七氟醚預處理對體外循環(huán)下行心臟直視手術(shù)患者血特異性m iRNA-1的影響

段曉霞，張代英，毛安瓊，龍 翔，王曉斌

（瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院麻醉科，四川瀘州646000）

七氟醚預處理對體外循環(huán)下行心臟直視手術(shù)患者血特異性m iRNA-1的影響

段曉霞，張代英，毛安瓊，龍 翔，王曉斌

（瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院麻醉科，四川瀘州646000）

目的 探討七氟醚預處理對體外循環(huán)（CPB）手術(shù)患者圍術(shù)期血心肌特異性miRNA-1（miR-1）表達水平

甲醚類； 體外循環(huán)； 心肌缺血； 微RNAs； 心臟外科手術(shù)

隨著麻醉技術(shù)、深低溫體外循環(huán)（CPB）技術(shù)等的開展，通過CPB手術(shù)改善心臟功能、提高生活質(zhì)量的患者正日益增加。但是CPB下行心臟直視手術(shù)常伴心肌缺血損害，這在一定程度上影響手術(shù)治療患者的遠期生存率[1]。目前常用評價心肌損害程度的指標有：cTnI、CKMB。然而這2項指標在特異度、靈敏度方面都有一定的缺陷，且本課題組的前期研究也證實，cTnI、CK-MB可反映CPB下心臟直視手術(shù)患者實時心肌損害，但不能反映心肌累積損傷程度，而miR-1是反映CPB下心臟直視手術(shù)患者心肌缺血再灌注期間累積損傷程度的生物學標志[1]，從而彌補了心肌酶學指標的這一缺陷。據(jù)報道，七氟醚預處理能減少CPB圍術(shù)期血cTnI、CK-MB的釋放[2]，保護心??；但七氟醚是否會影響該類患者血miR-1的表達、不同濃度的七氟醚影響程度是否不同，目前國內(nèi)外鮮見相關(guān)報道。因此，本研究擬探討七氟醚預處理對CPB下心臟直視手術(shù)患者圍術(shù)期血miR-1表達水平的影響[3]，分析血miR-1表達水平的變化與七氟醚預處理濃度的相關(guān)性，進一步闡明七氟醚預防圍術(shù)期心肌缺血損傷的機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2013年10月至2014年6月本院胸心外科擬行CPB下心臟直視手術(shù)的患者；由醫(yī)學倫理委員會批準，簽署患者知情協(xié)議書，術(shù)前檢查血心肌酶學和血氣分析值均正常的40例患者納入研究。拒絕納入研究的患者；術(shù)前血心肌酶學和血氣分析值明顯升高；術(shù)中或術(shù)后6 h內(nèi)死亡者排除本研究。應用SPSS19.0隨機數(shù)字生成模塊，將納入對象隨機分為兩組，每組20例。A組行七氟醚預處理；B組給予常規(guī)CPB麻醉。兩組患者均采用芬太尼為主的常規(guī)全憑靜脈麻醉（TIVA）。常規(guī)檢測患者各項生命體征、用藥情況。

1.2 方法

1.2.1 標本收集和處理 收集兩組患者術(shù)前5min、術(shù)中（術(shù)后魚精蛋白拮抗肝素后5min）和術(shù)后6 h血標本。離心后，去血清于-80℃保存，以備用于用miR-1的檢測血。

1.2.2 標本檢測方法 首先分離RNA，然后使用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應檢測血清中miR-1的含量。使用德國Effdenf公司的微量移液泵取200μL每孔的血清標本，按1∶3比例，將標本與美國Invitrogen公司的TRIzol LS混合，充分振蕩30～40 s。然后使用德國Qiagen公司的miRNA抽提試劑盒，按照操作說明將RNA分離。使用美國ABI公司提供的miR-1特異引物，引物編碼為5-GT-CGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTC GGCAATTGCACTGGATACGACTACATAC-3，加樣完成后，將樣本放入美國Bio-Rad公司生產(chǎn)的Bio-Rad生物分析儀，并檢測miR-1的閾循環(huán)值（CT）。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以±s表示，采用非成對t檢驗對資料進行統(tǒng)計評價，使用線性相關(guān)回歸分析七氟醚濃度與血miR-1的關(guān)系。本次研究主要使用獨立樣本t檢驗，按照，檢驗水準α=0.05，功效1-β=0.8、 Cohen′s d=1。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 納入患者術(shù)前心肌酶學指標和血氣分析結(jié)果均未見明顯異常，兩組患者術(shù)前性別、手術(shù)類型等相關(guān)情況比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.2 兩組患者升主動脈阻斷時間、各時間點平均動脈壓比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.3 兩組患者術(shù)中和術(shù)后6 h血miR-1含量明顯高于術(shù)前，且B組患者含量均明顯高于同時間點A組患者，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1、圖1。

