三種柱前衍生化法測(cè)定乳粉中?；撬岷康姆椒ū容^

袁輝，高帥，王傳興

（新疆產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，烏魯木齊830011）

0 引言

?；撬崾且环N特殊的氨基酸，除了具有促進(jìn)大腦及智力發(fā)育，保護(hù)視網(wǎng)膜的作用[1-4]，對(duì)肺、肝臟、胃腸等都有保護(hù)作用[5-6]。?；撬釋?duì)嬰幼兒大腦發(fā)育、神經(jīng)傳導(dǎo)、視覺機(jī)能的完善、鈣的吸收有良好作用，是一種對(duì)嬰兒生長(zhǎng)發(fā)育重要的營養(yǎng)素[7]，國家標(biāo)準(zhǔn)中要求嬰幼兒配方乳粉中?；撬岬奶砑恿考s為3 mg/100kJ[8-9]。

目前，檢測(cè)?；撬岬姆椒ㄖ饕獮橐合嗌V的柱前衍生和柱后衍生兩類，柱后衍生需要的裝置較為昂貴，具有一定局限性。柱前衍生法有鄰苯二甲醛（OPA）衍生法[10-12]、單磺酰氯衍生法[13-14]、2，4-二硝基氟苯（DNFB）衍生法[15-16]以及9-氯甲酸芴甲酯(FMOC)衍生法[17]等。本研究選取了三種衍生試劑，利用柱前衍生法分別進(jìn)行乳粉中?；撬岬臏y(cè)定，同時(shí)進(jìn)行方法比較，最終取得了滿意的結(jié)果。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 主要儀器

waters 2695高效液相色譜儀，紫外檢測(cè)器，離心機(jī)，恒溫水浴鍋，超聲波儀。

1.2 試劑和材料

?；撬針?biāo)準(zhǔn)品sigma公司、單磺酰氯、9-氯甲酸芴甲酯(FMOC)、鄰苯二甲醛（OPA）、乙酸銨、甲醇、乙腈、乙硫醇為色譜純，亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、無水碳酸鈉、鹽酸、鹽酸甲胺、硼酸、氫氧化鈉為分析純。

配方乳粉，購于烏魯木齊某超市。

2 方法

2.1 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取樣品2.00 g，用40 mL溫水溶解并超聲10 min，加入蛋白沉淀劑各1 mL，用水定容至50 mL。試液于5000轉(zhuǎn)/分鐘下離心10 min，取上清液備用。

2.2 牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的的配制

精確稱取0.025 g?；撬針?biāo)準(zhǔn)品，用蒸餾水溶解后定容至25 mL，配成質(zhì)量濃度為1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，臨用前配制成質(zhì)量濃度為0，5，10，20，40，100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2.3 單磺酰氯柱前衍生化法

2.3.1 主要試劑的配制

濃度為80 mmol/L碳酸鈉緩沖溶液：0.424 g無水碳酸鈉，加入40 mL水溶解，用濃度為1 mol/L鹽酸調(diào)pH值至9.5，用水定容50 mL。質(zhì)量濃度為1.5 g/L單磺酰氯溶液：稱取0.15 g用乙腈定容100 mL，臨用前配制。質(zhì)量濃度為20 g/L鹽酸甲胺溶液：稱取2 g用水定容100 mL，

2.3.2 衍生化方法

吸取2.1中的上清液1 mL到10 mL具塞玻璃管中，加入1 mL碳酸鈉緩沖液，1 mL丹磺酰氯溶液，充分混合，室溫避光衍生反應(yīng)2 h（1 h后需搖晃1次），加入0.1 mL鹽酸甲胺溶液渦旋混合，以終止反應(yīng)，避光靜置至沉淀完全。取上清液過濾，取濾液備用。同時(shí)取2.2中標(biāo)準(zhǔn)工作液1 mL與試液同步進(jìn)行衍生。

2.3.3 色譜條件

色譜柱：Hypersil BDS C18柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇∶濃度為0.02 mol/L乙酸銨緩沖溶液（pH=4）=60∶40（體積比），流速1 mL/min，柱溫為30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)（紫外檢測(cè)器）為254 nm。

2.4 FMOC柱前衍生化法

2.4.1 主要試劑的配制

0.3 mol/L硼酸鹽緩沖溶液：稱取1.85 g硼酸，用濃度為6 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)至pH值為8.0，用水定容至100 mL。質(zhì)量濃度為1.5 g/L的FMOC溶液：稱取0.015 g的FMOC溶于10 mL乙腈中。

