糖基化終末產(chǎn)物對(duì)人牙周膜干細(xì)胞骨向分化過(guò)程中的Wnt經(jīng)典信號(hào)通路研究

伍燕 鄧超 楊琨 崔曉霞 劉琪 金巖

1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院，遵義 563003；2.貴陽(yáng)市口腔醫(yī)院牙周科，貴陽(yáng) 550002；3.第四軍醫(yī)大學(xué)組織工程中心，西安 710032

糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）與糖尿病多種并發(fā)癥的發(fā)生密切相關(guān)[1]。近年來(lái)，有研究[2]表明糖尿病患者晚期AGEs的大量積聚可促進(jìn)糖尿病的發(fā)展，并且可誘導(dǎo)牙周病的發(fā)生和發(fā)展。人牙周膜干細(xì)胞（human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs）具有自我更新和多向分化潛能，在維持牙周結(jié)構(gòu)穩(wěn)態(tài)方面起著重要的作用，其功能數(shù)量的變化會(huì)導(dǎo)致牙周膜的破壞[3]。研究[4]表明AGEs能使hPDLSCs增殖過(guò)程中的Wnt經(jīng)典通路受到抑制，最終導(dǎo)致該細(xì)胞增殖能力有所減弱，AGEs又可以抑制該細(xì)胞的成骨分化能力，并在一定范圍內(nèi)呈濃度依賴性[5]。但AGEs是否影響了hPDLSCs骨向分化過(guò)程中的Wnt經(jīng)典信號(hào)通路，目前尚無(wú)定論，故本實(shí)驗(yàn)旨在研究AGEs介導(dǎo)下的hPDLSCs骨向分化過(guò)程中的Wnt經(jīng)典通路，并與正常細(xì)胞進(jìn)行比較，從而探討糖尿病牙周炎的發(fā)病機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

α-MEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶（Gibco公司，美國(guó)），膠原酶、胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），AGEs-BSA（Bio Vision公司，美國(guó)），細(xì)胞總RNA提取試劑盒、一步法逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RTPCR）試劑盒（Takara公司，日本），茜素紅（上海化學(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)站），β-鏈蛋白（β-catenin）兔抗人單克隆抗體（Abcam公司，美國(guó)），體式顯微鏡、倒置相差顯微鏡以及照相系統(tǒng)（Olympus公司，日本），流式細(xì)胞儀（Beckmen Coulter公司，美國(guó)），實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（real time polymerase chain reaction，real time PCR）儀器（Applied biosystems公司，美國(guó)）。

1.2 取材和細(xì)胞培養(yǎng)

收集12～18歲因正畸需要而拔除的牙周健康、無(wú)齲壞的年輕前磨牙，PBS沖洗后刮取根中1/3牙周膜組織，移入無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，加入少許α-MEN培養(yǎng)液，將牙周膜組織銳性分離，離心后棄上清，加入膠原酶至37 ℃、CO2孵箱中消化15 min，加入正常培養(yǎng)液終止其消化作用，離心后取上清，將分離的組織塊均勻平鋪于6孔板中，以無(wú)菌蓋玻片覆蓋組織塊，加入含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液，置37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，待組織塊周圍有細(xì)胞爬出時(shí)去除蓋玻片，每3 d換液，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80%時(shí)進(jìn)行傳代。

1.3 有限稀釋法克隆化培養(yǎng)純化hPDLSCs

參照以往文獻(xiàn)報(bào)道采用有限稀釋法對(duì)hPDLSCs進(jìn)行克隆分離。首先獲取第一代牙周膜細(xì)胞，將第一代牙周膜細(xì)胞懸液有限稀釋至密度為每毫升10個(gè)，用加樣器向96孔培養(yǎng)板每孔內(nèi)加0.15 mL，使每孔細(xì)胞懸液中約1個(gè)細(xì)胞，經(jīng)過(guò)37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后在倒置顯微鏡下檢查，挑選含單細(xì)胞孔，做標(biāo)記并補(bǔ)加0.1 mL培養(yǎng)基，待孔中細(xì)胞增至占孔底面積l/3～l/2時(shí)，常規(guī)培養(yǎng)傳代。