表1 兩組患者不同時間點血m iR-1Ct值、相差倍數(shù)情況比較

圖1 患者不同時間點血m iR-1 PCR循環(huán)情況

2.4 七氟醚預處理濃度與術(shù)中及術(shù)后6 h血miR-1升高的倍數(shù)呈負相關(guān)（r=-0.41、-0.81，P＜0.05）。見圖2、表2。

圖2 七氟醚濃度與各時間點m iR-1升高倍數(shù)的相關(guān)性

表2 手術(shù)前后不同七氟醚預處理濃度m iR-1升高的倍數(shù)（±s）

表2 手術(shù)前后不同七氟醚預處理濃度m iR-1升高的倍數(shù)（±s）

七氟醚濃度（％）時間術(shù)中術(shù)后6 h 0.25 10.2±3.2 36.2±7.6 0.50 8.2±2.4 30.2±6.5 1.00 7.1±1.8 24.8±7.7 1.50 5.7±1.1 21.0±8.0 2.00 4.9±1.2 18.1±4.2時間 七氟醚濃度（％）術(shù)中術(shù)后6 h 2.50 3.9±0.8 12.3±4.2 3.00 1.9±0.8 8.9±2.1 3.50 1.1±0.8 7.2±1.5 4.00 0.9±0.1 6.7±2.1

3 討 論

CPB下心臟直視手術(shù)是治療各類心臟疾病的有效措施，常伴心肌缺血損害，目前評價心肌損害程度的指標常用的有血cTnI、CK-MB，然而這2個指標在特異度、靈敏度方面都有一定的缺陷，且作者前期研究也證實血cTnI、CK-MB可反映CPB下手術(shù)患者實時的心肌損害，而不能反映心肌累積損傷程度，而血miR-1是反映CPB下手術(shù)患者心肌缺血再灌注期間累積損傷程度的生物學標志[1]，從而彌補了心肌酶學指標的這一缺陷。

Landoni等[3]證實吸入麻醉藥具有獨特的心肌保護作用，其機制類似于心肌缺血性預處理，由此開辟了吸入麻醉研究的新領(lǐng)域，即臟器保護。研究證實，七氟醚預處理可縮小狗心肌缺血模型的心肌梗死面積[4]、減少CPB下手術(shù)患者或非心臟手術(shù)的冠心病患者圍術(shù)期心肌損傷標志物的釋放[5]、縮小冠心病患者心肌梗死面積、迅速恢復心臟泵血功能，但機制尚不清楚[6]。七氟醚對CPB下行冠狀動脈搭橋術(shù)患者的心肌保護作用是確切的，而在其他瓣膜手術(shù)中雖不能減少cTnI的釋放[7-8]，但可以改善手術(shù)患者的預后，這進一步說明七氟醚對CPB下手術(shù)患者的心肌有保護作用，而尋找一種更為敏感、特異性更強的指標來反映七氟醚對心肌的作用是一個值得探討的問題。

miRNAs是細胞內(nèi)的內(nèi)源性、小的、非編碼的RNAs，其通過切割或抑制mRNA。miRNAs通過翻譯mRNA對相應靶目標蛋白表達進行負反饋調(diào)控[2-3]。正常發(fā)育、生理和疾病狀態(tài)中，miRNAs是十分重要的調(diào)節(jié)因子[4-6]。相關(guān)研究表明，大多數(shù)疾病組織中都有miRNAs異常表達，而且不同的疾病其miRNAs表達種類是不一樣的，甚至某些miRNAs是某些疾病特有的[7-8]。健康人或動物的心肌和骨骼肌組織中miR-1的含量較高，而在心臟相關(guān)疾病組織中miR-1含量會進一步升高，但在其他如動脈、肺、腎等組織中含量很低[9]。作者前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-208a僅能在心肌組織中檢測到[10]。因此，組織中相應的特異性miRNA可作為診斷組織疾病的生物學標志之一；但在實際臨床工作中一般不易獲得活體疾病組織，臨床上一般都是通過采集外周體液來解決相關(guān)問題。前期研究發(fā)現(xiàn)，急性心肌梗死患者的miR-1能釋放進入血液循環(huán)，并在外周血中可檢測到，其含量明顯高于健康人，并證實miR-1是診斷臨床急性心肌梗死的生物學指標[9]，同時作者還證實血miR-1是反映CPB下手術(shù)患者心肌缺血再灌注期間累積損傷程度的生物學標志。遺憾的是，到現(xiàn)在為止，外周血中miR-1在心肌缺血再灌注損傷中的作用機制不是十分清楚，其診斷價值也有待進一步探討，miR-1的含量是否像cTnI、CK-MB受吸入麻醉藥預處理等作用的影響也未明了，七氟醚對心肌的保護有目共睹，因此本研究選擇七氟醚預處理來探尋吸入麻醉藥預處理和miR-1間可能的作用。

