調(diào)節(jié)Lnk/干細胞因子-干細胞因子受體通路對糖尿病狀態(tài)骨髓間充質(zhì)干細胞成骨功能的影響

李昊 周海倫 王琪 李偉

1.廣西醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院口腔修復(fù)科，南寧 530021；2.口腔疾病研究國家重點實驗室 華西口腔醫(yī)院（四川大學），成都 610041

近年來，糖尿病在人群中的發(fā)病率逐年升高。糖尿病患者長期高血糖狀態(tài)可引起身體多種組織、器官發(fā)生病變，糖尿病性骨疾病就是重要的并發(fā)癥之一。糖尿病患者易罹患骨質(zhì)疏松、骨缺損愈合障礙等骨性疾病，導(dǎo)致牙槽骨快速吸收、拔牙創(chuàng)愈合遲緩等不良后果，嚴重影響多種口腔疾病治療的實施，其發(fā)病機制復(fù)雜，且常規(guī)治療往往效果不佳，如何治療糖尿病性骨疾病已成為臨床工作的難點之一。

隨著研究不斷深入，越來越多的資料顯示，糖尿病狀態(tài)下細胞成骨功能障礙是此類疾病發(fā)生的重要原因。作為新興細胞生物學研究中的重要細胞，骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）在牙槽骨等骨形成過程中的作用倍受矚目。連接蛋白Lnk是新發(fā)現(xiàn)的在干細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中有重要橋梁作用的蛋白，在多種病理狀態(tài)下高表達[1-2]，其下游的干細胞因子（stem cell factor，SCF）-干細胞因子受體（cKit）通路在多種干細胞遷移、分化等過程中起關(guān)鍵作用[3]。既往研究[4]表明，抑制Lnk的表達，調(diào)節(jié)Lnk/SCF-cKit信號通路可在骨折愈合過程中促進成骨。本研究擬用靶向Lnk的RNA干擾技術(shù)調(diào)節(jié)糖尿病狀態(tài)BMSCs的Lnk/SCF-cKit通路，并檢測BMSCs成骨功能的變化，探討改善糖尿病狀態(tài)BMSCs成骨功能的方法，為探尋糖尿病性骨疾病的治療措施提供新思路。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

靶向干擾Lnk基因的shRNA（Dharmacon公司，美國），正義鏈5'-CGAGUUACCUCUUUCCUUA-3'。鏈脲佐菌（Sigma公司，美國），小鼠抗大鼠單克隆抗體Lnk、SCF、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨鈣素（osteocalcin，OCN）、Ⅰ型膠原蛋白a1（collagen typeⅠ a1，ColⅠa1）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）（Santa Cruz公司，美國），兔抗大鼠多克隆抗體cKit（Abcam公司，美國），小鼠抗大鼠單克隆抗體CD11b、CD44、CD45、CD90、羊抗小鼠IgG抗體、羊抗兔IgG抗體、SP染色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），Nikon 80i型顯微鏡（Nikon公司，日本），BIO-RAD Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD公司，美國）。

1.2 構(gòu)建大鼠糖尿病模型并分離培養(yǎng)BMSCs

SPF級4周齡SD雄性大鼠8只經(jīng)過高糖食物喂養(yǎng)4周，空腹12 h后腹腔注射鏈脲佐菌素（35 mg·kg-1體重），1周后取尾靜脈血檢測空腹血糖值，超過11.1 mmol·L-1者視為糖尿病模型構(gòu)建成功[5]。大鼠形成糖尿病后，以常規(guī)鼠飼料喂養(yǎng)4周（每周測血糖確定糖尿病狀態(tài)），處死大鼠。

處死糖尿病大鼠后無菌條件下分離四肢長骨，放入αMEM培養(yǎng)基中漂洗。然后將長骨放入含10%青霉素/鏈霉素的αMEM培養(yǎng)基中去除表面軟組織，更換培養(yǎng)基后切斷干骺端并沖出骨髓，經(jīng)過濾、離心后將所得細胞重懸于含10%胎牛血清及10%青霉素/鏈霉素的αMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)，獲得BMSCs。

