木霉菌劑與重茬凈復(fù)配防治平貝黑腐病及對(duì)平貝誘導(dǎo)抗性

宋小雙，遇文婧，周 琦，鄧 勛

(黑龍江省森林保護(hù)研究所，哈爾濱150040)

隨著黑龍江省森工全面停止商業(yè)性采伐和經(jīng)營(yíng)模式轉(zhuǎn)型，林下經(jīng)濟(jì)已經(jīng)成為森工林業(yè)經(jīng)濟(jì)中的重要增長(zhǎng)點(diǎn)［1］。北藥栽培是森工林下經(jīng)濟(jì)的重要板塊，其中平貝栽培是部分林業(yè)局的支柱產(chǎn)業(yè)之一。平貝系百合科多年生草本植物平貝母(Fritillaria ussuriensis)干燥的鱗莖，性味平苦，具有清熱解毒、潤(rùn)肺止咳化痰的功效［2］。

黑腐病是平貝最重要的病害，又名菌核病，屬于土傳病害，以土壤為媒介進(jìn)行傳播，嚴(yán)重可導(dǎo)致平貝絕產(chǎn)［3-4］，目前黑腐病主要以化學(xué)防治為主，但效果不理想，多年的化學(xué)防治導(dǎo)致病原菌抗藥性增加，土壤退化，重茬障礙問(wèn)題發(fā)生嚴(yán)重。隨著藥用植物栽培的規(guī)范化，生物防治技術(shù)日益受到重視［5-9］，通過(guò)人為引進(jìn)植物根際有益微生物(包括生防菌)與土壤生物改良劑，在有效控制病害發(fā)生的同時(shí)，促進(jìn)植物生長(zhǎng)、增強(qiáng)抗逆性，并達(dá)到改良土壤理化結(jié)構(gòu)和微生態(tài)系統(tǒng)的目的。對(duì)于藥用植物包括人參、西洋參、田七等的土傳病害生物防治及其生態(tài)控制研究的均有深入研究，包括連坐障礙發(fā)生機(jī)制［10-14］、拮抗菌株的分離篩選［15-19］、生防作用機(jī)理［20］、菌劑田間應(yīng)用［21-22］等，而平貝土傳病害研究較少，本研究在分離鑒定平貝黑腐病致病菌基礎(chǔ)上，采用生物防治和土壤改良技術(shù)相結(jié)合，對(duì)平貝黑腐病的生態(tài)控制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)材料

(1)試驗(yàn)用菌株。綠木霉(Trichoderma virens)T43為從以色列引進(jìn)高效菌株，對(duì)多種植物病害均有高效的防治效果［23-30］，保存于東北林業(yè)大學(xué)森林微生物實(shí)驗(yàn)室。平貝黑腐病病原菌核盤菌PB-06(Sclerotinia sclerotiorum):分離自黑龍江省牡丹江市海林林業(yè)局三十五林場(chǎng)平貝栽培基地，保存于黑龍江省森林保護(hù)研究所。

(2)土壤改良劑。重茬凈復(fù)合生物菌肥購(gòu)自武漢金禾生物科技公司;土壤消毒劑:敵克松(敵磺鈉)購(gòu)自山東天威農(nóng)藥有限公司。

1．2 綠木霉T43及其發(fā)酵液對(duì)平貝黑腐病菌的抑制作用

(1)拮抗作用。采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法［31］，在接種培養(yǎng)黑腐病菌5 d后，接種木霉菌T43，48 h后測(cè)量菌落半徑，計(jì)算抑制率，并對(duì)對(duì)峙拮抗線進(jìn)行觀察和描述，每個(gè)處理3次重復(fù)。

抑制率= ［(對(duì)照菌落半徑-對(duì)峙培養(yǎng)菌落半徑)/對(duì)照菌落半徑］ ×100%。

(2)發(fā)酵液抑菌實(shí)驗(yàn)。采用菌絲生長(zhǎng)抑制法［32］，參考鄧勛［29］方法制備非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物后添加到PDA培養(yǎng)基中，使終濃度達(dá)到20%，以不添加代謝產(chǎn)物的PDA平板作對(duì)照，25℃恒溫培養(yǎng)7d，采用十字交叉法測(cè)量病原菌的菌落直徑，計(jì)算木霉代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌生長(zhǎng)的抑制率，每個(gè)處理3次重復(fù)。

抑制率= ［(對(duì)照菌落半徑-抑制培養(yǎng)菌落半徑)/對(duì)照菌落半徑］ ×100%。

1．3 平貝黑腐病生物-化學(xué)防治實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

(1)防治地點(diǎn)及概況。位于牡丹江市海林林業(yè)局三十五林場(chǎng)平貝栽培基地，平貝種植面積124 hm2，平貝栽培始于1980年，為多年連作栽培模式，林場(chǎng)年有效積溫2 400℃。全年日照時(shí)數(shù)2 540 h。年平均降水量550 mm。無(wú)霜期125 d左右，近年平貝黑腐病、灰霉病發(fā)生嚴(yán)重，發(fā)病率50%以上。