據(jù)報道，從麻醉誘導起到CPB下心臟停搏、麻醉機停機前吸入最低肺泡有效濃度（MAC）為0.25％～4.00％的七氟醚能減少圍術(shù)期血cTnI、CK-MB的釋放[1]，保護心??；本研究意在通過七氟醚預處理后，檢測CPB下心臟直視手術(shù)患者圍術(shù)期血miR-1表達水平的變化，驗證miR-1能否作為評價七氟醚預處理后心肌保護作用的指標，從分子生物學角度進一步闡明七氟醚預防圍術(shù)期心肌缺血損傷的機制，從而開拓七氟醚在臨床應用中的又一路徑，為心肌保護的研究開辟一個新思路、新領(lǐng)域。本研究結(jié)果顯示，兩組患者術(shù)中、CPB結(jié)束后6 h，2個時間點血miR-1含量明顯高于術(shù)前，與A組患者比較，同時間點B組患者含量顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），七氟醚預處理濃度與術(shù)中及術(shù)后6 h血miR-1升高的倍數(shù)呈負相關(guān)（r=-0.41、-0.81，P＜0.05）。說明七氟醚預處理不但可以降低心肌酶學指標的含量還可降低血miR-1含量，因此作者可以推斷七氟醚不但可以減輕CPB下手術(shù)對心肌的實時損傷，還能減輕CPB期間心肌累積損傷，這為改進麻醉方法、提高CPB患者生活質(zhì)量開辟了新的途徑。

通過檢查CPB手術(shù)圍術(shù)期3個時間點血中心肌特異性miR-1的含量情況分析，結(jié)果表明，使用七氟醚預處理的A組血miR-1較術(shù)前升高的倍數(shù)為8～32倍，而對照組B組血miR-1較術(shù)前升高的倍數(shù)為16～64倍，以上結(jié)果一方面再次證實作者前期研究認為“血miR-1可作為判斷心肌缺血再灌注損傷的指標”的合理性，另一方面說明使用七氟醚預處理后血miR-1的含量明顯較低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）[1，9-10]。同時本研究發(fā)現(xiàn)，七氟醚預處理濃度與術(shù)中及術(shù)后6 h血miR-1升高的倍數(shù)呈負相關(guān)（r=-0.41、-0.81，P＜0.05），從圖2中作者發(fā)現(xiàn)，當七氟醚預處理濃度在3％～4％時其相應miR-1下降不如濃度在0.25％～3.00％時明顯，說明在一定濃度范圍內(nèi)七氟醚預處理濃度越高術(shù)中及術(shù)后6 h血miR-1升高倍數(shù)越小，而盲目加大七氟醚的濃度可能不會改善心肌缺血情況[9-10]。

總之，七氟醚預處理可降低血miR-1含量，減輕CPB期間心肌累積損傷，且在一定濃度范圍內(nèi)七氟醚預處理濃度越高術(shù)中及術(shù)后6 h血miR-1升高倍數(shù)越小。

[1]Zhou X，Mao A，Wang X，et al.Urine and serum microRNA-1 as novel biomarkers formyocardical injury in open-heartsurgerieswith cardiopulmonary bypass[J].PLoSOne，2013，8（4）：e62245.

[2]Fleisher LA，Beckman JA，Brown KA，etal.ACC/AHA 2007Guidelines on Perioperative Cardiovascular Evaluation and Care for Noncardiac Surgery：Executive Summary：A Reportof the American College of Cardiology/ American Heart Association Task Force on Practice Guidelines（Writing Committee to Revise the2002Guidelineson PerioperativeCardiovascular Evaluation for Noncardiac Surgery）Developed in CollaborationWith the American Society of Echocardiography，American Society of Nuclear Cardiology，Heart Rhythm Society，Society of Cardiovascular Anesthesiologists，Society for Cardiovascular Angiography and Interventions，Society for VascularMedicineand Biology，and Society for Vascular Surgery[J].J Am CollCardiol，2007，50（17）：1707-1732.

[3]Landoni G，F(xiàn)ochi O，Tritapepe L，et al.Cardiac protection by volatile anesthetics.A review[J].Minerva Anestesiol，2009，75（5）：269-273.

[4]Zhang C.MicroRNomics：anewly emergingapproach for disease biology[J]. PhysiolGenomics，2008，33（2）：139-147.

[5]Cheng Y，Tan N，Yang J，etal.A translationalstudy of circulating cellfree microRNA-1 in acutemyocardial infarction[J].Clin Sci（Lond），2010，119（2）：87-95.