2.4.2 衍生化方法

吸取2.1中的上清液100 μL,加400 μL FMOC 溶液及400 μL硼酸鹽緩沖溶液，用乙腈定容至1 mL，超聲震蕩3 min，40度水浴反應(yīng)10 min，上機(jī)測(cè)試。同時(shí)取2.2中標(biāo)準(zhǔn)工作液各100 μL與試液同步進(jìn)行衍生。

2.4.3 色譜條件

色譜柱：Hypersil BDS C18柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇∶濃度0.02 mol/L乙酸銨緩沖溶液（pH=4）=60∶40（體積比），流速1 mL/min，

柱溫為30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為265 nm。

2.5 OPA柱前衍生化法

2.5.1 主要試劑的配制

濃度為0.4mol/L硼酸鈉緩沖溶液配制：稱取2.48 g硼酸和1.41 g氫氧化鈉，用水定容到100 mL；OPA衍生劑溶液：取0.05 g的OPA，用2 mL甲醇溶解，加入50 μ L乙硫醇，用濃度為0.4 mol/L硼酸鈉緩沖溶液定容至10 mL，4℃避光保存。

2.5.2 衍生化方法

用自動(dòng)進(jìn)樣器設(shè)定柱前衍生程序，吸取樣液10 μL再吸取10 μL衍生試劑混合，延時(shí)2 min后進(jìn)樣。

2.5.3 色譜條件

色譜柱：Hypersil BDS C18柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇∶濃度為0.02 mol/L的乙酸銨緩沖溶液（pH=4）=65∶35（體積比），流速1 mL/min，柱溫為30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)（紫外檢測(cè)器）為330 nm。

2.6 精密度與穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

稱取3份配方乳粉，分別按照2.1，2.3，2.4和2.5的方法處理，并按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定其峰面積，計(jì)算樣品中牛磺酸的質(zhì)量濃度，得到三種不同衍生方法的6次測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。同時(shí)，將2.3.2與2.4.2的最終衍生樣品于4℃避光保存，每隔8 h進(jìn)樣一次（10 μL），觀察測(cè)定時(shí)間對(duì)測(cè)定穩(wěn)定性的影響。

2.7 回收率實(shí)驗(yàn)

移取3份已知?；撬豳|(zhì)量濃度的配方乳粉，分別加入0.25，1，2 mg?；撬針?biāo)準(zhǔn)工作液，根據(jù)2.1進(jìn)行前處理，得到低、中、高3種濃度的?；撬峄旌弦海俑鶕?jù)2.3.2，2.4.2與2.5.2的步驟進(jìn)行衍生并進(jìn)行測(cè)定分析。用外標(biāo)法計(jì)算測(cè)定值，通過比較測(cè)定值與理論值，分別計(jì)算3種柱前衍生方法的回收率。

3 結(jié)果與分析

3.1 樣品前處理的方法選擇

因乳粉中含有大量的蛋白質(zhì)及脂肪，若不在衍生化前除去，不僅會(huì)堵塞色譜柱，而且會(huì)影響色譜分離效果。沉降蛋白的方法一是使用蛋白沉淀劑，另一種就是使用有機(jī)溶劑如甲醇、乙腈等沉降蛋白。本研究稱取奶粉2 g溶解后加蛋白沉淀劑各1 mL，并定容至50 mL，處理樣品進(jìn)行衍生化反應(yīng)并經(jīng)檢測(cè)，色譜峰峰型較好，干擾少。通過樣品的加標(biāo)回收率可以看出，?；撬嵩谇疤幚磉^程中損失較小。故本研究在處理配方乳粉時(shí)選擇蛋白沉淀劑沉降蛋白。

3.2 流動(dòng)相緩沖溶液pH值的選擇

調(diào)節(jié)濃度為0.02 mol/L乙酸銨溶液的不同pH值作為緩沖溶液，分別與甲醇組成流動(dòng)相。結(jié)果表面，在pH值在4.0時(shí)，?；撬嵫苌a(chǎn)物的峰形尖銳且無拖尾，故選擇流動(dòng)相中緩沖溶液的pH值為4.0。圖1～圖3為三種不同柱前衍生方法所獲得的色譜圖。由圖1～圖3可以看出，三種衍生方法在此流動(dòng)相條件下，均能夠得到較好的分離，且峰型對(duì)稱無拖尾。

