托盤根生物堿對α-葡萄糖苷酶的抑制作用研究

·論著·

托盤根生物堿對α-葡萄糖苷酶的抑制作用研究

,吳磊,趙偉勛,楊明慧,陳爽*(

吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林 吉林132013)

摘要：目的研究托盤根水煎液生物堿降血糖的作用。方法通過超聲波輔助法提取，用不同濃度乙醇精制得托盤根中總生物堿；通過建立體外α-葡萄糖苷酶抑制模型，用麥芽糖為底物，以阿卡波糖為陽性對照，測定托盤根中不同濃度生物堿對α-葡萄糖苷酶的抑制作用。結(jié)果精制得總生物堿41.1 mg，得率為0.201%。75 g/L總生物堿抑制率是13.33%，50 g/L總生物堿抑制率是48.33%。結(jié)論托盤根總生物堿對α-葡萄糖苷酶有一定的抑制作用,具有一定的降血糖活性。

關(guān)鍵詞：托盤根;生物堿;降血糖

文章編號：1673-2995(2015)06-0428-03

中圖分類號：R285.5

基金項目：大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目(201405),吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究項目(20143620),吉林省科技發(fā)展計劃自然科學(xué)基金項目(20140101142JC).

作者簡介：官慧敏(1994-)，女(回族)，在讀本科.

收稿日期：(2015-05-18)

Inhibition of Rubus crataegifolius Rge alkaloid on α-glycosidse enzymes

GUAN Huimin,JIN Minqi,WU Lei,ZHAO Weixun,YANG Minghui,CHEN Shuang*(Jilin Medical College,Jilin City,Jilin Province,132013,China)

Abstract:ObjectiveTo study the hypoglycemic action of Rubus crataegifolius Rge alkaloid in the water decotion. Methods Total Rubus crataegifolius Rge alkaloid was extracted and refined by different concentrations of ethanol with ultrasonic assistance.The inhibition alkaloids in different concentrations in the Rubus crataegifolius Rge onα-glycosidase enzyme were measured through the establishment of α-glycosidase enzyme inhibition model in vitro with maltose as the substrate and acarbose as positive control. Results41.1 mg of total alkaloid was refined at a rate of 0.201%.The inhibition rate of 75 g/L total alkaloid is 13.33%,while 50 g/L total alkaloid inhibition rate was 48.33%. ConclusionRubus crataegifolius Rge total alkaloid has certain inhibitory effect on α-glycosidase enzymes,Which mean it have a certain hypoglycemic activity.

Key words：Rubus crataegifolius Rge;alkaloids;hypoglycemic

通訊作者：陳爽(1982-)，女(回族)，講師，碩士.

托盤(Rubus crataegifolius Rge)為薔薇科懸鉤子屬植物，果和根入藥。托盤根味苦、澀，性寒，有清熱涼血、散結(jié)止痛、利尿消腫的功效,具有抗衰老、抗腫瘤、降壓、降血糖、對組織脂質(zhì)過氧化作用等[1]。研究發(fā)現(xiàn)托盤根水煎物具有明顯降血糖作用，但具體起效成分未見報道，本實驗擬從生物堿方面進(jìn)行研究。

在天然藥物中，少數(shù)弱堿性生物堿如酞胺類生物堿以游離的形式存在，多數(shù)中強堿性生物堿以有機酸鹽形式存在，大多數(shù)游離生物堿不溶或難溶于水，能溶于氯仿、乙醚、醇和丙酮等有機溶劑，以水為溶劑，可將其提取出來。也可選0.1%～2%的硫酸、鹽酸或乙酸等為溶劑，使原料中溶解度較小的生物堿有機酸鹽轉(zhuǎn)變?yōu)槿芙舛容^大的無機酸鹽，從而提高溶出率。以酸水提取多采用常溫下浸漬法、滲法；以水提取還可以采用煎煮法。以水或者酸水提取生物堿，其提取液體積較大，濃縮困難，水溶性雜質(zhì)較多。隨著新的提取技術(shù)的發(fā)展，溶劑法提取生物堿還可以采用超聲波提取、微波輔助提取、CO2超臨界流體萃取以及生物酶解輔助提取等技術(shù)。而超聲波輔助提取技術(shù)因其具有顯著的高效性而越來越受到天然產(chǎn)物化學(xué)工作者的重視和青[2]。故在此采用超聲波輔助提取生物堿。

1　材料與方法

1.1　主要試劑及儀器

托盤根購于藥材市場，由吉林醫(yī)藥學(xué)院雷鈞濤教授鑒定為薔薇科懸鉤子屬植物托盤(Rubus crataegifolius Rge)的根，阿卡波糖(德國拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號：117816)；葡萄糖試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司，批號：102151：201002)；麥芽糖、無水碳酸鈉、磷酸鹽等均為國產(chǎn)分析純。

