熱休克蛋白在魚類生殖中的作用研究進(jìn)展

李全杰，徐鋼春(.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，江蘇無(wú)錫2408:2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無(wú)錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇無(wú)錫2408)

魚類精子和卵子的質(zhì)量是影響魚類繁殖性能的關(guān)鍵因素之一。它們與胚胎的發(fā)育及仔、稚、幼魚的成活率和生長(zhǎng)都有直接關(guān)系，當(dāng)然，也與后期的養(yǎng)殖效率也密切相關(guān)［1］。同時(shí)，在魚類的繁殖過(guò)程中精子與卵子質(zhì)量受到越來(lái)越多的關(guān)注。許多研究初步證實(shí)了熱休克蛋白的存在會(huì)影響卵子精子的質(zhì)量。在魚類生殖細(xì)胞形成的過(guò)程中熱休克蛋白也會(huì)隨之而表達(dá)，但是由于熱休克蛋白的形成主要受到環(huán)境等外界因素的影響，因此到目前為止如何控制熱休克蛋白的表達(dá)還未找到更好的方法。為此，筆者從魚類生殖細(xì)胞的發(fā)生發(fā)育、熱休克蛋白的作用機(jī)理、影響因素及熱休克與生殖細(xì)胞的調(diào)節(jié)機(jī)制等方面對(duì)目前熱休克蛋白對(duì)魚類生殖的影響的相關(guān)研究現(xiàn)狀進(jìn)行了概述，并對(duì)存在的問題和需要進(jìn)一步重點(diǎn)研究的相關(guān)主題進(jìn)行了探討，以期加強(qiáng)熱休克蛋白對(duì)魚類生殖細(xì)胞的有利影響，進(jìn)一步優(yōu)化親魚的繁育，進(jìn)而促進(jìn)魚類繁殖的健康、可持續(xù)發(fā)展，提高我國(guó)水產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量。

1 魚類生殖細(xì)胞的發(fā)生發(fā)育

徐紅艷等［2］研究表明魚類和其他大多數(shù)動(dòng)物一樣，胚胎發(fā)育產(chǎn)生生殖細(xì)胞系或種質(zhì)系和體細(xì)胞系。這2個(gè)細(xì)胞系的分離發(fā)生在胚胎發(fā)育的早期，其標(biāo)志是形成生殖細(xì)胞系的祖細(xì)胞，即原始生殖細(xì)胞(Primordial germ cells，PGCs)。PGC形成后從再遷移到性原基，然后就發(fā)育成為性原細(xì)胞，即卵原細(xì)胞和精原細(xì)胞;隨后在經(jīng)過(guò)配子生成的一系列發(fā)育過(guò)程后，最終產(chǎn)生成熟的配子——卵子和精子。生殖細(xì)胞發(fā)育的每個(gè)步驟都可能影響生物個(gè)體的生殖能力或育性。在魚類及許多其他的生物中，生殖細(xì)胞在胚胎發(fā)育早期就已形成而且是由原原始生殖細(xì)胞(pPGC)發(fā)育而來(lái)的［2］。pPGC是生殖細(xì)胞的始祖，能進(jìn)行細(xì)胞不對(duì)稱分裂，產(chǎn)生2個(gè)“命運(yùn)各異”的子細(xì)胞:其中1個(gè)是體細(xì)胞，而另1個(gè)仍為pPGC。但當(dāng)2個(gè)子細(xì)胞“命運(yùn)相同”且都能發(fā)育成生殖細(xì)胞時(shí)，其母細(xì)胞就成為了原始生殖細(xì)胞(PGCs)。在生殖腺形成前，PGC便已在胚胎的特定位置特化形成，隨后PGC遷移穿過(guò)各種胚胎組織(細(xì)胞組織)到達(dá)正在形成中的原始生殖腺，即性原基。因此，PGC可相應(yīng)地分為遷移前、遷移中和遷移后3種。一旦到達(dá)性原基，PGC便結(jié)合并協(xié)同周圍體細(xì)胞形成一個(gè)完整的生殖腺［3］。在某些物種的初始生殖腺，如老鼠的初始生殖腺中PGC到達(dá)性原基后便會(huì)停止有絲分裂且進(jìn)入有絲分裂靜止期(G0)期。這些G0期生殖細(xì)胞通常也被稱為生殖母細(xì)胞或性原細(xì)胞，在魚類性成熟期間生殖母細(xì)胞發(fā)育變成生殖干細(xì)胞(卵原細(xì)胞或精原細(xì)胞)，在性成熟期間最終分化形成成熟的配子，即在雄性個(gè)體中形成精子，在雌性中形成卵子。在研究初期，有人用顯微鏡觀察形態(tài)學(xué)的方法分析了PGC的特有細(xì)胞結(jié)構(gòu)——生殖質(zhì)顆粒(Nuage)，并對(duì)多種魚的生殖細(xì)胞進(jìn)行了初步考察。同時(shí)，Hamaguchi在細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)水平上對(duì)生殖質(zhì)顆粒在魚類生殖細(xì)胞發(fā)育期間的形成進(jìn)行了觀察研究［4］。在10年前這些開創(chuàng)性研究就得以被歸納與總結(jié)。隨后，其他一些魚類生殖細(xì)胞特異基因也陸續(xù)被分離鑒定。此外，各種細(xì)胞和分子實(shí)驗(yàn)技術(shù)也在魚類研究應(yīng)運(yùn)而生并得以發(fā)展，使得在過(guò)去10年內(nèi)科學(xué)界對(duì)生殖細(xì)胞的研究無(wú)論是在理論知識(shí)的積累方面還是實(shí)踐應(yīng)用方面都取得了很大進(jìn)步［5］。

