土壤腐殖物質(zhì)的固體13C核磁共振技術(shù)研究

李今今，季宏兵，2*

(1.首都師范大學(xué)資源環(huán)境與旅游學(xué)院首都圈生態(tài)環(huán)境過(guò)程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048;2.中國(guó)科學(xué)院地球化學(xué)研

究所環(huán)境地球化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng) 550002)

土壤腐殖物質(zhì)是土壤有機(jī)質(zhì)的主要部分，是全球碳平衡過(guò)程中重要的碳庫(kù)，是植物所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)主要來(lái)源，對(duì)重金屬、有機(jī)污染物的遷移轉(zhuǎn)化起重要作用。腐殖物質(zhì)是由一系列具有不同分子量和大量含氧官能團(tuán)的大分子有機(jī)質(zhì)組成的非均質(zhì)深色混合物。利用腐殖物質(zhì)在酸堿溶液中的溶解性，對(duì)其進(jìn)行化學(xué)分組，可分為胡敏酸(HA)、富里酸(FA)和胡敏素(HM)。其中，胡敏酸溶于堿但不溶于酸，富里酸既溶于酸又溶于堿，胡敏素既不溶于酸又不溶于堿［1］。

近年來(lái)，對(duì)土壤腐殖物質(zhì)的研究主要集中在元素組成、官能團(tuán)含量、化學(xué)降解分析和同位素分異等方面。現(xiàn)階段，對(duì)腐殖物質(zhì)的官能團(tuán)研究以紅外光譜技術(shù)和核磁共振技術(shù)(NMR)為主。雖然紅外光譜的應(yīng)用廣泛，但它只對(duì)研究某些官能團(tuán)較有效。而核磁共振技術(shù)既可用于溶液態(tài)又可用于固態(tài)樣品，在測(cè)試過(guò)程中極大地減少對(duì)樣品結(jié)構(gòu)的破壞。特別是對(duì)于難溶的HM樣品，固體核磁共振技術(shù)是解決其研究的一大重要技術(shù)。

通過(guò)對(duì)相關(guān)文獻(xiàn)及書(shū)籍的整理和分析，筆者對(duì)現(xiàn)階段腐殖物質(zhì)的固體13C核磁共振技術(shù)的研究進(jìn)展進(jìn)行了闡述，以期通過(guò)對(duì)固體13C NMR的分析，為土壤腐殖物質(zhì)的形態(tài)結(jié)構(gòu)研究提供理論依據(jù)。

1 固態(tài)13C NMR

自1963年Schnitzer和Barton首次將核磁共振技術(shù)引入土壤有機(jī)物質(zhì)研究這一領(lǐng)域以來(lái)，該技術(shù)已在土壤、水體、泥炭、污泥和煤炭等原材料中的有機(jī)物質(zhì)的組成、結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)化等研究中獲得廣泛的應(yīng)用［2－4］。

近年來(lái)，固體和液體的1H NMR和13C NMR都已成功地應(yīng)用于腐殖物質(zhì)的研究，但由于C是有機(jī)化合物的骨架，因此與1H NMR相比，13C NMR能夠得到更多的結(jié)構(gòu)信息，對(duì)于研究腐殖物質(zhì)的結(jié)構(gòu)有著十分重要的意義。而對(duì)于難溶的HM樣品，固態(tài)13C NMR成為解決HM研究困難的一大重要技術(shù)。

由于13C的天然豐度很低，檢測(cè)較困難，直到20世紀(jì)80年代初，固體13C NMR才被用于土壤腐殖物質(zhì)的研究。此前，由于在空氣中用堿液提取腐殖物質(zhì)易使腐殖物質(zhì)各組分發(fā)生結(jié)構(gòu)上的變化，用化學(xué)方法提取腐殖物質(zhì)存在一定局限性，特別是對(duì)于不溶的胡敏素幾乎無(wú)法進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，因此采用固體13C NMR技術(shù)對(duì)土壤腐殖物質(zhì)進(jìn)行原位測(cè)試就顯得十分必要。1980年Schnitzer和Barton首次將固體13C NMR用于土壤有機(jī)質(zhì)的結(jié)構(gòu)研究，之后又應(yīng)用CP/MAS技術(shù)(交叉極化/魔角轉(zhuǎn)動(dòng)樣品)使得波譜質(zhì)量大為提高。

2 土壤腐殖物質(zhì)的13C-NMR化學(xué)位移

在核磁共振技術(shù)中，13C化學(xué)位移是重要的參數(shù)。它直接反映測(cè)試物質(zhì)中所含基團(tuán)的情況。在一般情況下，固體13C－NMR的化學(xué)位移范圍在0～250 ppm之間。除化學(xué)位移偶然重合的情況外，每個(gè)含碳基團(tuán)都有自己的特征峰。

不同結(jié)構(gòu)與化學(xué)環(huán)境的碳原子的化學(xué)位移基本表現(xiàn)為:飽和碳在較高場(chǎng)，炔碳次之，烯碳和芳碳在較低場(chǎng)，而羰基在更低場(chǎng)［5］。