酶標(biāo)儀(美國，BIO RAD/Model 680)；電熱恒溫水浴鍋(中國，天津市泰斯特儀器有限公司/DK-98-I型)；微型植物粉碎機(中國，天津市泰斯特儀器有限公司/FZ102)；500 g搖擺式中藥粉碎機(中國，溫嶺市奧力中藥器械有限公司/AK-1000A)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(中國，上海精宏試驗設(shè)備有限公司/DHG-946A型)；玻璃儀器氣流烘干器(中國，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司/KQ-C型)；玻璃勻漿機(中國，海門弘澄實驗器材制造有限公司)；電子天平(中國，天津市天馬儀器廠/TD20002；中國，沈陽龍騰電子有限公司/ESJ200-4B；德國，Sartorius/CAP2250)；低溫離心機(中國，上海旦鼎國際貿(mào)易有限公司/Z36HK)；數(shù)控超聲波清洗器(中國，昆明市超聲儀器有限公司/KQ-100DB型)；電加熱套(中國，天津市泰斯特儀器有限公司/98-1-B型)；循環(huán)水式真空泵(中國，鞏義市子華儀器有限責(zé)任公司/SHZ-DⅢ)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(中國，上海豫科教儀器設(shè)備有限公司/R201D)。

1.2　粗總生物堿制備

托盤根中生物堿提?。悍Q取托盤根20.04 g于粉碎機中粉碎，過60目篩。按料液比1∶10加入水200 mL，水煎三次，濾過；殘渣用1∶10的比例加入75%乙醇液，0.1 moL/L的鹽酸調(diào)pH為2，先超聲提取1 h，超聲功率90%，在70 ℃水浴加熱回流3次，每次1 h，合并提取液，濃縮至小體積再用飽和碳酸鈉調(diào)pH為10～11，按1∶1的比例用氯仿萃取5次，每次20 mL，將得到的萃取液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上減壓蒸餾回收氯仿，再將殘留液于60 ℃水浴蒸干得41.1 mg總生物堿[3]。得出的浸膏分別用40%、50%乙醇溶液超聲提取1 h，超聲功率90%，在70 ℃水浴加熱回流3次，每次1 h，濃縮至小體積，最終得到不同醇濃度的生物堿溶液。

(將得到的氯仿層加入0.5%鹽酸，使其呈酸性，然后加入4種常用的生物堿沉淀試劑磷鎢酸試劑、碘化鉀試劑、碘化汞鉀試劑和碘化鉀試劑，通過實驗現(xiàn)象來判定托盤根中是否有生物堿，同時也可以判定該工藝是否適合提取托盤根中的生物堿[4]。)

1.3　大鼠腸α-葡萄糖苷酶的提取

雄性Wister大鼠，空腹24 h，脫臼處死，沿腹白線解剖，取小腸大約20 cm，剪成5 cm/段，放在預(yù)冷的生理鹽水中清洗干凈，在磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 6.8)中清洗，剪刀剪開小腸，干凈玻片刮取小腸膜表面物質(zhì)，加入約2倍量PBS，在玻璃勻漿器中勻漿，勻漿液低溫離心機4 000 r/min離心20 min(4℃),離心后取上清液，分裝進(jìn)凍存管，-20 ℃凍存?zhèn)溆肹5]。

1.4　托盤根生物堿對α-葡萄糖苷酶抑制作用

實驗分為空白組﹑陰性對照組﹑陽性對照組和實驗組，反應(yīng)于96孔培養(yǎng)板上進(jìn)行，反應(yīng)體系均為200 μL。①空白組(緩沖液+底物)加入PBS 120 μL，20 μL的底物麥芽糖，用60 μL蒸餾水補齊200 μL；②陰性對照組(緩沖液+酶+底物)先加入PBS 120 μL和α-糖苷酶溶液20 μL，37 ℃反應(yīng)10 min后加入底物麥芽糖(蔗糖)20 μL，40 μL蒸餾水37 ℃下反應(yīng)15 min；③陽性對照組(緩沖液+酶+阿卡波糖+底物)先加阿卡波糖溶液40 μL和α-糖苷酶溶液20 μL，再加入PBS 120 μL和底物麥芽糖20 μL；④實驗組(樣品+緩沖液+酶液+底物)先加入不同濃度托盤根生物堿溶液40 μL和α-糖苷酶溶液20 μL，托盤根生物堿的終濃度分別為50和75 g/L，加入PBS 120 μL和20 μL的底物麥芽糖。反應(yīng)后加入80 μL的0.2 moL/L碳酸鈉終止反應(yīng)，取反應(yīng)液50 μL，分別加入200 μL的血糖試劑工作液中，37 ℃下反應(yīng)30 min后在405 nm波長處測定吸光度A值并記錄，計算抑制率[6]。抑制率(%)=(A酶活性對照-A樣品)/(A酶活性對照-A空白對照)×100%[7]

1.5　酶活力的測定

以麥芽糖為底物，標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系為：120 μL磷酸鉀緩沖液(PBS，pH 6.8)，20 μL 0.2 U/mLα-葡萄糖苷酶，37 ℃恒溫，15 min后加入麥芽糖20 μL，配成200 μL體系的溶液搖勻，37 ℃恒溫反應(yīng)15 min，再加入80 μL的0.2 moL/L碳酸鈉溶液終止反應(yīng)，于405 nm測OD值(酶活力單位定義：37 ℃、pH 6.8條件下，1 min水解底物生成1 μmoL麥芽糖所需的酶量，規(guī)定為一個酶活力單位[8])。

