俄羅斯卡爾梅克共和國(guó)酸奶油中乳酸菌的多樣性分析

張哲，徐海燕，于潔

（1呼和浩特市第二中學(xué)，呼和浩特010090，2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特010018）

0 引言

傳統(tǒng)食品的制作和食用已歷經(jīng)數(shù)千年，各個(gè)國(guó)家和民族幾乎都有自己獨(dú)特的傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品，因其品種豐富、味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高而備受世界各國(guó)人民的青睞。俄羅斯卡爾梅克人在制作傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品也有著豐富的經(jīng)驗(yàn)和悠久的歷史。俄羅斯卡爾梅克的傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品的種類(lèi)主要包括：酸奶，酸奶油，奶渣、奶酪、開(kāi)菲爾乳和馬奶酒等[1]。其中，酸奶油作為一種傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品，色澤乳白，風(fēng)味獨(dú)特，香濃可口，廣泛地被用于菜肴的烹飪和各類(lèi)糕點(diǎn)的烘焙，它使各式菜倄多了一種奶香味，地位非常重要，就像中菜的醬油[2]。

酸奶油制作主要是經(jīng)過(guò)乳酸菌的發(fā)酵過(guò)程實(shí)現(xiàn)的，其中蘊(yùn)含著豐富的乳酸菌資源。乳酸菌（Lactic acid bacteria,LAB）是一群形態(tài)代謝性能和生理學(xué)特征不完全相同的能發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生乳酸的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌總稱(chēng)[3]。由于乳酸菌具有改善腸道菌群、增強(qiáng)人體免疫力、抗腫瘤、降低血液膽固醇、降血壓等功能而呈現(xiàn)出極大的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值[4,5]。因此，隨著乳酸菌產(chǎn)業(yè)進(jìn)一步的發(fā)展，傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中的乳酸菌資源的開(kāi)發(fā)和群落結(jié)構(gòu)分析逐漸成為研究的熱點(diǎn)。

本研究以俄羅斯卡爾梅克共和國(guó)3個(gè)地區(qū)采集的6份酸奶油樣品為研究對(duì)象，采用MRS培養(yǎng)基來(lái)分離其中的乳酸菌，利用16S rRNA基因序列分析法對(duì)乳酸菌進(jìn)行分類(lèi)鑒定，依據(jù)乳酸菌種類(lèi)和數(shù)量分析酸奶油中的乳酸菌多樣性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源。

本試驗(yàn)所用的6份酸奶油樣品是由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的研究人員于2012年9月14日-2012年9月20日，在俄羅斯卡爾梅克共和國(guó)的3個(gè)地區(qū)采集到的。酸奶油樣品的具體信息見(jiàn)表1。

表1 俄羅斯卡爾梅克共和國(guó)地區(qū)酸奶油的來(lái)源及乳酸菌活菌數(shù)

1.1.2 主要試劑與儀器。

MRS固體培養(yǎng)基（DifcoTM Lactobacilli MRS Agar，BD），MRS肉湯培養(yǎng)基（Man Rogosa Sharpe broth，Oxide），EasyTaq DNA polymerase、dNTPs（每種2.5 mmol/L）等PCR試劑均購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司，引物均由上海桑尼生物科技有限公司合成；PCR基因擴(kuò)增儀（Applied Biosystems），Eppendorf 5810R冷凍離心機(jī)，CDS8000型UPV凝膠成像分析系統(tǒng)，ND-1000型微量紫外分光光度計(jì)等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集

先將容器中的酸奶油充分?jǐn)嚢?，用帶有滅菌吸頭的移液器吸取1.5 mL樣本放入裝有滅菌中和劑（淀粉/CaCO3，50：1，M/M）的無(wú)菌2.0 mL螺口凍存管中，混勻后用封口膜封口后標(biāo)記樣品號(hào)，放入4℃便攜式冰箱內(nèi)保持低溫度狀態(tài)，帶回實(shí)驗(yàn)室后，盡快進(jìn)行微生物組成分析和乳酸菌的分離的實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 酸奶油中乳酸菌活菌計(jì)數(shù)

采用傾注法對(duì)樣品中的乳酸菌進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。將樣品用漩渦振蕩器混勻后，吸取0.5 mL樣品于4.5 mL的滅菌生理鹽水（0.85%，w/w）中，以10倍稀釋法進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)? mL稀釋度為10-5、10-6、10-7的稀釋液置于塑料培養(yǎng)皿中（d=9 cm）中，立即倒入約20 mL含有10 ppm放線菌酮和硫酸多粘菌素的MRS固體培養(yǎng)基（溫度為70℃左右），迅速搖勻，待完全凝固后置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)48 h。