2 熱休克蛋白的作用機(jī)理

熱休克蛋白(Heat shock protein，HSPs)是一類結(jié)構(gòu)上高度保守的蛋白質(zhì)，廣泛存在于從原核類的細(xì)菌到哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中［6］。當(dāng)細(xì)胞受環(huán)境刺激(溫度的升高、缺氧、病毒感染、營(yíng)養(yǎng)缺乏、暴露于化學(xué)物質(zhì)下)時(shí)，即可產(chǎn)生此類蛋白。因此，熱休克蛋白又稱為應(yīng)激蛋白。各種生物的熱休克蛋白在進(jìn)化上均具有高度的保守性，甚至其編碼基因的進(jìn)化也是如此。人類與細(xì)菌類的熱休克蛋白具有50%以上的同源性［7］。對(duì)應(yīng)激后熱休克蛋白的表達(dá)方式和種類進(jìn)行研究，有人用哺乳動(dòng)物5種不同種系細(xì)胞熱休克后熱休克蛋白的表達(dá)進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們的表達(dá)方式和種類極其相似。

目前，對(duì)于HSP尚無(wú)明確的分類標(biāo)準(zhǔn)。一般根據(jù)應(yīng)激蛋白的調(diào)節(jié)模式不同，通常分為2大類:HSP和調(diào)節(jié)蛋白(CRPs)。另外，也有研究表明，可以根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小及同源程度，將其分為4個(gè)家:HSP90家族(分子量83～90 kD)、HSP70家族(分子量66～78 kD)、HSP60家族和小 HSP家族以及分子量分別為110～111 kD和相對(duì)分子質(zhì)量8 000，且性質(zhì)不同于上述家族的大分子HSP和泛素蛋白［8］。

3類蛋白質(zhì)HSP90、HSP60和HSP70都有各自的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能，但是現(xiàn)在對(duì)HSP的研究中對(duì)HSP70家族的結(jié)構(gòu)、功能以及表達(dá)調(diào)控機(jī)理的研究較為深入，在正常情況下HSP70位于細(xì)胞漿內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞受到熱休克的刺激時(shí)細(xì)胞內(nèi)只有少量存在，細(xì)胞處于恢復(fù)階段時(shí)細(xì)胞核內(nèi)的HSP70就會(huì)消失，但是細(xì)胞漿內(nèi)仍有低水平的HSP70表達(dá)。HSP家族中，HSP70家族是一類最保守也是最重要的，包括分子量為68、72、73、75、78 kD的多種蛋白，用雙向電泳和質(zhì)譜分析對(duì)其進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其具有相同的酸性等電點(diǎn)和相近的胰蛋白酶肽譜［9］。HSP70 基因分布廣泛，位于第 1、5、6、14 及 21 號(hào)染色體上，其表達(dá)和分泌的蛋白具有ATP酶區(qū)和底物識(shí)別區(qū)2個(gè)結(jié)構(gòu)域［10］。這種結(jié)構(gòu)特點(diǎn)不但能使HSP70可利用ATP水解產(chǎn)生的能量，還能與其他功能蛋白進(jìn)行結(jié)合、分離，最終能夠完成蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)、合成以及變性蛋白的清除。