正常BMSCs以相同方法取自與糖尿病大鼠相同周齡的8只正常大鼠（正常大鼠處死前均以常規(guī)鼠飼料喂食，處死前測定血糖確定未患糖尿?。?。

1.3 免疫細胞化學染色鑒定BMSCs

如文獻[6]所述方法，將生長狀態(tài)良好的糖尿病大鼠及正常大鼠第3代細胞接種于蓋玻片上，制備細胞爬片。細胞爬片經(jīng)40 g·L-1多聚甲醛固定，5 g·L-1Triton X-100孵育后，使用3%H2O2、封閉血清孵育，CD11b、CD44、CD45、CD90小鼠抗大鼠單克隆抗體（1︰200）作為一抗孵育，PBS代替一抗作為空白對照，二抗工作液孵育后進行DAB顯色劑顯色，采用免疫細胞化學技術(shù)檢測細胞表面標記物來鑒定細胞。陽性信號為細胞質(zhì)或細胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒。

1.4 RNA干擾BMSCs

選取生長狀態(tài)良好的第3代糖尿病大鼠BMSCs進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前24 h將干細胞接種至24孔板，每孔接種3×105個細胞，細胞分為空白對照組、陰性對照組和RNA干擾組。空白對照組：不加任何干預(yù)措施；陰性對照組：用空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs；RNA干擾組：用靶向Lnk基因的shRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs。轉(zhuǎn)染后用含有4 mg·L-1嘌呤霉素的培養(yǎng)基進行陽性細胞篩選，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞。正常大鼠的BMSCs按相同方法進行轉(zhuǎn)染及篩選，細胞分為正常對照組、正常陰性組和正常干擾組。正常對照組：不加任何干預(yù)措施；正常陰性組：用空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs；正常干擾組：用靶向Lnk基因的shRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs。

獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞后在成骨誘導(dǎo)前用免疫印跡實驗檢測BMSCs的Lnk及其下游SCF-cKit通路主要蛋白SCF、cKit的表達，檢測RNA干擾效果。收集各組細胞抽提蛋白后，以BCA法定量，即在96孔板中每孔加入蛋白標準品或蛋白樣品20 μL，每孔加入200 μL的BCA工作試劑，37 ℃溫育30 min，用酶標儀在562 nm檢測吸光度值，制作標準曲線并根據(jù)標準曲線計算蛋白樣品濃度。以每孔50 μg的上樣量加入各組蛋白，進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelec-trophoresis，SDS-PAGE），濕轉(zhuǎn)后50 g·L-1脫脂牛奶封閉lh，Lnk、SCF、GAPDH小鼠抗大鼠單克隆抗體（1︰500）、cKit兔抗大鼠多克隆抗體（1︰600）作為一抗孵育2 h，羊抗小鼠或羊抗兔IgG抗體作為二抗（1︰3 000）孵育2 h，增強化學發(fā)光法（enhanced chemiluminescence，ECL）顯影，分析BIO-RAD Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)分析目的蛋白與內(nèi)參GAPDH條帶的相對灰度值。每組細胞蛋白免疫印跡實驗重復(fù)6次。

1.5 誘導(dǎo)細胞成骨分化

獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞后，將空白對照組、陰性對照組和RNA干擾組大鼠BMSCs在模擬糖尿病狀態(tài)的高糖成骨培養(yǎng)基中培養(yǎng)，進行成骨誘導(dǎo)，培養(yǎng)液為：含12 mmol·L-1葡萄糖的αMEM培養(yǎng)基，加入10%胎牛血清、10 nmol·L-1地塞米松、0.1 mmol·L-1抗壞血酸、1 mol·L-1β-甘油磷酸鈉。正常對照組、正常陰性組和正常干擾組BMSCs在普通成骨培養(yǎng)基中培養(yǎng)，進行成骨誘導(dǎo)，培養(yǎng)液為：標準αMEM培養(yǎng)基，加入10%胎牛血清、10 nmol·L-1地塞米松、0.1 mmol·L-1抗壞血酸、1 mol·L-1β-甘油磷酸鈉。