(2)防治時(shí)間:2013年6月。

(3)防治實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。使用藥劑包括生防菌綠木霉、土壤改良劑重茬凈、土壤消毒劑敵克松不同組合，試驗(yàn)設(shè)計(jì)如下:①綠木霉;②重茬凈;③敵克松;④綠木霉+重茬凈;⑤綠木霉+重茬凈+敵克松;⑥對(duì)照，每處理面積50 m2，在6月份平貝采收栽培同時(shí)，采用拌土的方式施用藥劑。

1．4 調(diào)查指標(biāo)及統(tǒng)計(jì)分析

(1)防治效果調(diào)查。2014年5月份進(jìn)行防治效果調(diào)查，在不同防治處理區(qū)分別取樣，調(diào)查平貝地下鱗莖黑腐病發(fā)病情況，統(tǒng)計(jì)發(fā)病鱗莖和健康鱗莖數(shù)量，計(jì)算發(fā)病率和防治效果。

相對(duì)防治效果(%)= ［(對(duì)照發(fā)病率-處理發(fā)病率)/對(duì)照發(fā)病率］ ×100%。

(2)不同處理對(duì)平貝根際微生物群落的影響。分別在2013年7月和2014年5月兩次采集平貝根際土樣，采用平板計(jì)數(shù)法［33］統(tǒng)計(jì)平貝根際真菌、細(xì)菌和放線菌數(shù)量，評(píng)價(jià)不同處理對(duì)土壤微生物群落的影響和土壤改良作用。

(3)對(duì)主要生理指標(biāo)的影響。2014年5月采集平貝樣品，測(cè)定生理指標(biāo)。

可溶性蛋白含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G250法測(cè)定［34］。

葉綠素與類胡蘿卜素含量測(cè)定采用丙酮-乙醇混合液法測(cè)定［35］。

抗氧化酶(SOD酶、POD酶、CAT酶)活性采用南京建成生物工程公司的抗氧化檢測(cè)試劑盒利用光度計(jì)法進(jìn)行酶活測(cè)定［36］。

2 結(jié)果與分析

2．1 木霉菌對(duì)平貝黑腐病菌的離體測(cè)試

對(duì)峙培養(yǎng)結(jié)果表明綠木霉T43對(duì)平貝黑腐病菌PB-06有較好的拮抗作用，對(duì)病原菌的抑制率為60．23%，對(duì)峙培養(yǎng)后期，綠木霉菌落完全覆蓋病原菌菌落，體現(xiàn)了極強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)作用。同時(shí)綠木霉發(fā)酵液提取物也可以明顯抑制平貝黑腐病菌PB06的菌絲生長(zhǎng)，抑制率為62．58%，病原菌菌落生長(zhǎng)緩慢，菌絲稀疏，氣生菌絲較多。

2．2 平貝黑腐病生物-化學(xué)防治

為有效控制平貝黑腐病，本次實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)采用了生防菌劑(木霉菌劑)、土壤改良劑(重茬凈)和土壤消毒劑(敵克松)分別對(duì)平貝黑腐病進(jìn)行了防治研究，通過(guò)調(diào)查植株發(fā)病率，結(jié)果表明木霉菌結(jié)合土壤改良劑重茬凈可有效控制平貝黑腐病的發(fā)生(見(jiàn)表1)。不同處理之間差異顯著(P＜0．05)，由于多年連作，平貝黑腐病菌對(duì)化學(xué)殺菌劑形成了較強(qiáng)的抗性，單獨(dú)使用敵克松后，對(duì)病害的相對(duì)防治效果只有36．01%，而綠木霉+重茬凈效果最好，相對(duì)防治效果達(dá)到69．24%，其次是綠木霉+重茬凈+敵克松，相對(duì)防治效果為64．58%。目前的統(tǒng)計(jì)結(jié)果是防治第一年的效果，而平貝從栽培到采收，要連續(xù)在土壤中存留2 a周期，因此，防治效果的持續(xù)性，需要到下一點(diǎn)繼續(xù)調(diào)查。

表1 平貝黑腐病的生物-化學(xué)防治效果Tab．1 Bio-chemical control effect on F．ussuriensis black rot

