Wilson病非銅藍蛋白結(jié)合銅研究進展

?

·綜述講座·

Wilson病非銅藍蛋白結(jié)合銅研究進展

汪世靖程楠韓詠竹

[關(guān)鍵詞]Wilosn?。环倾~藍蛋白結(jié)合銅；作用機制；研究進展

Wilson’s病(Wilson disease,WD)是一種遺傳因素導致的銅代謝障礙疾病，以肝臟和腦損傷為主要臨床表現(xiàn)[1]；WD最早在1912年由Samuel Kinnier Wilson首次詳細報道[2]，當時被認為是一種罕見的家族性疾病以進展性的豆狀核變性和肝硬化為主要特征，但對其發(fā)病原因尚不清楚。1928年Hall首先提出基因致病的可能，1993年WD的致病基因ATP7B基因被定位在13號常染色體[3, 4]，由于該基因編碼的ATP7B蛋白的減少，導致WD患者體內(nèi)銅的排出障礙而在體內(nèi)蓄積，最終引起肝臟損傷和以錐體外系為主的臨床癥狀。因此，驅(qū)銅治療自Walshe[5]首次使用青霉胺開始就一直作為WD的主要治療手段。而體內(nèi)大多數(shù)銅是與銅藍蛋白穩(wěn)定結(jié)合，不能被驅(qū)銅藥物絡(luò)合而排出體外，對WD的病理損傷相對較?。欢倾~藍蛋白結(jié)合銅則對WD的發(fā)病、治療具有重要意義?，F(xiàn)將國內(nèi)外相關(guān)研究報道綜述如下。

1非銅藍蛋白結(jié)合銅

銅藍蛋白是一種α-1-酸性糖蛋白，90%的WD患者銅藍蛋白水平低于正常人；一般來說，銅作為體內(nèi)重要的微量元素，主要以兩種形式存在，結(jié)合銅和離子銅，結(jié)合銅又包括與銅藍蛋白穩(wěn)定和非銅藍蛋白結(jié)合的銅；結(jié)合銅和游離銅之間可以迅速交換。這種氧化還原屬性必須在其酶活性銅的作用下完成。然而，未結(jié)合或游離銅可以快速生成活性氧和對細胞產(chǎn)生有害影響[6]。Walshe等[7]研究發(fā)現(xiàn)正常人血清中游離銅總量約占10%，而WD患者由于體內(nèi)銅藍蛋白含量的下降則導致了游離銅總量的升高。但隨后其發(fā)現(xiàn)游離銅的概念不能精確的說明這種非結(jié)合狀態(tài)下的銅，因此提出非銅藍蛋白結(jié)合銅的概念。為說明血清游離銅和WD患者之間的關(guān)系，Walshe[8]對320位WD患者的血清游離銅和尿銅之間的進行了相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，WD患者血清游離銅和尿銅之間的比率從治療前的7 ∶1下降致治療后的5 ∶1，且結(jié)果相對分散并無直接的線性關(guān)系。因此，Walshe提出將游離銅的說法更改為更復雜的非銅藍蛋白結(jié)合銅的概念，并且說明了非銅藍蛋白結(jié)合銅中大多數(shù)是與白蛋白結(jié)合，在腎臟出現(xiàn)損傷時，這部分銅可通過腎臟排出體外。

2非銅藍蛋白結(jié)合銅的分離和檢測方法

由于WD患者非銅藍蛋白結(jié)合銅含量較低，如何精確的分離和檢測非銅藍蛋白結(jié)合銅，尚無統(tǒng)一的標準。Bohrer等[9]比較了超濾法和固相萃取法分離血清游離銅和蛋白結(jié)合銅在WD診斷中的應用，應用石墨爐法對兩組樣品進行檢測，結(jié)果表明固相萃取法相比與超濾法具有需要的血清標本量少、分離時間短、精確度和準確度更高的優(yōu)點。張源等[10]應用石墨爐法測定乙醇-EDTA法分離的血清中不同形態(tài)的銅和鋅，其中銅檢測限為1.2 μg/L，回收率為92.3%～104.0%；正常人血清樣品非銅藍蛋白結(jié)合銅約占總銅含量的8%，WD患者的血清非銅藍蛋白結(jié)合銅約占總銅含量的20%；因此提出該方法可作為檢測血清中蛋白質(zhì)緊密結(jié)合和疏松結(jié)合的銅含量。