1.4 hPDLSCs初步鑒定

取克隆純化的hPDLSCs，棄培養(yǎng)液，PBS洗2次，胰蛋白酶消化3 min，α-MEM培養(yǎng)基終止，800 r·min-1離心5 min，棄上清；再以含3%胎牛血清的PBS重懸細(xì)胞，使細(xì)胞密度達(dá)到每升3.0×109個(gè)，分裝到Eppendof管中，每管200 μL的細(xì)胞懸液，室溫下每個(gè)管加入2 μL的STRO-1、CD14、CD105、CD29小鼠抗人單克隆抗體，避光4 ℃冰箱孵育1 h；再用含3%胎牛血清的PBS清洗3次，1 000 r·min-1離心5 min，最后再以含3%胎牛血清的PBS重懸。使用同型對(duì)照單克隆抗體確定背景標(biāo)記，用流式細(xì)胞儀分析熒光細(xì)胞，專用的配套軟件計(jì)算細(xì)胞表面抗原陽(yáng)性表達(dá)率，單位用百分比表示。

1.5 分組成骨誘導(dǎo)后堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）和茜素紅染色

實(shí)驗(yàn)分為正常hPDLSCs組（N-hPDLSCs組）和AGEs刺激的正常hPDLSCs組（A-hPDLSCs組）。N-hPDLSCs組用含10%血清的正常α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；A-hPDLSCs組加入含10 μg·mL-1AGEs，10%血清的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。分別取第3代克隆形成細(xì)胞以每毫升5×104個(gè)的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞增殖到70%時(shí)，按以上分組加成骨誘導(dǎo)液（10 mmol·L-1β-甘油磷酸鈉、10-8mol·L-1地塞米松、50 μg·mL-1維生素C）分別誘導(dǎo)7 d和21 d，每3 d換液一次；對(duì)照組細(xì)胞不加誘導(dǎo)液，常規(guī)培養(yǎng)，7 d后行ALP染色，21 d后行茜素紅染色。

1.6 real time PCR檢測(cè)

分別取第3代克隆形成細(xì)胞以每毫升5×104個(gè)的密度接種于小瓶中，待細(xì)胞增殖到70%時(shí)，分4組：N-hPDLSCs組（用含10%血清的正常α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)）；Os N-hPDLSCs組（用含有成骨誘導(dǎo)液的10%血清的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)）；A-hPDLSCs組（用含10 μg·mL-1AGEs，10%血清的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)）；Os A-hPDLSCs組（用含10 μg·mL-1AGEs，且含成骨誘導(dǎo)液的10%血清的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)）。每3 d換液一次，7 d后分別提取RNA，RT-PCR檢測(cè)成骨相關(guān)基因骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP）、ALP、runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（runt related transcription factor 2，Runx-2）及Dickkopf-1蛋白（DKK-1）、β-catenin表達(dá)。用細(xì)胞總RNA提取試劑盒一步法提取培養(yǎng)細(xì)胞總RNA，β-actin為內(nèi)參照。參照GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，采用Primer primer 5.0計(jì)算機(jī)軟件設(shè)計(jì)引物，由Takara公司（日本）合成，反應(yīng)條件參考產(chǎn)品說(shuō)明書，引物序列如下。β-actin上游引物序列：5'-TGGCACCCAGCACAATGAA-3'，下游引物序列：5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3'；Runx-2上游引物序列：5'-CACTGGCGCTGCAACAAGA-3'，下游引物序列：5'-CATTCCGGAGCTCAGCAGAATAA-3'；ALP上游引物序列：5'-GGACCATTCCCACGTCTTCAC-3'，下游引物序列：5'-CCTTGTAGCCAGGCCCATTG-3'；BSP上游引物序列：5'-CTGGCACAGGGTATACAGGGTTAG-3'，下游引物序列：5'-ACTGGTGCCGTTTATGCCTTG-3'；β-catenin上游引物序列：5'-AGGAAGCTTCCAGACACGC-3'，下游引物序列：5'-CGCACTGCCATTTTAGCTCC-3'；DKK-1上游引物序列：5'-CACTGCATTTGGATAGCTGGTT-3'，下游引物序列：5'-GAAGGTCTGTCTTGCCGGATAC-3'。