2　結(jié)　果

2.1　預(yù)試驗的結(jié)果

在酸性提取液中分別加入4種生物堿沉淀劑時，有下列現(xiàn)象發(fā)生：加入磷鎢酸有灰白色絮狀沉淀生成；加入碘化鉀有紫黑色沉淀；加入碘化汞鉀靜置后有淺黃色沉淀生成；加入碘化鉀立即有橙黃色沉淀生成。因為4種沉淀劑都呈陽性反應(yīng)，可以肯定托盤根中含有生物堿，同時也說明該流程適合托盤根中生物堿的提取[2]。

2.2　托盤根中生物堿對α-糖苷酶的活性測定

不同濃度醇提取的不同生物堿濃度的抑糖率見表1,由表1可見,托盤根生物堿40%和50%乙醇洗脫物均對在以麥芽糖為底物時對α-糖苷酶有一定的抑制作用，其中50 g/L總生物堿對α-糖苷酶抑制率最高。

表 1　不同濃度醇提取的不同生物堿濃度的抑糖率

3　討　論

α-葡萄糖苷酶通過水解α-1，4糖苷鍵從多糖的非還原端切下葡萄糖，人體對淀粉、糊精、蔗糖等碳水化合物的利用吸收依賴小腸刷狀緣上該酶的活性。目前已知，α-葡萄糖苷酶廣泛存在于體內(nèi)，是細(xì)胞中糖類代謝不可或缺的重要酶類，如糖蛋白的加工修飾、參與免疫應(yīng)答與抗原提呈等反應(yīng)，所以α-GI不僅可以防治糖尿病、肥胖癥，還具有抗腫瘤和抗AIDS病毒的作用。因此，對α-GI的研究具有重要的臨床意義[9]。

藥用植物生物堿提取方法按提取條件不同可分為冷浸提取法、微波提取法、索氏提取法、膜提取法、回流提取法等。索氏提取是傳統(tǒng)的提取方法，優(yōu)點是提取效率比較高，提取過程簡便，但提取時間長。微波浸提的優(yōu)點就是提取時間短、溫度較低，并且可以為植物有效成分大規(guī)模生產(chǎn)的提取分離提供合理化生產(chǎn)工藝、流程及參數(shù)，因此避免了長時間處于高溫下的氧化，收率和產(chǎn)品質(zhì)量都較傳統(tǒng)方法高[10-11]。通過文獻(xiàn)資料可知，一般當(dāng)微波時間越長、功率越大，則提取率越高。但實驗中提取效率不如索氏，原因可能是微波儀中溶液達(dá)到沸點溫度時，便會提高沸騰頻率同時擴大沸騰范圍，容易使溶液沖入微波儀的冷凝管里，造成一定誤差，因此當(dāng)溶液達(dá)到一定溫度時提取效率便要下降；當(dāng)提取時間增加時，提取效率變化不大，由于微波對細(xì)胞膜的破碎作用隨著功率和時間增加而逐漸增強，從而有利于提??；當(dāng)微波強度進(jìn)一步加強時其強熱效應(yīng)可對某些成分產(chǎn)生破壞作用，則不利于提取效率的提高；微波-超聲波提取時提取劑容量受到限制，提取過程不容易控制，也是提取效率降低的原因之一[12]。通過文獻(xiàn)資料[4]比較得出，料液比1∶10加入75%乙醇200 mL，超聲提取1 h，超聲功率90%，70 ℃水浴加熱回流3次，能較多的提取出托盤根中的總生物堿含量[3]。

因為所測得的生物堿含量較多，所以最后建立了糖苷酶抑制模型，作用于底物麥芽糖，測定其抑制率，觀察降血糖作用。生物堿沉淀反應(yīng)要在酸水或酸性稀醇中進(jìn)行，因為生物堿和生物堿沉淀試劑均可溶于其中，使反應(yīng)易于進(jìn)行且反應(yīng)結(jié)果易于判斷。用沉淀反應(yīng)鑒別生物堿時，應(yīng)注意假陽性和假陰性反應(yīng)。仲胺一般不易與生物堿沉淀試劑反應(yīng)，如麻黃堿。水溶液中如有蛋白質(zhì)、多膚、質(zhì)亦可與此類試劑產(chǎn)生陽性反應(yīng)，故應(yīng)在被檢驗的堿液中除掉這些成分。除掉方法是將酸水提取液堿化，以氯仿萃取，分取氯仿層，再用酸水萃取氯仿層，此酸水層除去了上述水溶性干擾物質(zhì)，可作為沉淀反應(yīng)用溶液。此外，對生物堿定性鑒別時，應(yīng)用三種以上試劑分別進(jìn)行反應(yīng)，均陽性或陰性方有可信性[2]。

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