1.2.3 乳酸菌的分離

用滅菌槍頭吸取1.2.2中所述稀釋度為10-5、10-6、10-7的稀釋液各200μ L，分別涂布于MRS平板 培 養(yǎng) 基 上，厭氧條件下30℃培養(yǎng)48～72 h，菌落形成后觀察菌落形態(tài)，依據(jù)菌落大小、顏色、光澤度、凸起度等差異，將所有形態(tài)特征不同的菌落做標(biāo)記，并在無(wú)菌條件下將標(biāo)記好的菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中，30℃厭氧培養(yǎng)24 h。繼續(xù)傳代后挑取適量菌體進(jìn)行革蘭氏染色試驗(yàn)（涂片、固定、染色、脫色）和過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)。最終，將革蘭氏陽(yáng)性和過(guò)氧化氫酶陰性的無(wú)芽孢的桿狀或球狀的菌株保存用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 乳酸菌的鑒定

1.2.4.1 乳酸菌全基因組的提取。

采用液氮反復(fù)凍融-CTAB法提取分離株的基因組DNA,具體步驟參考見(jiàn)文獻(xiàn)[6]。將提取的基因組原液采用瓊脂糖凝膠電泳和微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其質(zhì)量和濃度。

1.2.4.2 乳酸菌16S rRNA基因擴(kuò)增。

將上述制備的基因組DNA作為模板采用50μ L體系進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增引物為：FA-27F：5-gcagagttctcggagtcacgaAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，RA-1495R：5-agcggatcacttcacacaggaCTACGGCTACCTTGTTACGA-3[7]。擴(kuò)增循環(huán)為：94℃ 5 min預(yù)變性；94℃ 1 min，58 ℃1 min，72 ℃2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，若PCR成功則在1500 bp左右可見(jiàn)清晰的條帶。

1.2.4.3 16S rRNA基因序列的測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建。

將PCR產(chǎn)物送到上海美吉生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，每株菌獲得兩條16S rRNA基因的序列，運(yùn)用DNAStar 6.1軟件包中的SeqMan軟件將其進(jìn)行拼接，最終獲得1300bp-1400bp的有效序列。利用NCBI（National Center for Biotechnology Information）中的 Blast軟件 BLAST（Basic Local Alignment Search Tool，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST），將測(cè)定的序列與GenBank/EMBL/DDBJ數(shù)據(jù)庫(kù)中已知分類(lèi)地位的乳酸菌16S rRNA基因序列進(jìn)行同源性比較。應(yīng)用軟件Mega 6.0中的Cluster W將模式菌株和所測(cè)菌株的16S rRNA基因序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，在此基礎(chǔ)上采用鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[8]。最后將所有測(cè)序菌株的16S rRNA基因序列上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸奶油中乳酸菌的活菌數(shù)及分離結(jié)果

俄羅斯卡爾梅克地區(qū)采集的6份酸奶油樣品中乳酸菌活菌數(shù)在7.30～8.62 lg cfu/mL間（見(jiàn)表1），均值為8.12±0.46 lg cfu/mL。這表明酸奶油中的乳酸菌資源較豐富。

根據(jù)菌落形態(tài)特征、革蘭氏染色和過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)，6份樣品中共分離到28株乳酸菌。菌株在MRS培養(yǎng)基上呈現(xiàn)出邊緣整齊或呈鋸齒狀、中央突起、表面光滑或粗糙的白色、褐色或透明菌落。革蘭氏染色后桿菌的細(xì)胞形態(tài)有粗短、粗長(zhǎng)、細(xì)長(zhǎng)、細(xì)短形，少量為彎曲狀；球菌為圓形或橢圓形，成對(duì)、鏈、簇狀球排列。

2.2 乳酸菌16S rRNA基因序列鑒定結(jié)果

液氮凍融-CTAB法提取的乳酸菌基因組DNA大小在23 Kb左右，濃度和純度均滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。采用引物FA-27F和FR-1495R對(duì)乳酸菌分離株16S rRNA基因進(jìn)行了擴(kuò)增。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，可以觀察到在1500 bp的位置處有一條清晰明亮的條帶，無(wú)彌散和非特異擴(kuò)增現(xiàn)象，如圖1所示。

圖1 16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

將拼接完成的16S rRNA基因序列通過(guò)BLAST與數(shù)據(jù)庫(kù)中的菌株進(jìn)行同源性比較，如果同源性大于99%則可將其直接鑒定到種的水平。從每個(gè)種中挑取一株有代表性菌株的16S rRNA基因序列與模式菌株的序列利用軟件Mega 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，Bacillus subtilis NCDO 1769作為外源菌種，Bootstrap值設(shè)定為1000。10株乳酸菌16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖2。