作者單位： 230038合肥安徽中醫(yī)藥大學(汪世靖)

230061合肥安徽中醫(yī)藥大學神經(jīng)病學研究所附屬醫(yī)院(汪世靖，程楠，韓詠竹)

雖然上述兩種方法均可很好的分離WD患者血清中非銅藍蛋白結(jié)合銅和銅藍蛋白結(jié)合銅，但所應用的均為未進行驅(qū)銅治療前的WD患者血清標本，而很多WD患者在經(jīng)驅(qū)銅治療后體內(nèi)總銅含量均會降至較低水平，此時上述石墨爐法檢測血清非銅藍蛋白結(jié)合銅的檢測精密度如何尚不可知。因此，仍需探討檢測精密度更高的檢測法對驅(qū)銅治療后WD患者血清非銅藍蛋白結(jié)合銅的檢測限。

3非銅藍蛋白結(jié)合銅在WD發(fā)病機制中的作用

由于非銅藍蛋白結(jié)合銅約占體內(nèi)銅總量的10%，且這部分銅是處于不穩(wěn)定結(jié)合狀態(tài)，能夠被銅絡(luò)合劑絡(luò)合而排出體外。因此，非銅藍蛋白結(jié)合銅在WD發(fā)病機制中是否占據(jù)一定地位成為研究探討的熱點。

銅在WD發(fā)病的過程中占據(jù)重要地位，WD主要的發(fā)病機制是由于遺傳因素導致的銅代謝障礙，使得銅在體內(nèi)大量蓄積而對機體產(chǎn)生損傷。關(guān)于WD病因?qū)W的研究認為[11]，基因遺傳因素是導致WD患者體內(nèi)銅過量蓄積的主要因素。Purchase[12]認為WD患者體內(nèi)銅過量的原因是膽道排銅功能損傷引起的，銅作為重要的微量元素參與了紅細胞生成、合成線粒體氧化呼吸作用重要酶的輔助因子以及神經(jīng)遞質(zhì)的合成等等，不僅銅缺乏將導致生理活動中很多重要的酶缺乏，而且過量的銅則會對細胞產(chǎn)生損害。近年來相關(guān)研究[13]表明神經(jīng)細胞通過包膜上的銅轉(zhuǎn)運體Ctr1蛋白將銅轉(zhuǎn)運進入胞內(nèi)，其中絕大部分與還原性谷胱甘肽、金屬巰蛋白等結(jié)合；而在胞內(nèi)的銅則由Cox17蛋白轉(zhuǎn)運至線粒體，參與細胞色素C氧化酶的合成；過量的銅則與Atox1蛋白結(jié)合被轉(zhuǎn)運至高爾基體與ATP7B蛋白結(jié)合排出細胞。但WD患者由于ATP7B蛋白的缺乏，致使過量的銅在細胞內(nèi)大量蓄積，引起銅相關(guān)蛋白的功能異常，線粒體酶Cytox功能受損，誘發(fā)凋亡信號的釋放，觸發(fā)Caspase級聯(lián)反應，引起細胞凋亡[14]。現(xiàn)有的研究結(jié)果表明高銅誘導的神經(jīng)元發(fā)生氧化應激-凋亡級聯(lián)反應有關(guān)的信號轉(zhuǎn)導通路主要有：銅導致細胞內(nèi)ROS的升高，線粒體功能失調(diào)，激活c-jun氨基末端激酶(c-jun N-terminal kinaes,JNK)[15]和Caspase-3信號傳導通路[16]；蛋白激酶p38通路的激活和細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶通路的抑制，非JNK通路的激活[17]；Brewer[18]發(fā)現(xiàn)銅誘導激活的酸性鞘磷脂水解酶分泌和神經(jīng)酰胺釋放；后者可以激活p38/SAPK、JNK等細胞信號通路；促進線粒體釋放細胞色素C，與凋亡蛋白酶活化因子-1結(jié)合，導致Capase-9活化而激活caspase-3、6、7，引起神經(jīng)元凋亡[19]。而銅與銅藍蛋白結(jié)合較為緊密，不易分離，因此，有研究提出，非銅藍蛋白結(jié)合銅可能與WD的發(fā)病存在一定的聯(lián)系[20]，且WD患者體內(nèi)非銅藍蛋白結(jié)合銅的含量較正常人水平高，而非銅藍蛋白結(jié)合銅與白蛋白、金屬巰蛋白等結(jié)合較為疏松，容易發(fā)生解離通過線粒體氧化應激作用產(chǎn)生細胞損傷，但目前尚無實驗依據(jù)證明。因此，非銅藍蛋白結(jié)合銅是否通過上述途徑對神經(jīng)元產(chǎn)生損傷需進一步實驗證明。