在以往對(duì)腐殖物質(zhì)的固態(tài)13C核磁共振的研究中，對(duì)所含基團(tuán)所在信號(hào)區(qū)間的劃分略有不同，但對(duì)不同官能團(tuán)的歸屬基本一致，主要分為烷基碳、烷氧碳、芳香碳、羧基碳和羰基碳5個(gè)不同類(lèi)型碳區(qū)間。有些研究也將羧基碳與羰基碳合并為一類(lèi)。一般認(rèn)為，在0～100 ppm之間屬于脂肪碳，包含不直接連氧、氮、氟等雜原子的飽和碳(烷基碳)和炔碳(烷氧碳)。腐殖物質(zhì)中主要13C信號(hào)區(qū)間0～50、50～100、100～160、160～190、190～220 ppm的歸屬分別為烷基碳、烷氧碳、芳香碳、羧基碳、羧基碳。

固體13C NMR與液體13C NMR的化學(xué)位移各向異性相差小于3 ppm，因此可以相互借鑒套用。Schnitzer等［4］于1974年首次測(cè)定甲基化FA的13C NMR波譜，發(fā)現(xiàn)在53、166 ppm處有吸收信號(hào)分別歸屬于－OCH3和與－OCH3相連的芳香碳。隨后Vila等［6］發(fā)現(xiàn)，隨著樣品含N量的提高，50～70 ppm吸收增強(qiáng)，說(shuō)明HA、FA中有與N相連的碳(氨基酸)。根據(jù)以往對(duì)土壤HA、FA的研究，174 ppm為COO－、－COOH和－COONH2等的吸收;101 ppm為乙縮醛的信號(hào)。對(duì)于＜60 ppm的烷基碳可以分辨出末端CH3(14.2 ppm)、β－CH2(17.8 ppm)和γ－CH2(30 ppm)3種類(lèi)型的C。

綜合以往的研究結(jié)果，可以將土壤腐殖物質(zhì)的官能團(tuán)類(lèi)型與對(duì)應(yīng)的化學(xué)位移分為以下幾個(gè)部分，即化學(xué)位移13、20，31、40，56、76、93，101、113、126、140，153、167，178、187，202 ppm處的官能團(tuán)類(lèi)型分別為甲基碳、亞甲基碳、與氧相連的脂肪碳、與碳、氫相邊的芳香碳、與氧相連的芳香碳、羧基碳、羧基碳［7］。

在早期用化學(xué)方法對(duì)腐殖物質(zhì)的研究中，學(xué)者普遍認(rèn)為腐殖物質(zhì)是芳香本性的。而在固體13C NMR的研究中，幾乎所有研究都檢測(cè)到大量的脂族C信號(hào)，而芳香C信號(hào)較弱［8］。這表明土壤腐殖物質(zhì)中相當(dāng)一部分碳是以脂肪碳的形式存在。這與過(guò)去用化學(xué)方法得出的認(rèn)為腐殖物質(zhì)是芳香本性的推論不一致［2，8］?？芍枷憬Y(jié)構(gòu)和脂族結(jié)構(gòu)在土壤腐殖物質(zhì)中都是極為重要的組分，其中脂族C含量一般較芳香碳多。

由核磁共振波譜計(jì)算得到的腐殖化指數(shù)(HI)和芳香度(fa)，可以用來(lái)評(píng)價(jià)有機(jī)質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征［8－9］。Ussiri等［9－13］認(rèn)為，烷基C是難以降解的穩(wěn)定有機(jī)碳組分，而烷氧C則相對(duì)易分解，因此通常將HI作為土壤有機(jī)質(zhì)分解程度的評(píng)價(jià)指標(biāo)。腐殖化指數(shù)的計(jì)算公式如下:

腐殖化指數(shù)=烷基C(0～50)/烷氧C(50～100)

芳香度常被用來(lái)描述土壤有機(jī)質(zhì)的腐殖化程度，其計(jì)算公式如下:

芳香性=芳香C(100～160)/(芳香C+烷基C+烷氧C)

文啟孝等［2］列出了全土中不同形態(tài)碳的相對(duì)含量，發(fā)現(xiàn)全土有機(jī)質(zhì)中芳香碳的含量并不高，一般僅在20%左右，主要為鏈烷碳和碳水化合物(烷基碳和烷氧碳)。核磁共振技術(shù)測(cè)得的fa較低，一般比化學(xué)方法低20%以上。這可能是由堿性KMnO4氧化降解的原因造成的。

Lu等［14－15］將腐殖物質(zhì)在13C NMR譜圖上的特征峰定義了4個(gè)比值，分別具有特殊的意義:73 ppm/105 ppm表示纖維素和木質(zhì)素的相當(dāng)含量;73 ppm/130 ppm表示纖維素C和芳香C的分配特征;172 ppm/130 ppm表示腐殖物質(zhì)的氧化程度;56 ppm/130 ppm表示腐殖物質(zhì)子的礦化程度。