3.3 線性關(guān)系及檢出限

按照2.3.3，2.4.3及2.5.3節(jié)條件下進(jìn)行采集數(shù)據(jù)，分別以標(biāo)準(zhǔn)峰面積對(duì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度進(jìn)行線性回歸，得到?；撬針?biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍以及檢出限，如表1所示。由表1可以看出，通過三種不同柱前衍生方法，?；撬嵩?～100 mg/L范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.998，檢出限（S/N=3）最低為0.3 mg/L。

3.4 實(shí)驗(yàn)方法的精密度與穩(wěn)定性

按照2.6，分別得到三種柱前衍生方法的連續(xù)6次峰面積測(cè)定結(jié)果，其RSD分別為1.30%，0.84%，0.62%，表明精密度良好。單磺酰氯法和FMOC衍生化后的樣品在衍生后的0，8，16，24，36，48 h進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，RSD分別為1.09%和1.20%，表明單磺酰氯法和FMOC法衍生化后的樣品在4℃避光保存的條件下48 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.5 回收率實(shí)驗(yàn)

圖2 FMOC法衍生化色譜

由表2可以看出，三種柱前衍生法的高、中、低加標(biāo)回收率以及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，OPA柱前衍生法的三個(gè)水平加標(biāo)回收率雖然不是最高，但是其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于1%，主要是由于OPA柱前衍生法使用儀器編制程序進(jìn)行衍生并測(cè)定，在樣品量和時(shí)間上都較其他兩種手工操作的方法更為精準(zhǔn)，但是三種方法的回收率都達(dá)到94%以上，且各自的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3%，說明三種柱前衍生法都能夠很好的測(cè)定樣品中?；撬岬馁|(zhì)量濃度。

圖3 OPA法衍生化色譜

表1 三種不同柱前衍生方法所得?；撬岬木€性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍以及檢出限

4 結(jié)果與討論

（1）本研究選取了三種常用的衍生試劑單磺酰氯、FMOC、OPA，分別對(duì)配方乳粉中的?；撬徇M(jìn)行柱前衍生并進(jìn)行測(cè)定，良好的分離度以及回收率、穩(wěn)定性等表明柱前衍生完全能夠達(dá)到配方乳粉中?；撬岬臋z測(cè)要求，相比需要昂貴柱后衍生裝置的柱后衍生法而言，柱前衍生法更為經(jīng)濟(jì)適用，使用范圍更為廣泛。

（2）三種柱前衍生法，其中OPA衍生樣液對(duì)于衍生化時(shí)間要求比較嚴(yán)格，需在2 min內(nèi)進(jìn)樣測(cè)試，而相對(duì)于FMOC、單磺酰氯的衍生樣品，在4℃避光保存條件下48 h內(nèi)穩(wěn)定，測(cè)定時(shí)間范圍更為寬松。

（3）三種柱前衍生法的前處理都比較簡(jiǎn)單，除了單磺酰氯衍生法需要2個(gè)小時(shí)的衍生時(shí)間，其余兩種方法的衍生化都非?？旖?，尤其是OPA柱前衍生法，不僅快捷，而且簡(jiǎn)單，只要利用自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)行程序設(shè)定，就能夠完成樣品衍生及測(cè)定，大大縮減了前處理過程并減小了人為操作的誤差。

表2 回收率測(cè)定結(jié)果

（4）本研究中三種柱前衍生測(cè)定配方乳粉中?；撬岬姆椒ú粌H準(zhǔn)確、快捷，而且經(jīng)濟(jì)、實(shí)用，其檢出限最低為單磺酰氯衍生法的0.3 mg/L，相對(duì)于柱后衍生的1 mg/L[7]的檢出限而言，三種柱前衍生法在靈敏度上均高于柱后衍生法；同時(shí)，三種柱前衍生法的平均回收率也都高于柱后衍生法的平均回收率95.6%[7]。

綜上所述，柱前衍生法有著不可替代的優(yōu)勢(shì)，完全能夠滿足配方乳粉中?；撬岬臋z測(cè)要求，檢測(cè)人員可以根據(jù)各自實(shí)驗(yàn)室條件和實(shí)驗(yàn)時(shí)間來選擇合適的柱前衍生化方法進(jìn)行?；撬岬臋z測(cè)。

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