圖2 10株乳酸菌代表菌株和模式菌株的16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

從圖中可以看出，菌株IMAU90217和IMAU90063分別與Lactobacillus brevis ATCC14869、Lb.plantarum ATCC 14917的距離最近，且同源性達(dá)到99%以上，故被鑒定為L(zhǎng).brevis和L.plantarum。菌株IMAU90078與Lb.paracasei ATCC25302的親緣關(guān)系最近，而且它們的同源性為100%，因此可將其歸為L(zhǎng)b.paracasei。菌株IMAU90064和IMAU90219分別與乳球菌屬的模式株Lactococcus lactis subsp.lactis ATCC 19435和Lac.lactis subsp.cremoris ATCC 19257親緣關(guān)系最近，同源性分別為100%，故將它們分別鑒定為L(zhǎng)ac.lactis subsp.lactis和Lac.lactis subsp.cremoris。在鏈球菌屬這一分支上，IMAU90031與Streptococcus hermophilus ATCC19258聚為一類(lèi)，且其同源性均為99%以上，故鑒定為Streptococcus thermophilus。菌株IMAU90003、IMAU90002、IMAU90232和IMAU90153分別與明串株菌屬中的模式株Leuconostoc citreum ATCC 49370、Leu. lactis ATCC19256、Leu. pseudomesenteroides ATCC12291和Leu.mesenteroides ATCC8293的親緣關(guān)系最近，且它們之間的同源性均大于99%，可判定其分別為L(zhǎng)eu.citreum、Leu.lactis、Leu.pseudomesenteroides和Leu.mesenteroides。

通過(guò)分離株的16S rRNA基因同源性比較及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，結(jié)果表明，分離自俄羅斯卡爾梅克共和國(guó)的酸奶油中的28株乳酸菌鑒定為4個(gè)屬（Lactobacillus，Lactococcus，Leuconostoc和 Streptococcus）中的 10 個(gè)種，包括Lb.brevis（1株）、Lb.paracasei（1株）、Lb.plantarum（5株）、Lac.lactis subsp.lactis（2株）、Lac.lactis subsp.cremoris（5株）、Leu.citreum（1株）、Leu.lactis（3株）、Leu.mesenteroides（5株）、Leu.pseudomesenteroides（4 株）和S.thermophilus（1株）。具體鑒定結(jié)果和16S rRNA基因序列登錄號(hào)見(jiàn)表2。

3 討論

由于傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品具有諸多益生保健功能，使得越來(lái)越多的研究學(xué)者致力于傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中乳酸菌菌群結(jié)構(gòu)的研究。本研究中通過(guò)對(duì)俄羅斯卡爾梅克地區(qū)的酸奶油中乳酸菌的活菌計(jì)數(shù)和分離鑒定，證實(shí)了其中蘊(yùn)含著豐富的乳酸菌資源，且種類(lèi)較多。其中明串菌屬（Leuconostoc）是俄羅斯卡爾梅克地區(qū)的酸奶油中優(yōu)勢(shì)乳酸菌菌屬，占總分離菌數(shù)的50%。此外，Lb.plantarum和Lac.lactis subsp.lactis的分離株也較多。2009年，Idoui[9]等從阿爾及利亞?wèn)|部地區(qū)的傳統(tǒng)奶油中分離出26株乳酸菌，它們被鑒定為三個(gè)屬Lactococcus，Leuconostoc和 Lactobacillus，其中 Lactococcus lactis subsp.diacetylactis是奶油中的優(yōu)勢(shì)菌群。2006年，Mourad[10]對(duì)阿爾及利亞撒哈拉地區(qū)的20份傳統(tǒng)奶油（shmen）進(jìn)行微生物構(gòu)成研究，結(jié)果表明分離出的181株乳酸菌鑒定為L(zhǎng)actobacillus plantarum（40株），Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus（35株），Lactococcus lactis subsp.lactis（22 株），Lactococcus lactis subsp.cremoris（18株）和Lactobacillus paracasei（10株）。通過(guò)與其它地區(qū)傳統(tǒng)奶油中乳酸菌的研究相比，俄羅斯卡爾梅克地區(qū)的酸奶油中的乳酸菌的種類(lèi)和比例具有明顯的地域特點(diǎn)，我們推斷這可能與酸奶油的制作工藝、產(chǎn)地的環(huán)境氣候等因素有關(guān)。

表2 酸奶油中乳酸菌的種類(lèi)及16SrRNA基因序列登錄號(hào)

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