1.6 免疫印跡實驗檢測成骨誘導(dǎo)分化后細胞蛋白的表達

于成骨誘導(dǎo)28 d用免疫印跡實驗檢測各組BMSCs中Lnk及其下游SCF-cKit通路主要蛋白SCF、cKit以及成骨相關(guān)蛋白ALP、OCN、ColⅠa1的表達。收集細胞抽提蛋白，如1.4部分所述用BCA法定量后，進行SDS-PAGE凝膠電泳，Lnk、SCF、GAPDH小鼠抗大鼠單克隆抗體（1︰500），cKit兔抗大鼠多克隆抗體（1︰600），ALP、OCN、ColⅠa1小鼠抗大鼠單克隆抗體（1︰600）作為一抗孵育2 h，二抗（1︰3 000）孵育2 h，ECL顯影，分析目的蛋白與內(nèi)參GAPDH條帶的相對灰度值。每組細胞蛋白免疫印跡實驗重復(fù)6次。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，采用成組設(shè)計方差分析進行各組間的比較，兩兩比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫細胞化學染色鑒定BMSCs

染色結(jié)果顯示，分離培養(yǎng)的細胞表達CD44、CD90，不表達CD11b、CD45，符合BMSCs表面標記物特征（圖1）。

圖1 BMSCs中CD11b、CD44、CD45、CD90的表達 SP × 400Fig 1 Expression of CD11b, CD44, CD45 and CD90 in BMSCs SP × 400

2.2 大鼠的空腹血糖值

注射鏈脲佐菌素1周以后，糖尿病大鼠的空腹血糖值均高于11.1 mmol·L-1，平均值為（15.207±1.535） mmol·L-1，符合糖尿病模型構(gòu)建成功標準。而正常大鼠的空腹血糖值均低于11.1 mmol·L-1，平均值為（5.416±1.102） mmol·L-1。處死大鼠當日，糖尿病大鼠的空腹血糖值均高于11.1 mmol·L-1，平均值為（17.362±2.217） mmol·L-1；正常大鼠的空腹血糖值均低于11.1 mmol·L-1，平均值為（5.791±0.834） mmol·L-1。

2.3 免疫印跡實驗檢測靶向Lnk的RNA干擾效果

與糖尿病各組相比，正常對照組低表達Lnk，高表達SCF、cKit（P＜0.05）；與空白對照組、陰性對照組BMSCs相比，RNA干擾組Lnk表達降低，SCF、cKit表達升高（P＜0.05）；空白對照組與陰性對照組相比，Lnk、SCF、cKit的表達無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；與正常對照組、正常陰性組BMSCs相比，正常干擾組Lnk表達降低，SCF、cKit表達升高（P＜0.05）；正常對照組與正常陰性組相比，Lnk、SCF、cKit的表達無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）（圖2，表1）。

圖2 免疫印跡實驗檢測成骨誘導(dǎo)前各組BMSCs的蛋白表達Fig 2 Western blot analysis of different protein expression in BMSCsbefore osteogenic differentiation

表1 成骨誘導(dǎo)前各組BMSCs的蛋白表達Tab 1 Protein expression in BMSCs before osteogenic differentiation

2.4 免疫印跡實驗檢測誘導(dǎo)成骨分化后細胞蛋白的表達

誘導(dǎo)成骨分化28 d，與正常對照組BMSCs相比，糖尿病狀態(tài)各組BMSCs的Lnk表達水平高，SCF、cKit表達水平低，成骨相關(guān)蛋白ALP、OCN、ColⅠa1表達少（P＜0.05）；與空白對照組、陰性對照組BMSCs相比，RNA干擾組細胞Lnk表達減少，SCF、cKit、ALP、OCN、ColⅠa1的表達增加（P＜0.05）；空白對照組與陰性對照組相比，Lnk、SCF、cKit、ALP、OCN、ColⅠa1的表達均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；與正常對照組、正常陰性組BMSCs相比，正常干擾組Lnk表達降低，SCF、cKit、ALP、OCN、ColⅠa1表達升高（P＜0.05）；正常對照組與正常陰性組相比，Lnk、SCF、cKit、ALP、OCN、ColⅠa1的表達無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）（圖3，表2）。

圖3 免疫印跡實驗檢測成骨誘導(dǎo)28 d各組BMSCs的蛋白表達Fig 3 Western blot analysis of different protein expression in BMSCs 28 days after osteogenic differentiation

表2 成骨誘導(dǎo)28 d各組BMSCs的蛋白表達Tab 2 Protein expression in BMSCs 28 days after osteogenic differentiation