1.7 Western blot檢測(cè)

采用Western blot檢測(cè)各組總蛋白中成骨蛋白BSP、Runx-2的表達(dá)及核蛋白中β-catenin的表達(dá)，采用細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒進(jìn)行核蛋白提取，蛋白含量測(cè)定采用Bradeford蛋白濃度測(cè)定試劑盒。十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，免疫反應(yīng)，最后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，對(duì)2組間相關(guān)蛋白表達(dá)進(jìn)行分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩獨(dú)立樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hPDLSCs的分離與培養(yǎng)

本實(shí)驗(yàn)采用酶解組織塊法培養(yǎng)原代細(xì)胞，一般3～10 d組織塊周圍有細(xì)胞爬出（圖1），再通過(guò)有限稀釋法得到正常的hPDLSCs，該細(xì)胞形態(tài)呈長(zhǎng)梭形，胞核聚集在中心，胞體豐滿，2周左右可達(dá)80%匯合。

圖1 原代細(xì)胞（左）和第一代牙周膜細(xì)胞（右）的形態(tài)觀察倒置顯微鏡 × 20Fig 1 Morphology of primary cells (left) and the first generation of periodontal ligament cells (right) inverted microscope × 20

2.2 流式細(xì)胞儀對(duì)干細(xì)胞初步鑒定

采用流式細(xì)胞儀對(duì)表型分子進(jìn)行鑒定，表面抗原STRO-1、CD14、CD105、CD29陽(yáng)性率分別為10.4%、0.6%、96.0%、98.4%。

2.3 分組成骨誘導(dǎo)后ALP和茜素紅染色比較

誘導(dǎo)7 d后，進(jìn)行ALP染色，A-hPDLSCs組明顯淺于N-hPDLSCs組（圖2）。誘導(dǎo)21 d后，比較2組成骨誘導(dǎo)形成的鈣化結(jié)節(jié)：發(fā)現(xiàn)在相同視野下，A-hPDLSCs組形成的鈣化結(jié)節(jié)明顯少于N-hPDLSCs組（圖3）。

圖2 ALP染色結(jié)果Fig 2 ALP staining

圖3 成骨誘導(dǎo)21 d后，鈣化結(jié)節(jié)形成 茜素紅染色 × 10Fig 3 After 21 days, the formation of calcified nodules alizarin red staining × 10

定量分析得到，A-hPDLSCs組和N-hPDLSCs組OD值分別為0.145 75±0.036 29、0.538 50±0.033 04，二者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 RT-PCR檢測(cè)成骨相關(guān)基因及Wnt經(jīng)典通路相關(guān)基因表達(dá)

通過(guò)RT-PCR檢測(cè)誘導(dǎo)7 d后的成骨基因，發(fā)現(xiàn)A-hPDLSCs組ALP、BSP、Runx-2基因表達(dá)均低于N-hPDLSCs組（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4）。誘導(dǎo)7 d后Wnt經(jīng)典通路相關(guān)基因：N-hPDLSCs組DKK-1明顯上調(diào)，β-catenin表達(dá)下調(diào)，而A-hPDLSCs組DKK-1表達(dá)低于N-hPDLSCs組，β-catenin表達(dá)高于N-PDLSCs組（P＜0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4）。

圖4 成骨誘導(dǎo)前后N-hPDLSCs組和A-hPDLSCs組ALP、BSP、Runx-2、DKK-1、β-catenin基因的比較Fig 4 The expression levels of ALP, BSP, Runx-2, β-catenin and DKK-1 between N-hPDLSCs and A-hPDLSCs before and after the osteogenic induction