[6]Huffmyer J，Raphael J.Physiology and pharmacology ofmyocardial preconditioning and postconditioning[J].Semin Cardiothorac Vasc Anesth，2009，13（1）：5-18.

[7]DeHertS，VlasselaersD，BarbéR，etal.A comparison ofvolatileand non volatile agents for cardioprection during onpump coronary surgery[J]. Anaesthesia，2009，64（9）：953-960.

[8]何蘭，唐中，張國元，等．心肌挫傷患者血清心肌標志物變化分析[J].臨床心血管病雜志，2005，21（1）：17-18．

[9]Cheng Y，Wang X，Yang J，etal.A translationalstudyofurinemiRNAs in acutemyocardical infarction[J].JMol Cell Cardiol，2012，53（5）：668-676.

[10]段曉霞，周賢，王曉斌，等.心肌組織特異性微小RNA-1在ST段抬高型急性心肌梗死患者尿中含量的變化研究[J].中國危重病急救醫(yī)學，2012，24（12）：709-712.

Effect on specificm iRNA-1 in pretreatmentw ith sevoflurane for patients accepted the intracardiac surgery under cardiopulmonary bypass

Duan Xiaoxia，Zhang Daiying，Mao Anqiong，Long Xiang，Wang Xiaobin
（DepartmentofAnesthesiology，the Affiliated Hospitalof Luzhou MedicalCollege，Luzhou，Sichuan 646000，China）

Objective To approach the effectofexpression levelon specificmicroRNA-1（miR-1）in pretreatmentwith sevoflurane forpatientsaccepted the intracardiac surgery undercardiopulmonarybypass（CPB）and analyze the correlation between sevoflurane concentration andmiR-1 level to set forth themechanism of prevention from perioperativemyocardial ischemia injury with sevoflurane further.M ethods A total of 40 patients planned to have intracardiac surgery under CPB from October 2013 to June2014weredivided into twogroups.Group A（20 cases）was treatedwith sevoflurane in advanceand group Bwith routine CPB anesthesia.The blood samples at the time of preoperative 5minutes，during the operation（protamine-against-heparin 5min after the operation）and postoperative 6 hourswere collected by the two groups.It isadopted real-time fluoresence quantitative polymerase chain reaction to testserum miR-1 contentatvarious time.Results The serum miR-1 contents during the operation and 6 h after CPB operation were significantly higher than those before the operation between the two groups.Compare with Group A at the same time，the serum miR-1 content in Group A was lower than thatofgroup B.The difference had statistical significance（P＜0.05）；ThemiR-1 levelsin group A had astrongnegative correlationwith the concentration ofsevoflurane（r=-0.41，-0.81，P＜0.05）.Conclusion Pretreatmentwith sevofluranemay decrease erum miR-1 content，relievemyocardial ischemia injury during the CPB.Under certain scope，the higher the pretreatmentconcentration with sevoflurane the smaller the serum miR-1 contentmultiplerduring the operation and 6 h after theoperation.

Methyethers； Extracorporealcirculation； Myocardialischemia； MicroRNAs； Cardiac surgicalprocedures

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.01.011

A

1009-5519（2015）01-0028-03

2014-08-30）

瀘州醫(yī)學院課題（2013ZRQN082）；瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院課題（14020）。

段曉霞（1981-），女，四川瀘州人，碩士研究生，主治醫(yī)師，主要從事臨床麻醉工作；E-mail：782348971@qq.com。

的影響，分析七氟醚濃度和miR-1表達水平變化的相關(guān)性，進一步闡明七氟醚預防圍術(shù)期心肌缺血損傷的機制。方法

將2013年10月至2014年6月該院胸心外科擬在CPB下行心臟直視手術(shù)的40例患者隨機分為A、B兩組。A組20例行七氟醚預處理；B組20例行常規(guī)CPB麻醉。抽取兩組患者術(shù)前5min、術(shù)中（術(shù)后魚精蛋白拮抗肝素后5min）和術(shù)后6 h血液標本，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應方法檢測不同時間點血miR-1含量。結(jié)果 兩組患者術(shù)中、術(shù)后6 h血液標本中miR-1含量明顯高于術(shù)前，且相應時間點A組患者血miR-1含量低于與B組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；七氟醚預處理濃度與術(shù)中及術(shù)后6 h血miR-1升高的倍數(shù)呈負相關(guān) （r=-0.41、-0.81，P＜0.05）。結(jié)論 七氟醚預處理可降低血miR-1含量，減輕CPB期間心肌累積損傷，且在一定濃度范圍內(nèi)七氟醚預處理濃度越高，術(shù)中及術(shù)后6 h血miR-1含量升高倍數(shù)越小。