HSP對(duì)溫度有一定的敏感性，如當(dāng)環(huán)境溫度高于細(xì)胞生長(zhǎng)溫度2～8℃時(shí)，HSP會(huì)在細(xì)胞內(nèi)迅速積累。在此溫度范圍內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)的HSP基因轉(zhuǎn)錄迅速增加，其他基因的轉(zhuǎn)錄降低，接著HSP mRNA選擇性轉(zhuǎn)錄，HSP也就會(huì)隨之增加［11］。HSP基因在應(yīng)激時(shí)細(xì)胞內(nèi)的激活機(jī)制在進(jìn)化上是非常保守的。有人認(rèn)為熱休克因子與熱休克原件的結(jié)合及HSP基因的轉(zhuǎn)錄是真核細(xì)胞HSP基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)過(guò)程。

3 熱休克蛋白及其在生殖中的作用

3.1 熱休克蛋白在生殖組織中的表達(dá) 人類與生殖相關(guān)的許多組織中均有HSPs的存在。在健康女性的周期性變化的子宮內(nèi)膜中就有HSPs的表達(dá)。在孕早期的人類蛻膜中就可以檢測(cè)到HSPs。無(wú)論是正常的還是異常的懷孕婦女的輸卵管中都可檢測(cè)到不同的HSPs。排卵后，子宮內(nèi)膜中表達(dá)大量的HSP27、HSP60和HSC70。研究表明，雌激素和孕酮的受體都與HSP有關(guān)，這些HSPs在子宮內(nèi)膜中表達(dá)暗示它們參與對(duì)激素功能的調(diào)節(jié)［12］。

3.2 熱休克蛋白的精子發(fā)生 精子發(fā)生過(guò)程中有3個(gè)不同并且重要的階段:精原細(xì)胞的有絲分裂、精母細(xì)胞的減數(shù)分裂和圓形精子的發(fā)育及精子成熟期［4］。大量的轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞分化事件在這些不同的發(fā)育階段都會(huì)發(fā)生，因此伴隨著不同的HSPs的表達(dá)。在不育的雄性動(dòng)物中，由HSP60的低水平表達(dá)導(dǎo)致了保護(hù)水平的降低。研究發(fā)現(xiàn)，減數(shù)分裂的失敗與精原細(xì)胞的凋亡的增加有關(guān)，在小鼠精子形成過(guò)程中需要HSP70－2基因的參與才能完成減數(shù)分裂。HSP70可能作為精子表面抗原，與支原體感染性不育癥中對(duì)硫糖脂基團(tuán)的識(shí)別，主要是HSP70和導(dǎo)致不育癥的多種支原體都有與硫糖脂基團(tuán)結(jié)合專一性，而硫糖脂基團(tuán)可以有效阻止精卵的結(jié)合［11］。但是，也有人認(rèn)為在不育的動(dòng)物中HSP70表達(dá)的增加可能是在精子凋亡過(guò)程中起到一種保護(hù)作用。HSP70水平還可能與精液質(zhì)量相關(guān)，如果在精液中加入HSP70抗體，卵母細(xì)胞的受精率則呈濃度依賴性降低［13］。

4 熱休克蛋白對(duì)魚類生殖細(xì)胞的作用機(jī)理

魚類在生殖的過(guò)程中，首先要產(chǎn)生精子和卵子才能完成受精。研究發(fā)現(xiàn)，魚類的生殖細(xì)胞從原始生殖細(xì)胞的形成，然后再轉(zhuǎn)變成卵原細(xì)胞和精原細(xì)胞，最后在形成成熟的配子過(guò)程中細(xì)胞都進(jìn)行了大量的轉(zhuǎn)錄和分化，同時(shí)也伴隨著不同的HSPs的表達(dá)［8］。由于它的存在參與了蛋白的折疊、裝配及運(yùn)輸?shù)然顒?dòng)，對(duì)調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、存活及分化起著重要作用，因此影響了魚類精子和卵子的形成。有些雌性魚類不育主要是因?yàn)镠SP60的低水平表達(dá)導(dǎo)致了保護(hù)水平的較低，使卵細(xì)胞無(wú)法形成而影響受精過(guò)程。在雄魚精子形成的過(guò)程中，需要HSPs家族中的一些基因的參與才能完成減數(shù)分裂，如果減數(shù)分裂失敗就會(huì)導(dǎo)致精子的凋亡。