2.5 Western blot比較成骨相關(guān)蛋白以及細(xì)胞核中βcatenin蛋白表達(dá)

成骨誘導(dǎo)前后N-hPDLSCs組和A-hPDLSCs組BSP、Runx-2和β-catenin的表達(dá)見圖5。

圖5 成骨誘導(dǎo)前后N-hPDLSCs組和A-hPDLSCs組BSP、Runx-2和β-catenin的表達(dá)Fig 5 Expression of BSP, Runx-2, β-catenin between N-hPDLSCs and A-hPDLSCs before and after the osteogenic induction

圖5結(jié)果顯示，A-hPDLSCs組骨相關(guān)蛋白表達(dá)都弱于N-hPDLSCs組，N-hPDLSCs組在成骨誘導(dǎo)后細(xì)胞核中的β-catenin表達(dá)明顯地減弱，成骨誘導(dǎo)后A-hPDLSCs組β-catenin的表達(dá)明顯高于N-hPDLSCs組。

3 討論

hPDLSCs是具有自我更新和多向分化潛能，在維持牙周結(jié)構(gòu)穩(wěn)態(tài)方面起著重要的作用，牙周組織再生中最直接、最可靠、最不可缺少的干細(xì)胞，具備向其他類型組織細(xì)胞分化的潛能，當(dāng)牙周組織受到損傷后，牙槽骨缺失，hPDLSCs會(huì)遷移并且分化為成骨細(xì)胞修復(fù)牙槽骨的缺損[6]。研究[7-9]顯示，在體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件下，hPDLSCs能分化為成骨樣細(xì)胞，形成鈣化結(jié)節(jié)，表達(dá)一些成骨相關(guān)蛋白：骨鈣素、骨橋素、膠原等。

對(duì)于糖尿病患者，其AGEs是不斷積累的，在前期的研究結(jié)果中表明AGEs能夠在一定濃度上抑制hPDLSCs的成骨分化，并且100 μg·mL-1AGEs刺激該細(xì)胞能使該細(xì)胞增殖過(guò)程中的Wnt經(jīng)典信號(hào)通路受到抑制，為了研究骨分化過(guò)程中的信號(hào)通路不受到細(xì)胞增殖方面的干擾，本實(shí)驗(yàn)選擇10 μg·mL-1AGEs濃度刺激該細(xì)胞，首先確認(rèn)10 μg·mL-1AGEs對(duì)該細(xì)胞成骨能力的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示體外成骨誘導(dǎo)1周后的ALP染色，A-hPDLSCs組的染色明顯淺于N-hPDLSCs組，并且在誘導(dǎo)3周后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行礦化結(jié)節(jié)染色，鏡下觀察可見，礦化結(jié)節(jié)在同一個(gè)視野下，N-hPDLSCs組礦化結(jié)節(jié)形成較多且很明顯，而A-hPDLSCs組形成的結(jié)節(jié)偏少。最后進(jìn)行定量分析，得到的結(jié)果也是A-hPDLSCs組形成的礦化結(jié)節(jié)少于N-hPDLSCs組細(xì)胞；其次，本實(shí)驗(yàn)在成骨誘導(dǎo)7 d后檢測(cè)成骨基因ALP、Runx-2、BSP結(jié)果顯示，2組細(xì)胞在加了成骨誘導(dǎo)液后，成骨基因表達(dá)都有所上升，但A-hPDLSCs組成骨基因表達(dá)上調(diào)不明顯，與N-hPDLSCs組相比較明顯偏低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這種趨勢(shì)與成骨能力表象的比較相一致。故在10 μg·mL-1AGEs刺激下，hPDLSCs成骨的能力下調(diào)。

各信號(hào)通路之間的相互作用決定著干細(xì)胞的命運(yùn)和組織再生，其中的Wnt經(jīng)典信號(hào)通路研究較成熟，該通路由分泌型的Wnt蛋白與卷軸受體結(jié)合而起始，最終導(dǎo)致β-catenin在胞漿中穩(wěn)定積累并大量進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)激活淋巴增強(qiáng)因子（lymphoidenchancer factor，LEF）/ T細(xì)胞因子（T-cell factor，TCF）轉(zhuǎn)錄因子，激活了該通路，啟動(dòng)靶基因轉(zhuǎn)錄[10]。故本實(shí)驗(yàn)主要檢查該通路里細(xì)胞核中的β-catenin以確定該信號(hào)通路的狀態(tài)。

