CGT CA-3’，下游引物：5’-GGA GTG GGT GTC GCT GTT GA-3’；每對引物均位于不同的外顯子，避免擴(kuò)增包含基因組DNA，管家基因GAPDH作內(nèi)參。PCR反應(yīng)程序（HK-II）：94℃預(yù)變性5min，94℃1min，58℃45s，72℃1min，35個循環(huán)，4℃恒溫保存。PCR反應(yīng)程序（GAPDH）：94℃預(yù)變性5min，94℃45s，58℃45s，72℃45s，35個循環(huán)，4℃恒溫保存。PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)對凝膠進(jìn)行掃描拍照。

1.2.2Western-blot印跡法：提取直腸癌組織及癌旁正常組織蛋白，按照BCA蛋白濃度測定試劑盒方法測定腫瘤細(xì)胞蛋白濃度。然后行蛋白電泳，電泳凝膠有10%分離膠和5%濃縮膠，每孔上樣60μg蛋白進(jìn)行電泳。電泳電壓為40V，待溴酚蘭電泳進(jìn)入至分離膠后，將電壓提高至60V，直至溴酚藍(lán)到達(dá)玻璃板底部時則停止電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。放于室溫下晾干至過夜，DAB染色1～5min，出現(xiàn)清晰條帶時終止顯色，凝膠電泳圖像掃描儀進(jìn)行掃描及圖像分析。

1.2.3免疫組化法檢測：將石蠟切片標(biāo)記好后脫蠟及水化，采用檸檬酸鈉法進(jìn)行抗原修復(fù)，用濕切片筆將石蠟組織圈起來阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。PBS沖洗除去多余非特異性抗原，加兔抗人單克隆抗體，滴加DAB顯色液，用蘇木素核復(fù)染后脫水和透明，鏡下觀察免疫組化結(jié)果。判斷標(biāo)準(zhǔn)：陽性染色為細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒。每張切片選擇5個高倍視野（10×20），計數(shù)不少于500個細(xì)胞，取均數(shù)并評分。不著色為0分，淡色為1分，深色為2分。著色細(xì)胞占計數(shù)細(xì)胞百分比：＜5%為0分，6%～25%為l分，26% ～50%為2分，＞51%為3分。染色程度與染色細(xì)胞百分比乘積為最終計算結(jié)果，乘積＞1分陽性。兩組應(yīng)用ImageProPlus軟件采用定量法分析實驗切片，隨機(jī)選取5個高倍視野，計算單位陽性面積IOD值（積分光密度值），比較兩組間差異。該值越低，表明切片透光性越弱，染色越深，即切片陽性染色顆粒越多，反映染色陽性的HK-Ⅱ蛋白越多。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析，計量指標(biāo)采用x-±s表示，組間差異性比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1RT-PCR檢測結(jié)果顯示直腸癌HK-II陽性表達(dá)在RNA水平顯著高于正常組織HK-II中的表達(dá)（圖1）。

圖1　RT-PCR檢測結(jié)果

2.2Western-blot檢測結(jié)果顯示直腸癌HK-II陽性表達(dá)在蛋白質(zhì)水平顯著高于正常組織HK-II中的表達(dá)（圖2）。

圖2　Western-blot檢測結(jié)果

2.3免疫組化檢測結(jié)果顯示直腸癌HK-II陽性表達(dá)在蛋白質(zhì)水平顯著高于正常組織HK-II中的表達(dá)（圖3）。

2.4直腸癌組織與直腸組織中HK-II表達(dá)與患者臨床病理因素的關(guān)系見表1。

圖3　免疫組化檢測結(jié)果（200×）

表1　直腸癌組織與直腸組織中HK-II表達(dá)與患者臨床病理關(guān)系　例（%）

3　討　論

直腸癌在我國是常見的惡性腫瘤之一，目前其發(fā)病率有逐年上升的趨勢，平均年遞增速度約為4.2%[2]。直腸癌的發(fā)病與飲食、環(huán)境、炎性腸病、遺傳、結(jié)腸息肉等多種因素有關(guān)。近年來隨著分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，可從基因水平進(jìn)一步揭示直腸癌發(fā)病原因。1931年Warburg發(fā)現(xiàn)[3]，惡性腫瘤優(yōu)先利用糖酵解釋放的能量來滿足細(xì)胞的需要。也就是說腫瘤細(xì)胞即使氧氣供應(yīng)充足，能夠比正常組織把更多的葡萄糖代謝為乳酸，即所稱的Warburg效應(yīng)。在哺乳類動物的體內(nèi)，一共有4種亞型的己糖激酶，其中HK-Ⅱ與惡性腫瘤關(guān)系密切。HK-Ⅱ的升高對于促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞糖酵解具有重要的意義，有力的糖酵解和生物合成代謝途徑，為腫瘤在宿主組織內(nèi)不受控制的增殖提供了正性的支持[4-5]。研究表明分化型結(jié)腸癌氧化磷酸化比例高于未分化型，未分化型結(jié)腸癌細(xì)胞中糖酵解比例升高，因此HK-Ⅱ可能是腫瘤生長速率的指標(biāo)[6]。對人類結(jié)腸癌移植腫瘤中不同移植瘤的分析表明，結(jié)腸癌中HK-Ⅱ活性的差異與腫瘤生長具有相關(guān)性，可作為腫瘤生長速率指標(biāo)[6]。因此己糖激酶對于惡性腫瘤細(xì)胞的生存起著重要的作用。