4.1 熱休克蛋白在雄性魚生殖中的作用 有學(xué)者認(rèn)為，在雄性魚類精子形成的過(guò)程中熱休克蛋白中HSP70對(duì)精子的形成有很大的影響作用。但也有人認(rèn)為，在不育的雄魚中HSP70表達(dá)的增加可能是在精子凋亡過(guò)程中起到一種保護(hù)作用［12］。另外，有研究表明有機(jī)磷化合物敵敵畏等可使雄性果蠅的HSP70僅限在睪丸中表達(dá)，而那些附屬腺不表達(dá)HSP70的雄性果蠅，其睪丸則損傷明顯。HSP70水平還可能與精液質(zhì)量相關(guān)，在炎熱的季節(jié)魚精子HSP70表達(dá)較低，精液質(zhì)量也明顯下降［14］。在精液中如果加入HSP70抗體，卵母細(xì)胞的受精率則呈濃度依賴性降低［15］。HSP70抗體可以明顯降低精子與牛卵細(xì)胞透明帶結(jié)合的能力，也無(wú)法完成卵細(xì)胞的第2次減數(shù)分裂及原核的形成［16］。

4.2 熱休克蛋白在雌性魚生殖中的作用 無(wú)管是正常的還是異常的排卵，雌性魚的輸卵管中亦可檢測(cè)到不同的HSPs。排卵后，排卵腔中表達(dá)大量的HSP27、HSP60和HSC70。研究表明，雌激素受體與HSP有密切關(guān)系，這些HSPs在子排卵腔中表達(dá)暗示它們參與了對(duì)激素功能的調(diào)節(jié)［17］。

HSPs可以保護(hù)細(xì)胞免受由細(xì)胞因子引起的細(xì)胞毒性損傷［18］。在子生殖腔中，白細(xì)胞可以產(chǎn)生高水平的氧自由基(ROS)和細(xì)胞因子，這2種產(chǎn)物可以調(diào)節(jié)HSPs的表達(dá)［19］。因?yàn)榘准?xì)胞和細(xì)胞因子［如腫瘤壞死因子(TNF－A)］在分泌期急劇聚集，此時(shí)隨之出現(xiàn)的HSPs可能是保護(hù)子排卵膜細(xì)胞免于白細(xì)胞積聚和細(xì)胞因子釋放所造成的細(xì)胞損害［18］。當(dāng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染HSP70后，可以保護(hù)細(xì)胞免于TNF－A引起的毒性損害［17］。此外，HSP70可能可以防止細(xì)胞DNA鏈的斷裂，保護(hù)線粒體的結(jié)構(gòu)和功能，并由此抑制細(xì)胞的凋亡。

5 熱休克蛋白在魚類生殖中存在的問題

綜上所述，作為精子、卵子發(fā)生和成熟過(guò)程中關(guān)鍵蛋白伴侶分子的HSP，在魚類生殖的過(guò)程中扮演者重要的角色。①參與精母細(xì)胞和卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂和轉(zhuǎn)錄過(guò)程;②促進(jìn)生殖細(xì)胞的分化;③改善生殖細(xì)胞的質(zhì)量。根據(jù)HSPs表達(dá)方式的不同可以分為2種類型:一類是在應(yīng)激條件下表達(dá)的，另一類是在生理?xiàng)l件下表達(dá)的［8］。因此，雖然HSPs在生殖過(guò)程中有很重要的作用，但也存在很大的弊端。魚類主要營(yíng)水生生活，外部環(huán)境對(duì)魚的刺激條件很多，含有很多的未知因素，而且不易控制，刺激強(qiáng)度過(guò)大或過(guò)小都對(duì)HSPs的表達(dá)和積累有很大的影響，從而可能會(huì)導(dǎo)致魚的生殖出現(xiàn)問題。

6 展望

在魚類繁殖的過(guò)程中，改善繁殖的技術(shù)有很多，而通過(guò)控制熱休克蛋白的表達(dá)來(lái)提高魚類生殖細(xì)胞也是一種極其有效的方法。雖然目前人類對(duì)這方面的研究還有許多問題尚未解決，但是隨著研究的逐步深入，魚類生殖細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)育和成熟與熱休克蛋白在不同階段的表達(dá)及調(diào)節(jié)機(jī)制將愈來(lái)愈清晰。大量研究表明，母源性基因產(chǎn)物(母源mRNA和蛋白)對(duì)魚類生殖細(xì)胞的發(fā)生和早期胚胎的發(fā)育的調(diào)控起主導(dǎo)作用，而基因產(chǎn)物的蛋白質(zhì)部分就是熱休克蛋白，環(huán)境變化等非基因因素的調(diào)控等因素也對(duì)其表達(dá)有所影響，但如何控制這些因素仍不清楚。因此，在未來(lái)研究魚類繁殖的過(guò)程中如何通過(guò)外界環(huán)境來(lái)控制熱休克蛋白的表達(dá)改善魚類生殖細(xì)胞和提高魚類產(chǎn)量是值得關(guān)注的問題之一。

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