Wnt信號(hào)通路在不同類型、不同分化階段中的干細(xì)胞作用是不相同的，該信號(hào)通路中相關(guān)因子的相互作用調(diào)控著該條通路的開啟和關(guān)閉，最終以達(dá)到調(diào)節(jié)干細(xì)胞中相關(guān)的基因，從而調(diào)控細(xì)胞的形態(tài)及決定其分化的能力。有研究發(fā)現(xiàn)Wnt經(jīng)典信號(hào)通路的激活可以促進(jìn)成骨：LRP5（是Wnt經(jīng)典通路通路中主要相關(guān)因子）的功能喪失性突變，造成Wnt經(jīng)典信號(hào)通路的抑制，最終導(dǎo)致骨質(zhì)密度降低，而功能獲得性突變使得Wnt經(jīng)典信號(hào)通路激活則會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)密度增高癥[11]；sFRP1基因缺陷的小鼠表現(xiàn)為Wnt信號(hào)通路的激活和骨量增多，在其骨骼中，TCF1、Runx-2和骨鈣素表達(dá)明顯增多[12]。相反也有研究[13]表明Wnt經(jīng)典通路的激活也可以抑制成骨：通過(guò)在含有Wnt3a無(wú)血清條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)或表達(dá)Wnt1的慢病毒載體轉(zhuǎn)染，激活了通路，最終人骨髓間充質(zhì)細(xì)胞（human mesenchymal stem cells，hMSCs）的骨向分化受到抑制、細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)；Derfoul等[14]通過(guò)基因轉(zhuǎn)染使鼠胚胎間充質(zhì)系C3HIOTl/2表達(dá)Wnt3a，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Wnt3a能顯著抑制其他成骨的標(biāo)志基因如BSP、骨橋蛋白基因的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)主要檢測(cè)該通路中的主要抑制因子DKK-1基因表達(dá)和βcatenin（其中包括β-catenin基因表達(dá)及單獨(dú)提取細(xì)胞核中的β-catenin蛋白的表達(dá)），通過(guò)比較該2個(gè)因子在正常hPDLSCs成骨誘導(dǎo)前后的變化以及誘導(dǎo)后N-hPDLSCs組與A-hPDLSCs組的區(qū)別，來(lái)探討AGEs刺激下，hPDLSCs骨分化過(guò)程中的Wnt經(jīng)典通路是否受到影響。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示對(duì)于正常hPDLSCs而言，成骨誘導(dǎo)后DKK-1基因表達(dá)明顯上調(diào)，βcatenin基因表達(dá)下調(diào)，并且核蛋白里的β-catenin蛋白表達(dá)下調(diào)，可以確定Wnt通路處于抑制狀態(tài)，故可以推斷正常牙周膜干細(xì)胞在向成骨分化的過(guò)程中Wnt經(jīng)典通路是受到了一定程度的抑制。通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)后的正常組與AGEs刺激組比較，由于AGEs的刺激，抑制因子DKK-1基因表達(dá)降低，β-catenin基因表達(dá)明顯升高，并且細(xì)胞核中的β-catenin蛋白表達(dá)升高，得到AGEs激活了的Wnt經(jīng)典通路，這與正常的hPDLSCs骨分化過(guò)程中Wnt經(jīng)典通路的抑制狀態(tài)相反。

綜上所述，AGEs能改變正常hPDLSCs骨分化過(guò)程中的Wnt經(jīng)典通路，使該通路處于激活狀態(tài)；AGEs抑制了hPDLSCs成骨分化。而AGEs是否通過(guò)激活Wnt經(jīng)典通路影響hPDLSCs的骨分化能力，還需要大量的實(shí)驗(yàn)研究。

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