4非銅藍蛋白結(jié)合銅與WD驅(qū)銅治療后神經(jīng)系統(tǒng)癥狀加重

周香雪等[21]使用青霉胺治療的40例WD患者，15例(46.9%)患者出現(xiàn)神經(jīng)癥狀加重，且癥狀加重的患者腦脊液銅含量較治療前升高，血清銅較治療前降低，而尿銅排出量則顯著低于治療前。因此，青霉胺治療引起WD患者神經(jīng)癥狀加重的原因可能是腦銅的增加引起的神經(jīng)系統(tǒng)損傷有關(guān)；WD患者銅藍蛋白水平較正常人低，患者腦銅總量增加時非銅藍蛋白增加則更為明顯；因而新近出現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)損傷則可能是由非銅藍蛋白結(jié)合銅通過氧化應激損傷產(chǎn)生。Chen等[22]對WD病模型TX小鼠采用青霉胺灌胃的方式，發(fā)現(xiàn)TX小鼠血清、腦游離銅在青霉胺治療后的第3天開始升高，到第14天降低至治療前水平，血清和腦中蛋白結(jié)合銅呈逐漸下降；氧化物前體丙二醛雖然在青霉胺治療后第3天開始升高，但與正常對照組并無區(qū)別，而還原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽的比率在治療后的第3天開始下降，而正常對照組小鼠未出現(xiàn)任何變化。該項研究表明腦中游離銅的升高可能來源于腦實質(zhì)而不是血清，且氧化力的升高很可能與新近神經(jīng)元損傷有直接關(guān)系。

現(xiàn)階段對WD驅(qū)銅治療過程中出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀加重的機制的假設(shè)主要包括驅(qū)銅治療引起的原先組織中沉積的銅重新分布，新近產(chǎn)生的神經(jīng)元損傷，繼而引起相應的臨床癥狀等；周香雪等[23]認為血清游離銅的升高可能并不直接與神經(jīng)癥狀加重相關(guān)，但快速控制血清游離銅的變化，是WD治療中阻止神經(jīng)癥狀惡化的關(guān)鍵。如果在驅(qū)銅治療期間有可以提供患者是否出現(xiàn)癥狀加重的血清學非銅藍蛋白結(jié)合銅指標，這將有利于臨床醫(yī)師直觀的判斷患者是否會出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀加重，而盡早的采取干預措施，使得患者可以獲得更好的臨床療效。因此，探索在應用銅絡(luò)合劑治療的WD患者在最初的治療時間段內(nèi)出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀加重與血清非銅藍蛋白結(jié)合銅含量的相關(guān)性，將對于臨床治療具有很好的指導意義。

5展望

目前，血清非銅藍蛋白結(jié)合銅在臨床中尚未能成為常規(guī)檢測指標，原因包括檢測儀器的精密性以及檢測費用的昂貴等等而常規(guī)使用的原子火焰吸收法由于檢測靈敏度較差，無法精確的檢測出非銅藍蛋白結(jié)合銅的含量。且血清非銅藍蛋白結(jié)合銅對WD患者驅(qū)銅治療的預后評價具有一定的指導意義，而與患者驅(qū)銅治療期間的臨床表現(xiàn)變化的相關(guān)性尚未明確。因此，血清非銅藍蛋白結(jié)合銅對WD治療的臨床意義尚需要臨床大樣本試驗證明，同時尚需進行動物實驗探索血清非銅藍蛋白結(jié)合銅參與神經(jīng)元損傷相關(guān)作用途徑及作用機制。對此，有關(guān)血清非銅藍蛋白結(jié)合銅的研究仍將致力于對選擇更合適、合理、方便的檢測方法的探索以及作用途徑和作用機制驗證；并通過明確其對臨床治療的指導價值，來豐富臨床醫(yī)師的判斷標準。

參考文獻

[1]Loudianos G,Lepori MB,Mameli E,et al.Wilson’s disease[J].Prilozi,2014,35(1):93-98.