3 腐殖物質(zhì)中不同組分的13C-NMR

腐殖物質(zhì)中的含氧官能團(tuán)使其表現(xiàn)出離子交換性、配合性、氧化還原性及生理活性等［15］，同時(shí)含氧官能團(tuán)的含量反映腐殖物質(zhì)組分的氧化程度。腐殖物質(zhì)中HA、FA和HM在性質(zhì)上表現(xiàn)出一定的差異性。利用13CNMR對(duì)其組分和結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對(duì)，對(duì)于腐殖物質(zhì)各組分之間的形成與轉(zhuǎn)化有重要的研究意義。目前，在對(duì)于腐殖物質(zhì)不同組分的研究中，較多的集中在HA和FA上，而對(duì)于HM組分的研究較少，主要是由于其與無(wú)機(jī)礦物結(jié)合緊密，提取和純化較困難造成的。

竇森等［16－18］對(duì)土壤腐殖物質(zhì)不同組分進(jìn)行了固體13C NMR測(cè)定，并將胡敏素細(xì)分為鐵結(jié)合胡敏素(HMi)和黏粒結(jié)合胡敏素(HMc)。研究表明，4種組分出峰點(diǎn)一致，均在30.25、54.31、71.69、101.5、131.11、172.25 和 211.82 ppm 處表現(xiàn)出明顯特征峰，分別代表聚亞甲基、甲氧基、碳水化合物羥基、乙縮醛、取代芳香碳、羰基碳、酰胺態(tài)碳。HA與HMi相近，芳香性和氧化程度較高，結(jié)構(gòu)復(fù)雜;而HMc與FA相近，脂族性更強(qiáng)，結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單。

不同分解程度植物殘?bào)w的13C NMR的大量研究表明，隨著腐殖化程度的增加，腐解產(chǎn)物中烷基C和羰基C的含量增加，而烷氧C含量下降。至于芳碳，不同研究人員之間得到的結(jié)果差異較大。一部分學(xué)者認(rèn)為，隨著腐殖化程度增加，芳碳含量也增加。但大多數(shù)研究者觀察到，芳碳基本保持穩(wěn)定。以往大量研究是通過(guò)核磁共振技術(shù)測(cè)定不同土壤中腐殖物質(zhì)的不同組分，從而得到HA、FA和HM的結(jié)構(gòu)特征相似的結(jié)果。同時(shí)，他們認(rèn)為HA與HM的芳化度接近，而富里酸的芳化度低于胡敏酸。綜合大量研究材料，土壤胡敏酸、富里酸的芳化度大多分別在30%～45%和10%～20%之間［2］。一些研究者報(bào)道某些土壤HA的芳化度較高，但亦在55%以下。但是，對(duì)于HA和FA芳化度的比較，以往研究中也有FA的芳化度高于HA的情況出現(xiàn)。這可能與樣品制備、測(cè)定方法有關(guān)。所以，在FA和HA芳化度的比較中，目前尚沒(méi)有一致的結(jié)果。

在FA的13C NMR譜中，普遍在74和105 ppm表現(xiàn)出很強(qiáng)的信號(hào)，表明其中碳水化合物的含量很高。據(jù)此，可以認(rèn)為FA以多糖結(jié)構(gòu)為主。

在提取HA、FA后的剩余殘?jiān)谢曳趾枯^高，因此需用HCl－HF進(jìn)行處理后，得到較純凈的HM，方可進(jìn)行核磁共振測(cè)試。大部分報(bào)道認(rèn)為，HM與HA的譜圖較為相似，但也有部分報(bào)道認(rèn)為HM的譜圖更接近于FA。

4 小結(jié)

在現(xiàn)階段腐殖物質(zhì)的研究中，固態(tài)13C核磁共振技術(shù)起至關(guān)重要的作用，但對(duì)于腐殖物質(zhì)的形成、轉(zhuǎn)化機(jī)理至今仍未有一套詳實(shí)的解釋。由于腐殖物質(zhì)本身過(guò)于復(fù)雜，其研究理論存在較大分歧。基于不同的土壤形成假說(shuō)，出現(xiàn)了不同的觀點(diǎn)。由于腐殖物質(zhì)生成機(jī)制，各組分形成順序和轉(zhuǎn)化機(jī)理存在著多種可能性。在今后的研究中，仍需進(jìn)一步的探討和詳細(xì)的研究，從而對(duì)土壤發(fā)生有新的認(rèn)識(shí)。

由于土壤腐殖物質(zhì)的組成和結(jié)構(gòu)復(fù)雜且具有變異性，腐殖物質(zhì)與土壤無(wú)機(jī)組分結(jié)合的多樣性，通過(guò)腐殖物質(zhì)的分組及核磁共振技術(shù)僅能對(duì)腐殖物質(zhì)的整體結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，對(duì)腐殖物質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究仍處在探索階段，仍需進(jìn)一步的探討。

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