2．3 對(duì)平貝根際微生物群落的影響

通過(guò)生物—化學(xué)防治技術(shù)可有效控制平貝黑腐病的發(fā)生，通過(guò)統(tǒng)計(jì)防治前后平貝根際微生物群落的數(shù)量變化，可以間接反映對(duì)平貝連作土的改良和修復(fù)作用(見(jiàn)表2)，我們對(duì)平貝健康和受害植物根際的微生物群落也進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析(數(shù)據(jù)未在此展示)，以闡明其發(fā)病機(jī)理，研究結(jié)果表明，連作年份越長(zhǎng)，其微生物生態(tài)系統(tǒng)越趨向于單一，同時(shí)真菌數(shù)量明顯高于正常數(shù)量，而細(xì)菌數(shù)量與不連作土壤相比，更加豐富。而通過(guò)生物-化學(xué)防治技術(shù)在有效控制平貝黑腐病發(fā)生的同時(shí)，對(duì)連作土的生物修復(fù)作用也起到了明顯的效果，同防治前相比，除單獨(dú)使用敵克松外，綠木霉、重茬凈、綠木霉+重茬凈以及綠木霉+重茬凈+敵克松的組合均提高了土壤中細(xì)菌和防線菌的數(shù)量，豐富了微生物種群，而木霉菌處理組合中，真菌數(shù)量的增加，通過(guò)平板培養(yǎng)證明是木霉菌在土壤中有效定殖，提高了土壤中真菌的數(shù)量。

2．4 對(duì)平貝主要生理指標(biāo)的影響

木霉菌T43對(duì)植物具有促生抗逆作用，而土壤改良劑重茬凈主要生物成份為生防細(xì)菌和放線菌，在有效控制病害發(fā)生的同時(shí)，對(duì)土壤改良和修復(fù)也起到了重要作用。2種生物菌劑在使用后，對(duì)平貝的主要生理指標(biāo)包括可溶性蛋白含量和葉綠素含量均有提高作用(見(jiàn)表3)。其中綠木霉+重茬凈組合同對(duì)照相比，平貝可溶性蛋白含量提高30%左右，大大增加了平貝的干物質(zhì)含量，在后續(xù)研究中，通過(guò)測(cè)定平貝主要活性成分含量的變化對(duì)生物菌劑施用的響應(yīng)作用，可以進(jìn)一步說(shuō)明生物制劑對(duì)平貝植株生長(zhǎng)的影響。平貝植株保護(hù)酶包括SOD、CAT和POD在施用生物菌劑后均有一定程度的提高(見(jiàn)表4)，提高幅度在10% ～20%之間，說(shuō)明平貝植株的抗逆性提高，對(duì)黑腐病的發(fā)生也起到一定的抑制作用。

表2 生物-化學(xué)防治技術(shù)對(duì)平貝根際微生物群落的影響Tab．2 The effect of bio-chemical control on F．ussuriensis rhizosphere microbial community

表3 生物-化學(xué)防治技術(shù)對(duì)平貝葉片主要生理指標(biāo)的影響Tab．3 The effect of bio-chemical control on F．ussuriensis leaf physiological index

表4 生物-化學(xué)防治技術(shù)對(duì)平貝植株保護(hù)酶活性的影響Tab．4 The effect of bio-chemical control on F．ussuriensis protective enzyme activity

3 結(jié)論與討論

(1)采用生防菌劑(木霉菌)+土壤改良劑(重茬凈)+土壤消毒劑(敵克松)的不同組合對(duì)平貝黑腐病的田間防治進(jìn)行研究，結(jié)果表明木霉菌+重茬凈組合可有效控制病害發(fā)生，對(duì)平貝黑腐病的相對(duì)防治效果達(dá)到69．94%。

(2)生物菌劑的使用可有效改良平貝連作土中微生物群落結(jié)構(gòu)，改變病原菌占主導(dǎo)地位的格局，增加細(xì)菌和放線菌生物量，使土壤微生態(tài)系統(tǒng)保持穩(wěn)定。

將不同生防菌和土壤微生物改良劑復(fù)配，發(fā)揮各自的優(yōu)勢(shì)和協(xié)同作用，可以降低植物病害的發(fā)病率，增強(qiáng)防治效果［37］。木霉菌T43對(duì)多種植物病害均有高效的防治效果［23-30］，競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)在于產(chǎn)孢量大、易于擴(kuò)大生存空間，同時(shí)代謝抑菌活性成分。重茬凈含有多種益生細(xì)菌，具有改良土壤的作用。本研究將木霉與重茬凈復(fù)配施用，對(duì)平貝黑腐病進(jìn)行防治，相對(duì)防效可達(dá)69．94%，能夠?qū)崿F(xiàn)不同生防機(jī)制同時(shí)起作用，避免了單一生防菌應(yīng)用導(dǎo)致的病原微生物抗性的產(chǎn)生。多種生防菌復(fù)配使用是解決土傳病害和重茬障礙的有效途徑，張愛(ài)華用2種生防細(xì)菌復(fù)配對(duì)西洋參銹腐病的盆栽和田間相對(duì)防效分別達(dá)到88．93%和44．57%，可有效控制病害的發(fā)生［21］。長(zhǎng)柄木霉和涇陽(yáng)鏈霉菌兩種生防菌復(fù)配，對(duì)煙草黑脛病的相對(duì)防治效果達(dá)到了69．3%［38］。木霉菌與土壤改良劑的復(fù)配使用對(duì)平貝的增產(chǎn)機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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