[2]Trocello JM,Broussolle E,Girardot-Tinant N,et al.Wilson’s disease,100 years later[J].Rev Neurol,2013,169(12):936-943.

[3]Tanzi RE,Petrukhin K,Chernov I.The Wilson disease geneis a copper transporting ATPase with homology to the Menkes disease gene[J].Nat Genet,1993,5(4):344-350.

[4]Bull PC,Thomas GR,Rommens JM,et al.The Wilson disease gene is a putative copper transporting P-type ATPase similar to the Menkes gene[J].Nat Genet,1993,5(4):327-337.

[5]Walshe JM.Penicillamine,a new oral therapy for Wilson’s disease[J].Am JMed,1956,21(4):487-495.

[6]Rosencrantz R,Schilsky M.Wilson disease: pathogenesis and clinical considerations in diagnosis and treatment[J].Semin liver Dis,2011,31(3):245-259.

[7]Walshe JM.Wilson's disease: the importance of measuring serum ceruloplasmin non-immunologically[J].Ann Clin Biochem,2003,40(2):115-121.

[8]Walshe JM.Serum 'free' copper in Wilson disease[J].QJM,2012,105(5):419-423.

[9]Bohrer D,Do Nascimento PC,Ramirez AG, et al.Comparison of ultrafiltration and solid phase extraction for the separation of free and protein-bound serum copper for the Wilson's disease diagnosis[J].Clin Chim Acta,2004,345(1-2):113-121.

[10] 張源,林哲絢,李慧,等.GFAAS測定乙醇-EDTA法分離血清中不同形態(tài)的銅和鋅[J].光譜學與光譜分析,2010,30(3):816-819.

[11] Dalvi A,Padmanaban M.Wilson's disease: etiology, diagnosis, and treatment[J].Dis Mon,2014,60(9):450-459.

[12] Purchase R.The link between copper and Wilson’s disea-se[J].Science Progress,2013,96(3):213-223.

[13] Palumaa P,Copper chaperones.The concept of conformational control in the metabolism of copper[J].FEBS Lett,2013,587(13):1902-1910.

[14] Lutsenko S.Human copper homeostasis: a network of interconnected pathways[J].Curr Opin Chem Biol,2010,14(2):211-217.

[15] 丁超,王訓,程楠.c-jun氨基末端激酶信號轉(zhuǎn)導在神經(jīng)元損傷中作用[J].安徽醫(yī)學,2014,35(3):397-399.

[16] Chen X,Lan X,Mo S,et al.p38 and ERK, but not JNK, are involved in copper-induced apoptosis in cultured cerebellar granule neurons[J].Biochem Bioph Res Co,2009,379(4):944-948.

[17] Chen SH,Lin JK,Liu SH,et al.Apoptosis of cultured astrocytes induced by the copper and neocuproine complex through oxidative stress and JNK activation[J].Toxicol Sci,2008,102(1):138-149.

[18] Brewer GJ.A brand new mechanism for copper toxicity[J].J Hepatol,2007,47(4):621-622.

[19] Arboleda G,Morales LC,Benítez B,et al.Regulation of ceramide-induced neuronal death:cell metabolism meets neurodegeneration[J].Brain Res Rev,2009,59(2):333-346.

[20] Bruha R,Marecek Z,Pospisilova L,et al.Long-term follow-up of Wilson disease: natural history, treatment, mutations analysis and phenotypic correlation[J].Liver Lnt,2011,31(1):83-91.

[21] 周香雪,李洵樺,梁秀齡,等.青霉胺治療引起肝豆狀核變性神經(jīng)癥狀加重[J].中華神經(jīng)科雜志,2008,41(10):674-677.

[22] Chen DB,Feng L,Lin XP,et al.Penicillamine increases free copper and enhances oxidative stress in the brain of toxic milk mice[J].PloS One,2012,7(5): e37709.

[23] 周香雪,李洵樺,黃海成,等.血清銅及血清游離銅對肝豆狀核變性患者及攜帶者的診斷及治療監(jiān)測意義[J].中華醫(yī)學雜志,2011,91(39):2757-2760.

(2015-05-07收稿2015-08-01 修回)

通信作者：韓詠竹，hyz89722@sina.com

基金項目：國家自然科學基金項目(項目編號：81473535)

doi:10.3969/j.issn.1000-0399.2015.11.033