本實驗在基因水平和蛋白水平，檢測HK-Ⅱ在直腸癌切片中的表達(dá)情況。免疫組織化學(xué)法檢測發(fā)現(xiàn)，在直腸癌組織中HK-Ⅱ表達(dá)陽性率明顯高于正常直腸組織。證實在直腸癌組織中HK-Ⅱ明顯高表達(dá)，與其他文獻(xiàn)結(jié)果一致。同時發(fā)現(xiàn)在癌組織中，HK-Ⅱ的高表達(dá)與腫瘤的大小、組織分化及臨床病理Dukes分期間呈明顯正相關(guān)。HK-Ⅱ的表達(dá)在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否無明顯相關(guān)性，分析發(fā)現(xiàn)部分肝轉(zhuǎn)移病例淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移，考慮這可能影響統(tǒng)計分析。結(jié)果證明腫瘤越大，HK-Ⅱ的表達(dá)越高，表明在較大的腫瘤中存在較強(qiáng)的無氧糖酵解。結(jié)果證明分化程度越低，HK-Ⅱ表達(dá)越高，表明在分化較差的腫瘤中糖酵解增強(qiáng)。結(jié)果證明腫瘤臨床分期的越晚，HK-Ⅱ陽性表達(dá)率越高。

氯尼達(dá)明等藥物抑制HK來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，HK的抑制劑在早期動物試驗中已經(jīng)取得一定的成果[7-8]。但是關(guān)于HK-Ⅱ與腫瘤的關(guān)系主要是來自腫瘤細(xì)胞株，而目前以患者為對象的研究少見。本實驗研究結(jié)果顯示，直腸癌組織中HK-Ⅱ呈高表達(dá)，假如使用HK-Ⅱ抑制劑來抑制腫瘤糖酵解從而抑制腫瘤生長、增殖，促進(jìn)腫瘤凋亡，此可為腫瘤的治療提供了契機(jī)，很可能成為當(dāng)今腫瘤研究的一個新熱點(diǎn)。

[參考文獻(xiàn)]

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The clinical value of Hexokinase-II expression in carcinoma of the rectum

GONG Hai，SHI Xin，LIU Shuanghai

（Department of Anorectal Surgery，Jiangyin Hospital Affiliated to Nantong University，Jiangsu 214400）

[Abstract]Objective:To study the expression of Hexokinase-II in carcinoma of the rectum，and analyze the relationships between HK-II expression and the clinical features. Methods: The expression of HK-II in 100 carcinoma of the rectum tissue was checked by using reverse transcriptase polymerase chain reaction，Western blot and inununohistochemistry technique.Then the relationships between HK-II expression and the clinical features of carcinoma of the rectum patients were further investigated，such as tumor sizes，clinical stages，differentiation levels，lymphatic metastasis. Results:RT-PCR result showed that positive expression HK-II in carcinoma of the rectum tissue were higher than that in normal tissue on RNA level.Western blot result showed that positive expression HK-II in carcinoma of the rectum tissue were higher than that in normal tissue on protein level.Inununohistochemistry results showed that the cancer tissue had more positive expression than normal rectal mucosa tissue（P=0.000）.Inununohistochemistry results showed that tumor sizes，differentiation levels and merger of tumor stages was related with positive expression HK-II（prespectively 0.001，0.000，0.019），lymphatic metastasis was not related with positive expression HK-II（P=0.815）. Conclusions:The cancer tissue had more positive HK-II expression than normal rectal mucosa tissue. Tumor sizes，clinical stages and differentiation levels were related with positive expression of HK-II，lymphatic metastasis was not related with positive expression of HK-II.

[Key words]carcinoma of the rectum；Hexokinase-II；reverse transcriptase polymerase chain reaction；Westernblot；Inununohistochemistry

[收稿日期]2014-10-22

* [作者簡介]龔海，男，漢族，江蘇江陰人，生于1973年9月，本科，副主任醫(yī)師。研究方向：結(jié)直腸肛門病外科。

[文章編號]1006-2440（2015）01-0020-04

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[中圖分類號]R735.3+7