3 討論

糖尿病狀態(tài)使細胞成骨功能障礙，是糖尿病性骨疾病發(fā)生發(fā)展的重要原因。BMSCs存在于全身多個部位的骨組織中，可分化為成骨細胞、成軟骨細胞等，近年來發(fā)現(xiàn)BMSCs也存在于牙槽骨組織中，是牙槽骨生長代謝與缺損修復(fù)的細胞儲庫[7]，細胞外糖狀態(tài)、細胞因子等因素可影響B(tài)MSCs的成骨功能，進而改變骨組織的生長及缺損修復(fù)進程[8]。

近年來，Lnk因在多種干細胞的遷移、分化等過程中起重要調(diào)節(jié)作用受到越來越多的關(guān)注[1-2]。Lnk在其介導(dǎo)的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中起重要的橋梁作用，溝通整條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。Lnk的表達變化能調(diào)節(jié)造血干細胞的增殖、內(nèi)皮祖細胞的分化等多種病理生理過程[9]。有研究[2]顯示，靶向抑制正常成骨細胞的Lnk表達，可促進其骨向分化，并且抑制Lnk的表達可改善小鼠骨折愈合過程，促進骨折部位的骨形成，但其中的作用機制尚不明確。SCF-cKit信號通路是Lnk蛋白重要的下游通路之一，與組織細胞分化再生障礙關(guān)系密切[3-4]。Lnk蛋白Src同源區(qū)2結(jié)構(gòu)可活化SCF，影響SCF與cKit特異性結(jié)合，激活cKit，介導(dǎo)下游通路細胞分化信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)[10]。

本研究構(gòu)建大鼠糖尿病模型并分離培養(yǎng)BMSCs，在體外RNA干擾Lnk的表達，觀察到在誘導(dǎo)成骨分化前后，與正常對照組相比，糖尿病狀態(tài)各組BMSCs高表達Lnk，低表達SCF、cKit；與空白對照組、陰性對照組相比，RNA干擾組Lnk表達減少，SCF、cKit表達增加，提示在糖尿病狀態(tài)下BMSCs的Lnk表達過度，下游SCF-cKit通路受到抑制，而靶向Lnk的RNA干擾能有效抑制BMSCs的Lnk表達，激活SCF-cKit通路。對正常大鼠BMSCs進行靶向Lnk的RNA干擾后，在誘導(dǎo)成骨分化前后，Lnk的表達降低，SCF、cKit的表達增加，提示在正常血糖狀態(tài)下抑制BMSCs的Lnk表達也可激活下游SCF-cKit通路。

目前已證實，ALP、OCN、ColⅠa1是成骨過程中的重要蛋白，ALP是骨形成所必需的酶，能反映細胞骨向分化、促進成骨的能力，是生物礦化和成骨樣細胞的特征性標記[11]；OCN是成骨過程中的一種特異蛋白，伴隨細胞向成骨細胞分化、成熟而逐漸表達增加；ColⅠa1是由骨形成細胞生產(chǎn)到骨基質(zhì)中的主要有機成分，是成骨分化的又一重要標志物[12]。本研究結(jié)果可見，與正常對照組BMSCs相比，糖尿病狀態(tài)各組BMSCs表達ALP、OCN、ColⅠa1減少，且Lnk表達水平升高，SCF、cKit表達水平降低，提示在糖尿病狀態(tài)下存在BMSCs成骨分化障礙，并可能與Lnk/SCF-cKit信號通路激活異常有關(guān)。有研究[2,4]顯示，調(diào)節(jié)Lnk/SCF-cKit通路可促進成骨細胞形成鈣化結(jié)節(jié)，并促進骨形成。本實驗也觀察到，靶向抑制正常大鼠BMSCs的Lnk表達，可使細胞SCF、cKit、ALP、OCN、ColⅠa1的表達增加，提示調(diào)節(jié)Lnk/SCF-cKit信號通路可以促進正常BMSCs的成骨分化；而與糖尿病狀態(tài)其他各組細胞相比，RNA干擾組Lnk表達減少，SCF、cKit、ALP、OCN、ColⅠa1的表達增加，提示抑制Lnk的表達、激活下游SCF-cKit通路可能改善糖尿病狀態(tài)BMSCs的成骨分化，調(diào)節(jié)Lnk/SCF-cKit通路可能為治療糖尿病性骨疾病提供新思路。

致謝：本研究在廣西重點實驗室口腔頜面修復(fù)與重建研究實驗室中完成，感謝楊亦萍、卿海云、曹陽老師的實驗指導(dǎo)。

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